一株芽孢杆菌及其在防治植物病害中的应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其在防治植物病害中的应用。


背景技术：

2.化学防治是人类使用的历史最悠久的防治方法，但化学农药和化肥的大量使用导致了环境污染、土壤板结、水体污染，大量有益微生物被农药杀灭、而病原菌易产生抗药性等环境问题逐渐突出，而且，化学农药残留威胁食品安全。生物防治作为近年来兴起的一种环保的替代方法，使用能够促进作物生长发育的促生菌或者抑制病原体种群的yjd-sf1菌剂，有效提升农作物产量或者治理植物病害。有些植物根际微生物可能同时具备yjd-sf1菌剂和促生菌的特性，可以作为更为有效的防治植物病原真菌、提高植物产量的工具。目前，yjd-sf1菌剂的抑菌机制包括产生水解酶、氢氰酸、脂肽、蛋白水解酶等抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物产生系统抗性，另外某些yjd-sf1菌剂还能与病原菌通过竞争抑制病原菌生长，根际促生菌通过分泌生长素、铁载体、acc脱氨酶、有机酸等物质，具有固氮、溶磷等能力促进植物生长发育和土壤中营养物质的吸收。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是：如何使用生防菌促进植物的生长和抗逆性，实现生物防治植物病害。
4.为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌(bacillus sp.)，其菌株编号为yjd-sf1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.24120。
5.为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供菌剂，所述菌剂含有上述的芽孢杆菌和/或含有上述芽孢杆菌的培养物。
6.上述菌剂的活性成分可为上述芽孢杆菌或/和上述芽孢杆菌的培养物(如发酵产物)，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
7.术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质，发酵产物)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。
8.本发明中，yjd-sf1菌剂的制备方法可包括：挑取tsb固体培养基培养三天的单菌落接种于100ml tsb液体培养基中，28℃、140r/min培养48h，得到od600值约为1.0的菌液(2
×
108·
cfu/ml)。
9.为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供如下a1)-a12)中的任一种应用：
10.a1)、上述的芽孢杆菌在制备促进植物生长的产品中的应用；
11.a2)、上述的芽孢杆菌或上述的菌剂在促进植物生长中的应用；
12.a3)、上述的芽孢杆菌在制备植物病原菌抑制剂中的应用；
13.a4)、上述的芽孢杆菌或上述的菌剂在抑制植物病原菌中的应用；
14.a5)、上述的芽孢杆菌在制备预防和/或治疗植物病害的产品中的应用；
15.a6)、上述的芽孢杆菌或上述的菌剂在预防和/或治疗植物病害中的应用；
16.a7)、上述的芽孢杆菌在制备提高植物抗逆性的产品中的应用；
17.a8)、上述的芽孢杆菌或上述的菌剂在提高植物抗逆性中的应用；
18.a9)、上述的芽孢杆菌或上述的菌剂在制备蛋白酶中的应用；
19.a10)、上述的芽孢杆菌或上述的菌剂在制备淀粉酶中的应用；
20.a11)、上述的芽孢杆菌或上述的菌剂在制备acc脱氨酶中的应用；
21.a12)、上述的芽孢杆菌或上述的菌剂在制备吲哚乙酸中的应用。
22.进一步地，a1)和a2)所述的促进植物生长，可为促进植物根的生长。
23.进一步地，a7)和a8)所述的提高植物抗逆性，可为提高植物的耐盐碱能力。
24.进一步地，上述的应用中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。
25.进一步地，上述的应用中，所述双子叶植物可为下述a1)、a2)或a3)：
26.a1)、十字花科；
27.a2)、拟南芥属；
28.a3)、拟南芥；
29.所述单子叶植物可为下述b1)、b2)或b3)：
30.b1)、禾本科；
31.b2)、稻属；
32.b3)、水稻。
33.所述水稻可为日本晴。
34.进一步地，上述的应用中，a3)或a4)所述病原菌可为真菌；
35.所述真菌可为水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、大豆疫霉病菌(phytophthora sojae)、细极链格孢菌(alternaria tenuissima)中的至少一种。
36.为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供提高植物抗逆性或/和促进植物生长的方法，所述方法包括在微生物培养基中培养上述的芽孢杆菌，收集培养物(发酵产物)，用所述培养物处理植物或植物的培养基质。
37.上述方法中，所述用培养物处理植物或植物的培养基质可为将菌株yjd-sf1的培养物添加到植物的培养基质中。
38.上述方法中所述的提高植物抗逆性，可为提高植物的耐盐碱能力。
39.进一步地，上述的方法中，所述植物为双子叶植物，所述双子叶植物为下述a1)、a2)或a3)：
40.a1)、十字花科；
41.a2)、拟南芥属；
42.a3)、拟南芥。
43.为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供预防和/或治疗植物病害的方法，所述方法包括在微生物培养基中培养上述的芽孢杆菌，收集培养物(发酵产物)，用所述培
养物处理植物。
44.进一步地，上述的方法中，所述植物病害可为水稻纹枯病-立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、大豆疫霉病菌(phytophthora sojae)、细极链格孢菌(alternaria tenuissima)引起的病害。
45.进一步地，上述方法中，所述植物科为单子叶植物，所述单子叶植物可为下述b1)、b2)或b3)：
46.b1)、禾本科；
47.b2)、稻属；
48.b3)、水稻。
49.本发明取得的有益技术效果如下：
50.1、本发明的芽孢杆菌yjd-sf1具有稳定、高效、广谱的抗菌性能，对细极链格孢菌、大豆疫霉病菌和立枯丝核菌三种植物病原菌具有抑制作用。芽孢杆菌yjd-sf1对细极链格孢菌的抑制率达55.23％,对大豆疫霉病菌的抑制率达74.52％，对立枯丝核菌的抑制率达51.28％。
51.2、芽孢杆菌yjd-sf1能够产生蛋白水解酶、脂肪酶、磷酸酶、淀粉酶和挥发性抑菌物质，抑制病原菌菌丝的生长和孢子萌发。
52.3、芽孢杆菌yjd-sf1能够提高拟南芥在盐碱胁迫下的抗性，促进拟南芥在盐碱胁迫下主根的生长。
53.4、芽孢杆菌yjd-sf1能产生植物生长素(吲哚乙酸或iaa)、acc脱氨酶促进植物生长，提高植物生物量。
54.保藏说明
55.菌种名称：芽孢杆菌；
56.拉丁名：bacillus sp.；
57.菌株编号：yjd-sf1；
58.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
59.保藏机构简称：cgmcc；
60.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
61.保藏日期：2021年12月17日；
62.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.24120。
附图说明
63.图1为芽孢杆菌yjd-sf1的菌体形态。
64.图2为芽孢杆菌yjd-sf1的系统发育树。
65.图3为不同ph条件下芽孢杆菌yjd-sf1的生长曲线。
66.图4为不同氯化钠浓度下芽孢杆菌yjd-sf1的生长曲线。
67.图5为不同碳酸氢钠浓度下芽孢杆菌yjd-sf1的生长曲线。
68.图6为芽孢杆菌yjd-sf1产氢能力检测。
69.图7为芽孢杆菌yjd-sf1的抑菌谱。
70.图8为芽孢杆菌yjd-sf1离体叶片实验的结果。
71.图9为芽孢杆菌yjd-sf1在盐碱条件下的促生作用。
72.图10为芽孢杆菌yjd-sf1能产生蛋白酶的检测。
73.图11为芽孢杆菌yjd-sf1能产生淀粉酶的检测。
74.图12为芽孢杆菌yjd-sf1能产生iaa的检测。
75.图13为芽孢杆菌yjd-sf1能产生acc脱氨酶的检测。
76.图14为芽孢杆菌yjd-sf1产生抑制性挥发物质的检测。
77.图15为芽孢杆菌yjd-sf1具有固氮能力的检测。
78.图16为芽孢杆菌yjd-sf1不具有溶磷能力的检测。
79.图17为芽孢杆菌yjd-sf1不具有产生脂肪酶能力的检测。
80.图18为芽孢杆菌yjd-sf1不具有产生磷酸酶能力的检测。
81.图19为芽孢杆菌yjd-sf1不具有产生铁载体能力的检测。
具体实施方式
82.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
83.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
84.pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌15min。
85.lb液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl 10g，用蒸馏水定容至1000ml，调节ph至7.0-7.2，121℃灭菌15min。
86.lb固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl 10g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000ml，调节ph至7.0-7.2，121℃灭菌15min。
87.水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(rhizoctonia solani)由中国科学院分子植物科学卓越创新中心何祖华团队提供，在文献“dongdong niu,xin zhang,xiaoou song,zhihui wang,yanqiang li,lulu qiao,zhaoyun wang,junzhong liu,yiwen deng,zuhua he,donglei yang,renyi liu,yanli wang,hongwei zhao.deep sequencing uncovers rice long sirnas and its involvement in immunity against rhizoctonia solani.phytopathology.2017-09-07,doi:10.1094/phyto-03-17-0119-r”中公开(菌株号为ag1-ia，下述实施例中简称为立枯丝核菌)，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
88.大豆疫霉病菌(phytophthora sojae)由东北地理与农业生态研究所冯献忠实验室提供，在文献“dongmei wang,xiangxiu liang,yazhou bao,suxin yang,xiong zhang,hui yu,qian zhang,guangyuan xu,xianzhong feng,daolong dou.a malectin-like receptor kinase regulates cell death and pattern-triggered immunity in soybean.embo reports.2020-09-14.doi:10.15252/embr.202050442”中公开(菌株号为xeg1，下述实施例中简称为立枯丝核菌)，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生
物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
89.下述实施例中的细极链格孢菌由本实验室保存，其菌株编号为cbs 118809_2，细极链格孢菌cbs 118809_2的5.8s序列在ncbi中genbank编号为on231780.1(2022-04-19)，下述实施例中简称为细极链格孢菌或者链格孢菌，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
90.下述实施例采用graphpad prism 7统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用t tests检验，***表示具有极显著性差异(p＜0.001)。
91.实施例1、芽孢杆菌(bacillus sp.)yjd-sf1的分离、鉴定与保藏
92.1.1、细菌yjd-sf1的分离
93.1.1.1、在45ml无菌蒸馏水中加入5g土壤样品(采自黑龙江省绥化市安达市经济技术开发区安发大道6号附近，盐碱地植物根际土壤)，搅拌15min，静止放置10min，然后取上清液1ml，加入盛有9ml无菌水中的无菌试管中充分混匀(此时稀释度记为10-1
)，然后从此试管中吸取1ml加入到另一盛有9ml无菌水的无菌试管中混合均匀，以此类推制成10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
不同稀释度的菌悬液。将各稀释度取0.1ml均匀涂布在lb固体培养基上，30℃恒温静置培养2-3d。
94.1.1.2、完成步骤1.1.1后，挑取lb固体培养基上的单菌落，反复纯化3次以上直到出现的都是同样形态特征的菌落。
95.1.1.3、将筛选到的一株细菌命名为yjd-sf1。
96.1.2、细菌yjd-sf1的鉴定
97.1.2.1、形态学鉴定
98.(1)将细菌yjd-sf1接种至lb固体培养基上，30℃培养3天后观察单菌落形态；菌落表面略粗糙，乳白色。
99.(2)细菌yjd-sf1经染色后，鉴定为革兰氏阳性菌；
100.(3)采用光学显微镜观察细菌yjd-sf1的形态。yjd-sf1呈杆状，长度在2-4μm之间，无纤毛或者鞭毛(图1)。
101.1.2.2、16s rdna序列同源性分析
102.细菌yjd-sf1的16s rdna如seq id no.1所示。
103.利用clustal x软件将seq id no.1所示的双链dna分子和genbank中的序列进行比对。结果表明，细菌yjd-sf1与uncultured bacillus sp.clone soil bacteria q9的同源性最高，达到99.93％。
104.构建系统发育树发现，芽孢杆菌yjd-sf1与uncultured bacillus sp.clone soil bacteria q9的亲缘性最高(图2)。
105.1.2.3、生理生化实验
106.1.2.3.1、芽孢杆菌yjd-sf1的ph生长特性
107.配置液体lb，并调节液体lb的ph为5、6、7、8、9、10。每个ph梯度需要液体lb 10ml，将100μl的od600＝1.0的菌剂加入到10ml lb液体中后置于37℃130rpm的摇床中培养，每隔2h测量一次od600。
108.实验结果如图3，结果表明，芽孢杆菌yjd-sf1在ph＝5-9的条件下能够正常生长，在ph＝10的条件下无法生长，且最适的生长ph为6-7之间，生长达到12-16h时达到最大值。
yjd-sf1的生长ph范围很广。
109.1.2.3.2、芽孢杆菌yjd-sf1在不同氯化钠浓度下的生长
110.配置液体lb，并向液体lb添加0.4m/l、0.8m/l、1.2m/l、1.6m/l、2.0m/l的氯化钠，每种处理需要液体lb 10ml，将100μl的od600＝1.0的菌剂加入到10ml液体lb中后置于37℃130rpm的摇床中培养。每隔2h测量一次od600。
111.实验结果如图4，结果表明，芽孢杆菌在氯化钠浓度为1.6m/l、2.0m/l的条件下无法生长，在浓度为0-1.2m/l的条件下能够生长，说明yjd-sf1具有耐盐的能力。
112.1.2.3.3、芽孢杆菌yjd-sf1在不同碳酸氢钠浓度下的生长
113.配置液体lb，并向液体lb中加入5mm/l、10mm/l、15mm/l、20mm/l的碳酸氢钠，每种处理需要液体lb 10ml，将100μl的od600＝1.0的菌剂加入到10ml液体lb中后置于37℃130rpm的摇床中培养。每隔2h测量一次od600。
114.实验结果如图5，结果表明，芽孢杆菌yjd-sf1在每个碳酸氢钠浓度下都能生长，说明yjd-sf1具有良好的耐碱能力。
115.1.2.3.4、芽孢杆菌yjd-sf1分泌氢离子的能力检测
116.配置200ml的液体lb，加入10ml的od600＝1.0的菌剂(接种量为5％)，置于37℃130rpm的摇床中培养。每隔2h取2ml的液体，离心后测量ph。
117.实验结果如图6，结果表明：从加入菌剂开始，溶液的ph逐渐下降，在4h左右降至最低而后ph逐渐上升。说明yjd-sf1具有产生氢离子的能力。
118.根据上述形态学、生理生化特性和16s rdna序列同源性分析结果，将1.1分离纯化得到的细菌yjd-sf1鉴定为芽孢杆菌(bacillus sp.)。
119.菌种保存：将芽孢杆菌(bacillus spp.)yjd-sf1的单菌落接种至lb液体培养基，30℃培养16h，得到培养菌液。将1体积份培养菌液和1体积份80％(v/v)甘油水溶液混匀，-80℃保存。
120.芽孢杆菌(bacillus sp.)yjd-sf1已于2021年12月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.24120。以下简称芽孢杆菌yjd-sf1。
121.实施例2、yjd-sf1菌剂的制备
122.挑取tsb固体培养基培养三天的单菌落接种于100ml tsb液体培养基中，28℃、140r/min培养48h，得到od600值约为1.0的菌液(2
×
10
8.
cfu/ml)。
123.该菌液即为制备的yjd-sf1菌剂。
124.其中tsb配方及配置方法为：酪蛋白胰酶消化物17.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物3.0g，磷酸氢二钾2.5g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.5g，蒸馏水定容至1000ml，ph调至7.3，121℃灭菌15min。
125.实施例3、芽孢杆菌yjd-sf1抑菌广谱性的测定
126.3.1、供试病原菌：
127.水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、大豆疫霉病菌(phytophthora sojae)、细极链格孢菌(alternaria tenuissima)
128.3.2、采用平板对峙培养法对上述供试植物病原菌分别进行抑菌实验
129.具体操作如下：将芽孢杆菌yjd-sf1在lb固体培养基上28℃恒温培养48h。上述供试植物病原菌分别在pda平板上25℃-28℃恒温培养3-4天，自菌落边缘用直径0.6cm的无菌不锈钢打孔器制成病原菌琼脂片；用无菌镊子挑取病原菌菌片，菌丝面朝下接种于pda平板中心处，同时在距病原菌菌片两侧均约2.50cm处用无菌接种环划线芽孢杆菌yjd-sf1(实验组)，以仅接病原菌的平板为对照(对照组)，每个处理三次重复，25℃-28℃恒温培养7天，测量病原菌的直径，并计算抑制率。
[0130][0131]
实验结果如图7所示，结果表明：在第7天的时候，仅接种细极链格孢菌、立枯丝核菌和大豆疫霉病菌的平板上菌丝直径分别为5.45cm、7.15cm和7.85cm，与芽孢杆菌yjd-sf1对峙培养的细极链格孢菌、立枯丝核菌和大豆疫霉病菌的菌丝直径分别为2.44cm、3.48cm和2.00cm，抑制率分别为55.23％、51.28％和74.52％。
[0132]
三次重复该试验均得到同样的稳定抑菌效果，因此表明芽孢杆菌yjd-sf1对细极链格孢菌、水稻纹枯、大豆疫霉病菌具有稳定、高效广谱抗菌性能。
[0133]
实施例4、芽孢杆菌yjd-sf1的叶片离体培养实验检测生防效果
[0134]
4.1、实验材料
[0135]
日本晴水稻叶片、立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、细极链格孢菌(alternaria tenuissima)、yjd-sf1菌剂。
[0136]
立枯丝核菌(rhizoctonia solani)和细极链格孢菌(alternaria tenuissima)分别在pda平板上25℃-28℃恒温培养3-4天，自菌落边缘用直径0.6cm的无菌不锈钢打孔器制成病原菌琼脂片，备用。
[0137]
水琼脂培养基(称取20g琼脂于1l蒸馏水中，灭菌后倒板，常温凝固)。
[0138]
4.2、叶片离体培养流程
[0139]
采集生长良好且状态一致的水稻叶片，将叶片用蒸馏水清洗2-3次，晾干水分后，放入75％酒精1分钟进行消毒，晾干后，空白对照叶片(无病原菌和yjd-sf1菌剂处理)浸泡在lb液体中10min；对照叶片(仅病原菌处理)用lb液体浸泡10min后向叶片中心放一块病原菌琼脂片；实验组叶片(yjd-sf1菌剂处理 病原菌处理)分别经过od600＝0.5、0.7、1.0的yjd-sf1菌剂菌剂浸泡10min后在向叶片中心接病原菌琼脂片。将处理后的叶片放置在水琼脂培养基上光照培养3-4天。利用imagej软件对病斑面积进行测量，根据病斑面积计算防治效果。
[0140]
计算公式如下：
[0141][0142]
结果如图8所示，对细极链格孢菌的防治效果：yjd-sf1菌剂od600＝0.5为43.42％，yjd-sf1菌剂od600＝0.7为32.31％。对于立枯丝核菌的防治效果：yjd-sf1菌剂od600＝0.7为63.39％，yjd-sf1菌剂od600＝1.0为55.84％。从叶片离体的实验效果来看，yjd-sf1菌剂对病原菌起到了良好的抑制作用。
[0143]
实验例5、芽孢杆菌yjd-sf1提高拟南芥盐碱胁迫抗性的检测。
[0144]
5.1、培养基的制备
[0145]
碱固体培养基：称取4.4gms粉末，20g蔗糖，蒸馏水定容至1l后，调节ph值至8.0，再加入12g琼脂后，121℃15min灭菌；待培养基冷却至55℃时加入nahco3至终浓度为1.5mm，将约55℃的培养基倒入培养皿(每个培养皿25ml)，常温冷却。
[0146]
碱 菌固体培养基：取装有碱固体培养基的培养皿，在培养基下方四分之一以下的部位划一条yjd-sf1菌线。
[0147]
灭菌的拟南芥种子：取拟南芥(野生型拟南芥columbia-0亚型，简称col-0)种子，用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌10min，然后用灭菌水清洗三次备用。
[0148]
5.2、yjd-sf1菌剂提高拟南芥盐碱胁迫抗性的检测
[0149]
将灭菌的拟南芥种子播种于碱固体培养基(对照组)、碱 菌固体培养基(实验组)，对照组和实验组各3个培养皿，每个培养皿播种5-17粒种子，三个重复。4℃春化三天。种子播种于固体培养基上方四分之一以上部分，不与菌剂直接接触(分析yjd-sf1菌剂分泌物对拟南芥根系生长的影响)。春化后光照竖直培养7天。观察拟南芥的生长状态。(本实验研究菌剂的分泌物对拟南芥根部生长的影响)。
[0150]
培养条件为：22℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000lx。
[0151]
拟南芥的生长状态见图9。
[0152]
培养7天后统计拟南芥幼苗的主根长，统计结果见表1。
[0153]
表1、拟南芥主根长统计
[0154]
固体培养基的类型平均主根长(cm)差异显著性碱固体培养基0.20***碱 菌剂固体培养基2.39***
[0155]
结果如图9所示，结果表明：盐碱胁迫条件下，接种yjd-sf1的实验组拟南芥幼苗的平均主根长显著高于对照组。由此可见，芽孢杆菌yjd-sf1大幅度提高拟南芥盐碱胁迫抗性。
[0156]
实验例6、芽孢杆菌yjd-sf1产生蛋白酶能力的检测
[0157]
6.1、培养基配制
[0158]
脱脂奶粉培养基：称取脱脂奶粉15.0g，琼脂15.0g，纯水定容至1.0l，121℃灭菌15min。
[0159]
6.2、实验过程及结果
[0160]
将芽孢杆菌yjd-sf1接种到脱脂奶粉培养基上，28℃培养5-7天。若能产生明显的透明圈证明能够产生蛋白酶，且透明圈越大证明产蛋白酶的能力越强。
[0161]
结果如图10所示，芽孢杆菌yjd-sf1能够产生明显的透明圈，表明芽孢杆菌yjd-sf1能够具有较好的产生蛋白酶的能力。
[0162]
实验例7、芽孢杆菌yjd-sf1产生淀粉酶能力的检测
[0163]
7.1、培养基配制
[0164]
淀粉酶培养基：可溶性淀粉2.5g，蛋白胨5g，硫酸铵2.5g，磷酸二氢钾3g，六水氯化钙0.25g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1.0l，121℃灭菌15min。
[0165]
7.2、实验过程及结果
[0166]
将芽孢杆菌yjd-sf1接种到淀粉酶培养基上，三个重复，28℃培养3天。然后使用碘液进行染色后，观察是否出现透明圈。透明圈越大则证明产生淀粉酶的能力越强。
[0167]
结果如图11所示，图中所显示的产生了黄色的透明圈，表明芽孢杆菌yjd-sf1能够分泌淀粉酶。
[0168]
实验例8、芽孢杆菌yjd-sf1产生iaa(吲哚乙酸)能力的检测
[0169]
8.1、培养基配制
[0170]
salkowski溶液(250ml)：浓h2so
4 150ml，0.5m fecl
3 37.5ml，用蒸馏水定容至250ml，121℃灭菌15min。
[0171]
8.2、实验过程及结果
[0172]
将分离纯化出的芽孢杆菌yjd-sf1菌株接种于1ml含200mg/l的l-色氨酸(l-tryptophan)的lb液体培养基中，设置三个重复。在30℃，180r/min培养2天后取200μl菌悬液到96孔板上，加入800μl的salkowski显色液，并以加入200μl未接菌的lb液体培养基与800μl显色液为对照。室温避光放置20min后，颜色变红为阳性，表明能分泌iaa，颜色越深分泌能力越强。
[0173]
结果如图12所示，结果表明芽孢杆菌yjd-sf1使比色液变红，说明能产生iaa。
[0174]
左图为未添加菌剂的对照组，右图为加入yjd-sf1菌剂的实验组。
[0175]
图中右侧的实验组红色很浓，证明yjd-sf1菌剂具有较强的产生iaa能力。
[0176]
实验例9、芽孢杆菌yjd-sf1产生acc脱氨酶能力的检测。
[0177]
9.1、培养基配制
[0178]
df培养基(1l)：组分a 0.1ml，组分b 0.1ml，kh2po
4 4.0g，na2hpo
4 6.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，葡萄糖2.0g，50％d-葡糖酸溶液(上海源叶公司，货号是s11155)4ml，柠檬酸2.0g，(nh4)2so
4 2.0g，将所有组分配置好后用蒸馏水水定容至1l，调节ph7.0-7.2，121℃灭菌15min。
[0179]
组分a(100ml)：h3bo
3 10mg，mnso4·
h2o 11.19mg，znso4·
7h2o 124.6mg，cuso4·
5h2o 78.22mg，moo
3 10mg，用蒸馏水定容至100ml。
[0180]
组分b(10ml)：feso4·
7h2o 100mg，用蒸馏水定容至100ml。
[0181]
adf培养基(1l)：将df培养基中的(nh4)2so4替换成0.5m 1-氨基环丙烷基-1-羧酸(acc)，其余组分保持不变。
[0182]
9.2、实验过程及结果
[0183]
将芽孢杆菌yjd-sf1菌株，接种在df固体培养基(在上述df液体培养基组分基础上增加了10％琼脂)上，培养3-4d后将菌株转接到adf固体培养基(在上述ad f液体培养基组分基础上增加了10％琼脂)上，将平板放置28℃培养箱中倒置培养，并设置三次重复，观察菌株是否生长。
[0184]
高浓度的乙烯抑制植物生长。而如果微生物含有acc脱氨酶，可以抑制乙烯前体物质α-丁酮酸的产生，从而降低乙烯的生成，减少了其对植物生长的抑制作用，达到促进植物生长的目的。adf培养基中acc是氮素唯一来源，如果菌能够生长说明菌能够分泌acc脱氨酶，以利用acc作为氮源存活并增殖。
[0185]
结果如图13所示，结果表明，芽孢杆菌yjd-sf1在adf培养基上仍能生长，说明此yjd-sf1菌剂能够产生acc脱氨酶。图中左侧为df培养基，右侧为adf培养基。
[0186]
实验例10、芽孢杆菌yjd-sf1产生挥发性抑菌物质能力的检测
[0187]
采用平板倒扣法测定挥发性气体的抑菌活性，将直径0.6cm病原菌菌片放置在pda
培养基平板中央。另取lb培养基平板，取培养48h od600约为1.0的yjd-sf1菌剂100μl于平板上均匀涂布，然后将处理的pda和lb两平板对扣，带病原菌的pda培养基向下倒置，封口膜密封(实验组)。用100μl无菌水替代yjd-sf1菌剂作为对照组，各设三个重复。置于28℃培养7天。参考实验例2的公式计算抑制率。
[0188][0189]
结果如图14所示，图中a(对照组)、b(实验组)为芽孢杆菌yjd-sf1产生的挥发性物质对细极链格孢菌的抑制实验，与对照相比，实验组的菌丝直径显著减小，且菌丝表面产生了绿色的孢子，说明了较好的抑制作用，抑制率达到39.2％，
[0190]
c(对照组)、d(实验组)为芽孢杆菌yjd-sf1产生的挥发性物质对立枯丝核菌的抑制实验。结果表明：在培养第七天，芽孢杆菌yjd-sf1产生的挥发性物质对立枯丝核菌的在菌丝直径上虽然没有很大影响，但是实验组的立枯丝核菌菌丝变稀疏且厚度变薄。说明芽孢杆菌yjd-sf1对立枯丝核菌会产生一定的抑制效果。
[0191]
e(对照组)、f(实验组)为芽孢杆菌yjd-sf1产生的挥发性物质对大豆疫霉病菌的抑制实验。结果表明：在培养第七天，芽孢杆菌yjd-sf1产生的挥发性物质对菌丝直径虽然没有明显影响，但是实验组的大豆疫霉病菌的菌层厚度减小、菌丝分布变得稀疏，说明菌丝生长受到一定程度的抑制。
[0192]
实验例11、芽孢杆菌yjd-sf1固氮能力的检测
[0193]
氮(n)是植物生长和生产力最重要的养分。虽然大气中有大78％的氮气，但植物在生长时，却无法直接使用它。根际促生菌以自生固氮、联合固氮和共生固氮这三种方式，将大气中的氮气转化为氨氮，以供给自身和植物生长所需。
[0194]
11.1、培养基配制
[0195]
ashby培养基(1l)：kh2po
4 0.2g，nacl 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，k2so4·
2h2o 0.2g，caco
3 5g，葡萄糖5g，甘露醇5g，用蒸馏水定容至1l，ph7.0，121℃灭菌15min。
[0196]
11.2、实验过程及结果
[0197]
将芽孢杆菌yjd-sf1菌株点种在ashby固体培养基(在上述ashby液体培养基基础上增加了10％琼脂)上，设置重复三次，放置在28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否能够生长。在此实验中，芽孢杆菌yjd-sf1长出较大完整菌落(图15)，因此，芽孢杆菌yjd-sf1具有固氮的特性。
[0198]
实验例12、芽孢杆菌yjd-sf1溶磷能力的检测
[0199]
有机磷和无机磷对植物生长有关键作用。在碱性土壤中的无机磷主要为ca3(po4)2，不能被植物吸收和利用，限制了植物的生长发育。具有解磷作用的细菌可以分泌有机酸等物质来溶解细菌外部环境难溶性的含磷物质，通过不同的机制转化为植物可利用的含磷物质。如果细菌具有解磷能力，细菌培养在pko培养基(含有难溶性磷酸钙)上生长一段时间后，细菌周围会出现一圈透明圈。
[0200]
12.1、培养基配制
[0201]
pko培养基(1l)：葡萄糖10.0g，磷酸三钙5.0g，氯化镁5g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，硫酸镁0.25g，琼脂17g，用蒸馏水定容至1l，ph7.0，121℃灭菌15min。
[0202]
12.2、实验过程及结果
[0203]
将芽孢杆菌yjd-sf1接种在pko培养基上，设置三次重复，28℃培养72h后，芽孢杆菌yjd-sf1并没有产生透明圈(图16)，说明芽孢杆菌yjd-sf1不具有溶磷的特性。
[0204]
实验例13、芽孢杆菌yjd-sf1产生脂肪酶能力的检测
[0205]
13.1、培养基配制
[0206]
脂肪酶检测培养基(罗丹明b培养基):花生油10g,(nh)2so
4 5.0g，na2hpo4·
7h2o 3.5g,kh2po
4 0.5g,nacl 0.5g,酵母膏0.2g,罗丹明b 0.05g,琼脂15g,用蒸馏水定容至1l，调节ph6.0,灭菌后充分乳化再倒平板。
[0207]
13.2、实验过程及结果
[0208]
将芽孢杆菌yjd-sf1菌株点种在罗丹明b培养基上，设置重复三次，放置在28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否产生透明圈。在此实验中，芽孢杆菌yjd-sf1并没有产生透明圈(图17)，芽孢杆菌yjd-sf1不具有产生脂肪酶的能力。
[0209]
实验例14、芽孢杆菌yjd-sf1产生磷脂酶能力的检测
[0210]
14.1、培养基配制
[0211]
蒙金娜有机磷培养基：葡萄糖10g，(nh4)so
4 0.5g，mgs04·
7h2o 0.3g，nacl 0.3g，kcl 0.3g，feso4·
7h2o 0.036g，mnso4·
7h2o 0.03g，caco
3 5g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1l。冷却至50℃后立即加入无菌卵黄(每1000ml加入50ml的无菌卵黄)摇匀后再倒平板。
[0212]
14.2、实验过程及结果
[0213]
将芽孢杆菌yjd-sf1菌株点种在蒙金娜有机磷培养基上，设置重复三次，放置在28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否产生透明圈。在此实验中，芽孢杆菌yjd-sf1没有产生透明圈(图18)，说明芽孢杆菌yjd-sf1不具有产生磷脂酶的能力。
[0214]
实验例15、芽孢杆菌yjd-sf1产生铁载体能力的分析
[0215]
15.1、培养基配制
[0216]
cas培养基，溶液a：取0.012g刃天青(cas)溶于10ml双蒸水中，并与2ml1mm fecl3溶液混匀；溶液b：取0.015g十六烷基三甲基溴化铵溶解在8ml的水中；将a液缓慢加入b液中，充分混匀即为染液c。10
×
mm9盐溶液20ml，用150ml蒸馏水溶解6.04g哌嗪二乙醇磺酸，两者混匀后用50％的naoh调节ph至6.8，加入琼脂粉，即得培养基d。
[0217]
15.2、实验过程及结果
[0218]
将已灭菌的培养基d中加入已分别灭菌的0.2ml 1mm cacl2，4ml的1mm mgso4·
7h2o，2ml 20％葡萄糖、6ml 10％酸水解酪蛋白混匀，再加入已单独灭菌的染液c，混匀后，即得到cas检测培养基。将筛选出的芽孢杆菌yjd-sf1菌株点种在cas培养基上，设置重复三次，放置在28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否产生橙色透明圈。
[0219]
在此实验中，芽孢杆菌yjd-sf1并没有产生橙色的透明圈(图19)，说明芽孢杆菌yjd-sf1不具有产生铁载体的能力。
[0220]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。