RNA解旋酶突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用的制作方法

rna解旋酶突变体、突变基因及其在制备维生素b2中的应用
技术领域
1.本发明涉及rna解旋酶突变体、突变基因及其在制备维生素b2中的应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.核黄素(riboflavin)又称维生素b2，分子式为c
17
h
20
o6n4，是维生素b族中的一种水溶性维生素，在生物体内以黄素单核苷酸(fmn)和黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)两种形式存在，作为机体内一些重要的氧化还原酶的辅酶参与氧化还原反应，起到递氢的作用。核黄素的缺乏会导致生物体代谢发生障碍，但人和动物均不能自身合成，只能从食物中摄取，因此核黄素的生产在食品、饲料以及医药行业都具有非常广阔的市场。
3.目前核黄素的工业生产方法有植物萃取法、化学合成法、半合成法以及微生物合成法。其中，微生物合成法以其成本低、环境友好以及能源可再生等优点逐步占据主导地位，成为大部分工业化生产的主要方法。在众多可生产核黄素的微生物中，枯草芽孢杆菌(b.subtilis)作为一种非病原微生物，生理代谢及遗传背景清楚，便于确定代谢靶点及基因工程改造，并具有可靠的安全性，它们的发酵产物在食品与饲料业中已有长期的应用，对环境、医药和工业发酵生产都非常重要。其次枯草芽孢杆菌基因工程菌株能够过量合成叶酸、肌苷或鸟苷，具有为核黄素过量合成提供足够前体物的潜力，因此枯草芽孢杆菌基因工程菌在核黄素的微生物发酵生产中逐渐显示出了强大的生命力，成为主要生产菌株。
4.枯草芽孢杆菌(b.subtilis)中核黄素的合成需要5
‑
磷酸核酮糖(ru5p)和鸟嘌呤
‑5’‑
三磷酸(gtp)两个前体物质，其中ru5p来源于磷酸戊糖途径，gtp来源于嘌呤的从头合成途径。二者在一些列核黄素操纵子的作用下经7步反应由核黄素合成途径最终合成核黄素。
5.dead
‑
盒式rna解旋酶负责在翻译过程中将mrna的二级结构破坏，并促进核糖体rna的成熟。(gonz
á
lez
‑
guti
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rrez ja,d
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nez df,vargas
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sol
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s g,st
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lke j,olmedo
‑
lvarez g.the dead
‑
box rna helicases of bacillus subtilis as a model to evaluate genetic compensation among duplicate genes.front microbiol.2018sep 25；9:2261.doi:10.3389/fmicb.2018.02261.pmid:30337909；pmcid:pmc6178137.)枯草芽孢杆菌中dead
‑
盒式rna解旋酶由四个基因csha,cshb,dead/yxin编码，其中cshb除了负责70s核糖体成熟外，还控制mrna的降解(andreou,a.z.,and klostermeier,d.(2013).the dead
‑
box helicase eif4a.rna biol.10,19
–
32.doi:10.4161/rna.21966)。核黄素合成的过程中需要消耗gtp，而rna的合成过程中也许要gtp，蛋白质合成中则需要gtp提供高能磷酸键。这些反应都与核黄素合成竞争前体gtp。因而认为rna解旋酶会影响核黄素的生成，即rna解旋酶编码基因的表达水平与核黄素的生成存在一定的潜在联系。目前，尚未有rna解旋酶突变基因用于维生素b2合成的报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供一种rna解旋酶突变体、突变基因及其在制备维
生素b2中的应用。
7.首先，本发明提供一种rna解旋酶突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于seq id no.3所示序列仅存在下述突变：第236位亮氨酸突变为精氨酸。
8.根据本发明优选地，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
9.其次，本发明提供所述的rna解旋酶突变体的编码基因。
10.根据本发明优选地，所述核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.相应地，本发明第三方面还提供含有所述rna解旋酶突变体的编码基因的表达盒、重组载体。所述重组载体对出发载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。例如，所述载体包括但不限于质粒，噬菌体。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。
12.更优选地是重组表达载体，更优选原核重表达载体。最优选是适合于在枯草芽孢杆菌中进行表达的表达载体。
13.第四方面，本发明提供含有所述rna解旋酶突变体的编码基因的重组宿主细胞。其中所述“宿主细胞”是具有本领域通常理解的含义，其能够导入本发明的突变体的编码基因的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选为原核细胞，更优选为枯草芽孢杆菌。
14.第五方面，本发明提供rna解旋酶突变体、或其编码基因在制备维生素b2中的应用。
15.第六方面，本发明提供一种增强枯草芽孢杆菌产维生素b2的方法，其是将染色体上的rna解旋酶编码基因进行定点突变，获得产维生素b2的能力增强的枯草芽孢杆菌，其中所述定点突变是将所述编码基因的第236位赖氨酸的编码核苷酸替换为精氨酸的编码核苷酸，更具体的是所述编码基因的第707位核苷酸t突变为g。其中的定点突变可以采用本领域已知的各种方法来实现。
16.根据本发明优选地，所述枯草芽孢杆菌的原始出发菌株是枯草芽孢杆菌bs
‑
1。
17.本发明第七方面，提供一种利用上述第六方面的方法获得的枯草芽孢杆菌制备维生素b2的方法，其包括培养所述枯草芽孢杆菌，以及收集维生素b2的步骤，更优选还包括纯化维生素b2的步骤。
18.其中枯草芽孢杆菌的培养可以根据本领域的常规方法进行，例如摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况选择合适的培养条件如温度、时间和培养基的ph值等。此外，可以从细胞或培养基中回收或纯化维生素b2的方法可采取本领域常规的方法，例如过滤、阴离子交换色谱、结晶和hplc等方法。
19.本发明的技术特点在于：
20.选取枯草芽孢杆菌dead
‑
盒式rna解旋酶四个编码基因中的cshb基因，对其第236位亮氨酸定点突变为精氨酸，得到rna解旋酶突变体(l236r)。发现rna解旋酶突变体(l236r)导致rna解旋酶活性降低，并且rna解旋酶活性的降低不能通过其他解旋酶进行补偿。即cshb突变体会导致rna合成和蛋白质翻译速率的减慢，但不至于导致细胞的死亡，因此可以为维生素b2合成节约前体，并且mrna降解生成的gmp也可以重新磷酸化生成gtp，为维生素b2提供充足的前体物质，进而提高维生素b2的产量。
21.本发明的有益效果在于：
22.1、本发明以rna解旋酶cshb为基础，选择第236位的氨基酸进行定点突变，将枯草芽孢杆菌bs
‑
1中rna解旋酶编码基因cshb变为rna解旋酶突变体(l236r)与枯草芽孢杆菌bs
‑
1相比，含有rna解旋酶突变体(l236r)的菌株可以提高产维生素b2的能力达11.5％，因而在制备维生素b2中具有很大的应用价值。
23.2、经研究证实，本发明中含有rna解旋酶突变基因的基因工程菌生物安全，进一步的，实验表明染色体上基因突变不仅未对菌体的生长造成影响，反而对菌体的生长有益，故可以进一步地提高含有rna解旋酶突变体(l236r)的菌株生产维生素b2的能力。
附图说明
24.图1是不同枯草芽孢杆菌菌株发酵41h后的vb2产量。
具体实施方式
25.本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。
26.本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
27.本实施例中所述的高产维生素b2的枯草芽孢杆菌，保藏编号为cgmcc no.4018。枯草芽孢杆菌bs
‑
1，保藏编号为cgmcc no.4019。枯草芽孢杆菌bacillus subtilis 168为枯草芽孢杆菌模式菌株。
28.培养基配方：
29.lb培养基(g/l)：氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉18。
30.发酵培养基(g/l)：玉米浆干粉2、葡萄糖50、酵母膏5、硫酸镁0.05、硫酸铵0.5，其余为蒸馏水。
31.od600的检测：
32.利用分光光度计测定发酵液在600nm下的浊度，快速准确得知发酵液中的生物量。精确移取一定体积的发酵液置于棕色容量瓶中，蒸馏水定容，混匀后置于比色杯中，以蒸馏水为参比空白，在600nm波长下测定生物量，od600＝读数
×
稀释倍数。
33.维生素b2的检测方法：
34.发酵液混匀，用0.01mol/l naoh将其稀释到适当的倍数后，混匀，避光碱溶20min，12000rpm离心2min，取上清液以0.01mol/l naoh做空白在444nm下测定吸光度(显示值控制在0.2
‑
0.8之间)，按以下公式计算核黄素的含量：fb(mg/l)＝(稀释倍数*吸光度)/0.0321。
35.实施例1：cshb基因突变位点的确认与验证
36.由于cshb基因在枯草芽孢杆菌中不仅负责70s核糖体的成熟，还负责编码rna解旋酶，即控制mrna的降解，因此选择针对cshb基因进行定点突变。
37.发明人对于cshb基因编码的rna解旋酶，使用jalview软件对其氨基酸序列高保守区域进行分析。同时使用swiss
‑
model工具对cshb基因编码的rna解旋酶进行蛋白质模拟建模，并使用hotspot wizard 2.0对该酶的活性中心进行预测。发现cshb基因编码的rna解旋
酶氨基酸序列的第236位，位于活性中心及高保守区域附近，对其进行定点突变极有可能导致rna解旋酶活性降低。
38.本发明人前期筛选出了一株高产维生素b2的枯草芽孢杆菌(cgmcc no.4018)，可发酵生产维生素b2。为了进一步验证cshb基因编码的rna解旋酶氨基酸序列的第236位的作用，以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis 168的基因组为参考基因组，将高产维生素b2的枯草芽孢杆菌送到金唯智生物科技有限公司进行测序，以发现对维生素b2能力有影响的基因。通过序列对比分析，发现高产维生素b2的枯草芽孢杆菌发生了大量突变，共包含203个突变位点，经过突变统计，突变共涉及50个基因，其中就包括cshb基因。
39.进一步的，以高产维生素b2的枯草芽孢杆菌的基因组为模板，以upcshb
‑
f，dncshb
‑
r为引物，克隆cshb基因及上下游序列，得到pcr产物，然后将pcr产物送到金唯智生物科技有限公司进行测序。通过序列对比分析，发现高产维生素b2的枯草芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌bacillus subtilis 168相比，cshb基因发生突变，共包含3个突变位点，其中就包括第236位。其中bacillus subtilis 168的cshb基因核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的rna解旋酶氨基酸序列如seq id no.3所示。
40.除第236位突变为非同义突变外，另外两个位点的突变均为同义突变，不影响蛋白质结构。由以上结果可知，cshb基因编码的rna解旋酶氨基酸序列的第236位是影响维生素b2产量的关键位点，根据此位点设计rna解旋酶突变体(l236r)，其氨基酸序列如seq id no.4所示，核苷酸序列如seq id no.2所示。
41.实施例2：构建cshb回复突变的菌株18
‑
cb
42.以bacillus subtilis 168染色体为模板，用引物upcshb
‑
f、upcshb
‑
r(含dr)扩增带接头的野生型的upcshb(含dr)片段，用引物arar
‑
f、arar
‑
r(含dr)扩增带接头的arar(含dr)片段；以pc194质粒为模板，用引物cat
‑
f、cat
‑
r扩增带接头的cat片段；以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis 168的染色体为模板，用引物dncshb
‑
f、dncshb
‑
r扩增下游同源臂片段dncshb，其中所述cshb基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的氨基酸序列如seq id no.3所示。
43.以upcshb片段、cat片段、arar片段和dncshb片段为模板，用引物upcshb
‑
f、dncshb
‑
r进行融合pcr，得到组装片段ucr
‑
cshb，经核酸电泳检测正确，胶回收后得到纯化的ucr
‑
cshb片段。将ucr
‑
cshb片段spizizen转化高产维生素b2的枯草芽孢杆菌(cgmcc no.4018)，涂布于含有8mg/l氯霉素的lb固体平板上，培养24h后进行菌落pcr验证，核酸电泳正确的送金唯智测序，测序正确后，获得含有cshb基因的中间菌株4018
‑
ucr
‑
cshb，其中所述cshb基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的氨基酸序列如seq id no.3所示。
44.挑取中间菌株4018
‑
ucr
‑
cshb的单菌落于含有5ml lb的试管中，37℃振荡培养8h后，取200ul菌液涂布于含有40mg/l新霉素的lb固体平板上，培养24h后进行菌落pcr验证，核酸电泳正确的送金唯智测序，测序正确后，获得了染色体内部通过dr发生同源重组而去掉筛选标记cat
‑
arar且含有cshb基因的回复突变的工程菌株18
‑
cb，其中所述cshb基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的氨基酸序列如seq id no.3所示。
45.本部分所用引物如下：
[0046][0047]
本部分所用到的菌株及质粒如下：
[0048][0049]
实施例3：构建含cshb突变体的菌株19
‑
cb
[0050]
以人工合成的rna解旋酶突变体(l236r)的编码基因为模板，用引物upcshb
‑
f、upcshb
‑
r(含dr)扩增带接头的且带有点突变的upcshb(含dr)片段，用引物arar
‑
f、arar
‑
r(含dr)扩增带接头的arar(含dr)片段；以pc194质粒为模板，用引物cat
‑
f、cat
‑
r扩增带接头的cat片段；以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis 168的染色体为模板，用引物dncshb
‑
f、dncshb
‑
r扩增下游同源臂片段dncshb。其中，所述rna解旋酶突变体(l236r)的核苷酸序列如seq id no.2所示，编码的氨基酸序列如seq id no.4所示。
[0051]
以upcshb片段、cat片段、arar片段和dncshb片段为模板，用引物upcshb
‑
f、dncshb
‑
r进行融合pcr，得到组装片段ucr
‑
cshb，经核酸电泳检测正确，胶回收后得到纯化的ucr
‑
cshb片段。
[0052]
将ucr
‑
cshb片段spizizen转化枯草芽孢杆菌bs
‑
1(cgmcc no.4019)，涂布于含有8mg/l氯霉素的lb固体平板上，培养24h后进行菌落pcr验证，核酸电泳正确的送金唯智测序，测序正确后，获得含有rna解旋酶突变体(l236r)的中间菌株4019
‑
ucr
‑
cshb。其中，所述rna解旋酶突变体(l236r)的核苷酸序列如seq id no.2所示，编码的氨基酸序列如seq id no.4所示。
[0053]
挑取中间菌株4019
‑
ucr
‑
cshb的单菌落于含有5ml lb的试管中，37℃振荡培养8h后，取200ul菌液涂布于含有40mg/l新霉素的lb固体平板上，培养24h后进行菌落pcr验证，核酸电泳正确的送金唯智测序，测序正确后，获得了染色体内部通过dr发生同源重组而去掉筛选标记cat
‑
arar且含有rna解旋酶突变体(l236r)的工程菌株19
‑
cb。其中，所述的rna解旋酶突变体(l236r)的核苷酸序列如seq id no.2所示，编码的氨基酸序列如seq id no.4所示。
[0054]
本部分所用到的菌株及质粒如下：
[0055][0056]
实施例4：评价不同菌株的维生素b2生产能力
[0057]
将工程菌株19
‑
cb和枯草芽孢杆菌bs
‑
1(cgmcc no.4019)分别作为实验组和对照组，工程菌株18
‑
cb和高产维生素b2的枯草芽孢杆菌(cgmcc no.4018)分别为实验组和对照组，进行菌株维生素b2生产能力评价。
[0058]
1、菌株培养条件：
[0059]
在无菌条件下用接种针划线含有20mg/l新霉素的lb固体平板，在37℃培养箱中倒置培养24
‑
48h，以获得新鲜活化的单菌落。用接种针挑取单菌落划线含有20mg/l新霉素的lb固体斜面，在37℃培养箱中培养48h。刮取斜面上1/3的菌苔接种含有70ml发酵培养基的500ml挡板三角瓶中(每株菌3个平行)，37℃、200rpm振荡培养41h后取发酵液测定od600和维生素b2产量。
[0060]
2、不同菌株od600和维生素b2产量的比较
[0061]
工程菌株19
‑
cb和枯草芽孢杆菌bs
‑
1相比，含有rna解旋酶突变体(l236r)的菌株19
‑
cb的维生素b2产量提高了11.5％，工程菌株18
‑
cb和高产维生素b2的枯草芽孢杆菌相比，回复突变的菌株18
‑
cb的维生素b2产量下降了10.3％(参见下表4和图1)。
[0062][0063]
实验结果表明，本发明以rna解旋酶cshb为基础，选择第236位的氨基酸进行定点突变，将枯草芽孢杆菌bs
‑
1中rna解旋酶编码基因cshb变为rna解旋酶突变体(l236r)编码基因，与出发菌株相比，含有rna解旋酶突变体(l236r)的菌株可以提高产维生素b2的能力达11.5％，因而在制备维生素b2中具有很大的应用价值。
[0064]
另外，本发明中含有rna解旋酶突变基因的基因工程菌生物安全，进一步的，含有rna解旋酶突变基因的工程菌株19
‑
cb的生物量高于出发菌株枯草芽孢杆菌bs
‑
1，说明cshb基因的点突变对菌体的生长有益，可以进一步地提高含有rna解旋酶突变体(l236r)的菌株生产维生素b2的能力。