一种提高水稻光合效率和产量的方法

1.本发明涉及提高植物产量的技术领域，特别涉及一种提高水稻光合效率和产量的方法。


背景技术：

2.随着科学技术的不断发展，人类的生活水平不断提高。但伴随着人口的不断增长，环境条件的日益严峻，粮食安全问题仍然突出。水稻作为世界上三大粮食作物之一，是解决粮食缺口的核心要素之一。因此增加水稻产量，对于确保粮食安全至关重要。提高水稻产量的途径有多种，而挖掘产量性状相关优势基因来提高水稻单产是其中一个重要途径。
3.因此，有必要开发一种新的提高水稻光合效率和产量的方法。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种提高水稻光合效率和产量的方法，本技术成功克隆了一个新的高产、高光效基因hpy1(high photosynthesis and yield 1)，该基因参与调控水稻光合效率及生物量，从而增加水稻的产量，可广泛应用于高产水稻新品种的培育。通过提高hpy1的表达量可以提高水稻的光合效率、生物量及产量。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.在本发明的第一方面，提供了一种提高水稻光合效率和产量的方法，所述方法包括：
7.将hpy1基因在水稻体内过表达，其中，所述hpy1基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.进一步地，所述将hpy1基因在水稻体内过表达，包括：
9.将hpy1基因插入到基础载体中，构建含有hpy1的重组载体；
10.将含有hpy1的重组载体转化到作物组织或细胞中。
11.进一步地，所述基础载体包括作物改造载体，所述作物改造载体包括双元农杆菌载体和可用于作物微弹轰击的载体中的一种，所述双元农杆菌载体包括pcambia1301、pcambia2301和ph7wg2d中的一种。
12.进一步地，所述转化方法包括显微注射、农杆菌街道的遗传转化、通过ti质粒、ri质粒或病毒载体中的一种。
13.进一步地，所述将hpy1基因在水稻体内过表达，具体包括：
14.获得核苷酸序列如seq id no.2所示的基因片段；
15.将所述基因片段通过重组反应插入含有强启动子的表达载体pcambia1301-35sn中，利用所述表达载体上的标记基因筛选阳性克隆，获得重组表达载体hpy1-oe；
16.将所述重组表达载体hpy1-oe转入eha105农杆菌中，利用表达载体及所述农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株；
17.将所述阳性农杆菌菌株侵染水稻黄华占愈伤组织，在潮霉素的筛选培养基上暗培
养，获得阳性转基因愈伤组织；
18.将所述阳性愈伤组织进行分化、生根、移栽培养获得t0代转基因植株；
19.通过常规的分子标记检测以及水稻栽培方法获得水稻光合效率和产量提高的t1代植株。
20.在本发明的第二方面，提供了一种高产、高光效基因hpy1，所述高产、高光效基因hpy1具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。
21.在本发明的第三方面，提供了一种hpy1蛋白，所述hpy1蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示。
22.在本发明的第四方面，提供了一种包含所述的高产、高光效基因hpy1的重组载体。
23.进一步地，所述重组载体包括重组表达载体hpy1-oe。
24.在本发明的第五方面，提供了一种包含所述重组载体的转化体、转基因系。
25.在本发明的第六方面，提供了所述的高产、高光效基因hpy1、所述的重组载体和所述的转化体、转基因系在提高水稻光合效率和产量的培育上的应用。
26.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
27.本发明提供一种提高水稻光合效率和产量的方法，通过过量表达hpy1的方法来调控水稻光合效率及生物量，说明该基因可作为提高水稻光合效率及生物量的标记应用于水稻高产高光效农作物育种当中。因此hpy1基因为利用分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育水稻高产、高光效新品种，提供了强有力的手段和工具，具有巨大的应用潜力。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
29.图1是hpy1基因结构图，含有hth-3类型dna结合结构域；
30.图2是hpy1基因在过表达水稻材料中的模型结构；
31.图3是hpy1过表达材料在孕穗期的光合效率表现；其中a为hpy1过表达材料的rubisco酶活性表现，b为hpy1过表达材料的净光合速率表现；
32.图4是hpy1过表达材料在成熟期的籽粒及产量表现；其中a为hpy1过表达材料的植株和产量示图，b为hpy1过表达材料的生物量表现，c为hpy1过表达材料的净光合速率表现，d为hpy1过表达材料的单株产量表现，e为hpy1过表达材料日产量表现。
具体实施方式
33.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
34.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
35.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
36.下述实例中的水稻按照正常的管理方法培养：首先新鲜的水稻种子需要浸种催芽，种子露白后可在准备好的秧田里播种，秧苗4叶一心期可移栽到大田。
37.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
38.本实验室前期对9311进行辐射诱变得到一个茎秆粗壮、高光效、高生物量的突变体材料m50。该材料籽粒变化非常明显，利用高光效品种黄华占杂交、回交构建近等基因系，相比于黄华占，近等基因系光合效率提高了32.7％，生物量增加了41.4％，产量增加了20.3％。为了克隆这一高产高光效基因，我们将m50与黄华占进行杂交，构建定位群体，利用单株干重为性状，我们成功克隆了一个新的高产、高光效基因hpy1(high photosynthesis and yield1)，该基因参与调控水稻光合效率及生物量，从而增加水稻的产量，可广泛应用于高产水稻新品种的培育。利用水稻突变体材料m50的cdna为模板，以seq id no.5-6所示的引物进行pcr扩增，获得核苷酸序列如seq id no.2所示基因片段；在其他实施方式中，可以直接合成核苷酸序列如seq id no.2所示基因片段即可，无需以水稻突变体材料m50的cdna为模板。
39.本发明通过在水稻体内差异表达hpy1基因发现：在水稻优异品种黄华占体内过表达hpy1后，其孕穗期光合效率显著高于黄华占，表明hpy1与水稻光合作用密切相关；其成熟期生物量明显大于黄华占，表明hpy1与水稻生物量也密切相关；提高hpy1的表达量可以提高水稻的产量。hpy1的功能结构域在其他重要粮食作物(小麦、玉米等)中高度保守，表明该基因对其他作物产量调控方面可能有着类似的分子机制。因此hpy1也可以尝试应用于其他农作物的产量提升。
40.因此，根据本发明一种典型的实施方式，提供一种高产、高光效基因hpy1，所述高产、高光效基因hpy1具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。
41.所述高产、高光效基因hpy1具有如下特征：
42.(1)其核苷酸序列为seq id no.1所示基因组碱基序列
43.(2)其核苷酸序列为seq id no.2所示转录序列；
44.seq id no.1所示核苷酸序列由1912个碱基组成，其中包含外显子、内含子和3’utr。
45.seq id no.3所示核苷酸序列为cdna编码序列。
46.根据本发明另一种典型的实施方式，提供一种hpy1蛋白，参与水稻光合效率及生物量调控的蛋白质，为了使hpy1蛋白质便于研究和利用，可在该蛋白序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。所述hpy1蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。
47.表1-标签及其氨基酸序列
48.标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagⅱ8wshpqfekc-myc10eqkliseedl
49.hpy1为能够显著增加水稻光合效率及生物量的基因，从而增加水稻产量，在水稻高产、高光效品种的培育上具有重要意义。
50.根据本发明又一典型的实施方式，提供一种提高水稻光合效率和产量的方法，所述方法包括：
51.将hpy1基因在水稻体内过表达，其中，所述hpy1基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
52.上述技术方案中，所述将hpy1基因在水稻体内过表达，包括：
53.将hpy1基因插入到基础载体中，构建含有hpy1的重组载体；
54.将含有hpy1的重组载体转化到作物组织或细胞中。
55.所述基础载体包括作物改造载体，所述作物改造载体包括双元农杆菌载体和可用于作物微弹轰击的载体中的一种，所述双元农杆菌载体包括pcambia1301、pcambia2301和ph7wg2d中的一种；所述转化方法包括显微注射、农杆菌街道的遗传转化、通过ti质粒、ri质粒或病毒载体中的一种。
56.为了达到利用hpy1基因改造农作物产量的目的，在构建载体时可以在基因起始位点前添加任何一种有助于改变hpy1基因表达的启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素(ubiquitin)基因启动子(pubi)等，此外还可以通过添加增强子的方式达到差异表达的目的。无论采用何种方式必须保证编码序列的正确性从而获得正确的hpy1蛋白结构。
57.可采用那些含有标记基因如：gus基因、gfp基因，抗潮霉素基因、抗除草剂基因等的载体构建重组载体，这样更有利于实验操作以及后期的作物筛选及选择。
58.作为一种具体的实施方式，所述将hpy1基因在水稻体内过表达，具体包括：
59.获得核苷酸序列如seq id no.2所示的基因片段；具体可直接合成核苷酸序列如seq id no.2所示基因片段；
60.将所述基因片段通过重组反应插入含有强启动子的表达载体pcambia1301-35sn中，利用所述表达载体上的标记基因筛选阳性克隆，获得重组表达载体hpy1-oe；
61.将所述重组表达载体hpy1-oe转入eha105农杆菌中，利用表达载体及所述农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株；
62.将所述阳性农杆菌菌株侵染水稻黄华占愈伤组织，在潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤组织；
63.将所述阳性愈伤组织进行分化、生根、移栽培养获得t0代转基因植株；
64.通过常规的分子标记检测以及水稻栽培方法获得水稻光合效率和产量提高的t1代植株。
65.所述的高产、高光效基因hpy1、所述的重组载体和所述的转化体、转基因系均可在提高水稻光合效率和产量的培育上进行应用。
66.下面将结合实施例及实验数据对本技术的一种提高水稻光合效率和产量的方法进行详细说明。
67.实施例1
68.1、hpy1基因全长片段的获得
69.利用水稻cdna为模板，设计引物对hpy1-f/r并在各自5’端添加相应的重组序列，引物序列见表2，进行pcr扩增，对产物进行测序分析，扩增得到的基因片段核苷酸序列如
seq id no.2所示。在其他实施方式中，可直接合成核苷酸序列如seq id no.2所示的基因片段。
70.表2-引物序列
[0071][0072]
2、hpy1基因过表达载体的构建
[0073]
将核苷酸序列如seq id no.2所示的基因片段通过重组反应插入含有强启动子的表达载体pcambia1301-35sn(可购买自淼灵质粒平台，货号p0380)中，利用载体上的标记基因筛选阳性克隆，得到重组表达载体hpy1-oe。
[0074]
3、hpy1基因过表达转基因植株的获得
[0075]
构建好的hpy1-oe载体可以通过电转或热激的方法转入eha105农杆菌(agrobacterium tumefaciens)中，利用载体及农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株。
[0076]
用含有重组质粒hpy1-oe的重组农杆菌菌株侵染水稻黄华占愈伤组织，在含50mg/l潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤组织。将阳性愈伤分化、生根、移栽获得t0代转基因植株。通过常规的分子标记检测以及水稻栽培方法获得t1代植株。
[0077]
4、hpy1基因过表达植株的产量检测
[0078]
(1)通过qrt-pcr检测hpy1基因的表达量：
[0079]
35s启动子作为植物强启动子，可以提升目的基因在植物体内的表达含量。利用常规的rna提取方法获得hpy1过表达植株及野生型植株的总rna,并利用反转录试剂盒(购自invitrogen公司)获得相应的cdna。利用引物hpy1-rt-f/r引物对进行qrt-pcr检测hpy1的表达水平；利用引物actin-rt-f/r的pcr产物作为内参；上述引物序列见表3。
[0080]
表3-引物序列
[0081]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)hpy1-rt-fggagggaagggagaagaaagt(seq id no.7)hpy1-rt-rgccgccatacttgacgatc(seq id no.8)actin-rt-fggaagtacagtgtctggattggag(seq id no.9)actin-rt-rtcttggcttagcattcttgggt(seq id no.10)
[0082]
(2)转基因植株的光合效率、生物量及单株产量统计：
[0083]
通过常规方法对过表达转基因材料及野生型黄华占的种子进行浸种、催芽、移栽。在苗期及孕穗期分别对过表达转基因材料和野生型材料(hhz)进行光合效率测定。当材料穗部发育成熟后，分别将材料进行收种。然后对过表达转基因材料和野生型材料进行考种，统计其生物量、千粒重、结实率及单株产量。
[0084]
hpy1过表达材料在孕穗期的光合效率表现如图3所示，表明hpy1显著提高rubisco酶活性进而提高光合效率。
[0085]
hpy1过表达材料在成熟期的籽粒及产量表现如图4所示，表明hpy1通过提高光合效率来提高生物量，进而提高水稻产量。
[0086]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0087]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0088]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。