一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法

1.本发明涉及中药提取领域，更具体地说是涉及一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法。


背景技术：

2.中药含有多种苷元的有效成分，如槲皮素、白藜芦醇、芦荟大黄素、大黄素、齐墩果酸等，这些苷元成分具有多种对健康有益的功效，且已经被广泛应用于药品、保健品和化妆品等行业。例如：地锦草中的槲皮素具有优异的抗菌、消炎、抗病毒、抗氧化作用；虎杖中的白藜芦醇具有抗氧化、抗肿瘤、降低血小板聚集、预防和治疗动脉粥样硬化及心脑血管疾病等；大黄中的芦荟大黄素、大黄素等游离蒽醌有抗炎抑菌和泻下等功效。但是苷元类活性成分在中药中常以其糖苷的形式存在，如虎杖中的白藜芦醇主要以虎杖苷(白藜芦醇的糖苷)的形式存在；地锦草中的槲皮素则含有芦丁、异槲皮苷等糖苷；沙棘中的异鼠李素包含异鼠李素-芸香糖-葡萄糖苷、异鼠李素-鼠李糖-葡萄糖苷等糖苷；大黄中的蒽醌糖苷包括大黄酸苷、大黄素葡萄糖苷等糖苷。因此为了提高中药苷元的提取效率，通常需要将其糖苷进行萃取和水解。
3.目前中药苷元提取通常先采用有机溶剂提取，然后采用酶水解或者酸水解的方式对糖苷进行水解。但酶水解存在成本高、底物选择性强、水解条件苛刻、通用性差等不足。尽管酸水解通用性强，但酸水解通常采用回流水解，不适合大规模生产，且酸水解法还使用大量挥发性强、易制毒的盐酸和有机溶剂，不仅易造成环境污染，也会危害操作人员的健康。此外，酸水解和酶水解的样品制备方法均将萃取和水解分两步进行，操作繁琐、耗时长，样品制备效率低。尽管，有专利(cn111909006a)采用绿色的低共熔溶剂(des)对虎杖苷进行一步萃取和水解，但是该技术仍使用了挥发性盐酸，且水解的糖苷结构简单。也有技术使用有机酸des对虎杖苷进行一步萃取和水解，但是基于二元的有机酸水解性能不足，难以高效水解中药中结构更为复杂的糖苷。此外，des萃取水解糖苷后会引入大量的杂质，给苷元的纯化带来艰巨的挑战。因此，开发绿色、高效、高通量的中药糖苷的萃取、水解方法和苷元纯化方法对推动中药中苷元的制备具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有中药苷元提取中存在的操作复杂、耗时长、不绿色环保且通量小等问题，提供了一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法。提供的方法操作简单、效率高、绿色环保且可以大规模生产。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法，其包括基于三元des的中药糖苷一步萃取与水解方法和基于疏水des液液萃取的纯化方法，具体包括如下步骤：
7.(1)基于三元des的中药糖苷一步萃取和苷元水解方法：将新型三元des与水混合作为萃取水解溶剂；将中药粉末与萃取水解溶剂混合后，对糖苷进行萃取水解，过滤得中药
苷元提取液；
8.所述的新型三元des由季铵盐、有机酸和过渡金属盐混合加热得到。
9.(2)基于疏水des的苷元纯化方法：将长链烷基酸和烷基醇、薄荷醇与麝香草酚中的一种混合加热，得到非离子疏水des；将非离子疏水des与中药苷元提取液充分混合，离心，取疏水des相即得纯化后的中药苷元。
10.优选的，步骤(1)中，所述的三元des通过包括如下步骤的方法制备得到：将季铵盐、有机酸和过渡金属盐混合，在80-120℃、400-1000rpm条件下加热30-80min，冷却至室温后所得的液态溶剂即为三元des。
11.优选的，步骤(1)中，所述的季铵盐为氯化胆碱(chcl)、四乙基氯化铵(teac)、四丁基氯化铵(tbac)中的一种，所述的有机酸为草酸(oa)、乙酸(aa)、苹果酸(ma)、乳酸(la)、柠檬酸(ca)中的一种，所述的过渡金属盐为fecl3、alcl3、cocl2、cucl2、zncl2中的一种；季铵盐、有机酸与过渡金属盐的摩尔比为1:1:0.1～1:3:0.2。
12.优选的，步骤(1)中，所述的萃取水解溶剂中三元des的体积百分比浓度为40～80％。
13.优选的，步骤(1)中，所述的中药为地锦草、大黄、虎杖、沙棘中的一种。
14.优选的，步骤(1)中，所述的糖苷为黄酮糖苷、蒽醌糖苷、三萜糖苷中的一种。
15.优选的，步骤(1)中，所述的中药粉末与萃取水解溶剂混合时的固液比为1:5～1:40g/ml。
16.优选的，步骤(1)中，所述的萃取水解的条件为：50～80℃、500～1000rpm条件下对糖苷萃取水解1～2小时。
17.优选的，步骤(2)中，所述的长链烷酸为己酸、正癸酸中的一种，所述的烷基醇为正辛醇。
18.优选的，步骤(2)中，所述的长链烷基酸和烷基醇、薄荷醇与麝香草酚中的一种的摩尔比为1:3～3:1，所制备的非离子疏水des密度低于水且粘度低于100mpa
·
s。
19.优选的，步骤(2)中，非离子疏水des与中药苷元提取液的体积比为1:2～2:1。
20.优选的，步骤(2)纯化后三元des萃取水解溶剂可重复用于糖苷的萃取和水解。
21.一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解方法，包括上述方法中的步骤(1)。
22.与现有技术相比，本发明所述的一种绿色、高效的中药糖苷萃取、水解和苷元纯化方法具有以下有益效果：本发明创造性地采用过渡金属盐与有机酸构建了三元des糖苷水解体系，实现了中药糖苷的一步萃取和水解，方法耗时短，20分钟内对糖苷的水解效率可到94％；本发明还创造性地采用了非离子疏水des对苷元进行了纯化，疏水des对苷元的萃取效率均在80％以上且具有良好的除杂效果；本发明采用的方法避免了回流萃取和水解的操作，同时简化糖苷的工艺流程，具有大规模生产的潜力；本发明还创造性地发现利用过渡金属三元des的糖苷水解体系比二元des对糖苷的水解效率更高；本发明采用的工艺操作简单，绿色环保，适合工业放大生产。
附图说明
23.图1是基于过渡金属三元des的宏观图。
24.图2是氯化胆碱-草酸-alcl3三元des的红外图。
25.图3是氯化胆碱-草酸-fecl3三元des的红外图。
26.图4是不同萃取水解体系对芦丁的转化效率。
27.图5是三元des以及二元des对芦丁水解前后的色谱图。
28.图6是非离子疏水des-三元des液-液纯化体系的宏观图；图中，chcl：氯化胆碱；tbac：四丁基氯化铵；aa：乙酸；la：乳酸；men：薄荷醇；n-oct：正辛醇；cap：己酸；n-dec：正癸酸；thy：麝香草酚。图中，a部分含有cucl2，b部分含有cocl2。
29.图7是疏水des对chcl-oa-alcl3三元des中槲皮素萃取前后的色谱图。
30.图8是疏水des对chcl-la-cocl2三元des中槲皮素萃取前后的色谱图。
31.图9是疏水des对三元des中的槲皮素的萃取效率。
32.图10是三种萃取体系对地锦草中芦丁萃取水解后的色谱图。
具体实施方式
33.下面将结合实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，但不应理解为对本发明的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
34.实施例1：过渡金属盐三元des的制备
35.将氯化胆碱(chcl)和乳酸(la)分别与fecl3、alcl3、cocl2、cucl2、zncl2按1:2:0.1的摩尔比混合，在85℃、500rpm的水浴条件下加热60min至澄清透明均一状态，即得chcl-la-fecl3、chcl-la-alcl3、chcl-la-cocl2、chcl-la-cucl2和chcl-la-zncl2亲水三元des。将氯化胆碱(chcl)和草酸(oa)分别与fecl3、alcl3、cocl2、cucl2、zncl2按1:1.5:0.1的摩尔比混合，在90℃、500rpm的水浴条件下加热60min至澄清透明均一状态，即得chcl-oa-fecl3、chcl-oa-alcl3、chcl-oa-cocl2、chcl-oa-cucl2和chcl-oa-zncl2亲水三元des。
36.上述三元des的宏观图如图1所示，从图中可以看出这10种三元des的室温下均为液态，表明三元des可以作为中药活性成分萃取溶剂的潜力。
37.以chcl-oa-alcl3和chcl-oa-fecl3作为三元des的代表，采用红外光谱进行表征。chcl-oa-fecl3三元des的红外图谱显示其特征峰均来自于chcl-oa二元des和fecl3(图2)。chcl-oa-alcl3中的特征峰也均来自于chcl-oa二元des和alcl3(图3)。该结果表明，在三元des中金属氯化盐与其组分并未发生化学反应。此外，三元des中的羟基吸收峰(3381.6cm-1
和3403.8cm-1
)均出现了展宽和偏移，表明三元des中仍存在大量的氢键作用。
38.实施例2：基于三元des糖苷水解体系对芦丁的水解效率
39.(1)基于chcl-oa-alcl3三元des糖苷水解体系对芦丁的水解效率
40.取50μl 10mg/ml芦丁标液于5ml ep管中，加入2ml体积含水率为40％的chcl-oa-alcl3(chcl、oa与alcl3的摩尔比为1:2:0.1)三元des水溶液，混合均匀，在温度75℃条件下，水解10、20、30、40、50min，用高效液相色谱仪测定芦丁、槲皮素峰面积。
41.(2)基于chcl-oa二元des水解体系对芦丁的水解效率
42.取50μl 10mg/ml芦丁标液于5ml ep管中，加入2ml体积含水率为40％的chcl-oa(chcl与oa的摩尔比为1:2)二元des水溶液，混合均匀，在温度75℃条件下，水解10、20、30、40、50min，用高效液相色谱仪测定芦丁、槲皮素面积。
43.依据转化率公式计算转化率：
44.其中，c0和c
t
分别表示水解前和水解不同时间后芦丁的浓度。
45.如表1和图4、5所示，基于chcl-oa-alcl3三元des对芦丁具有良好的水解效率。相比于二元des，三元des水解20min，94％以上的芦丁可被水解转化为槲皮素，而二元des水解50min仅能转化73％的芦丁。结果表明基于chcl-oa-alcl3三元des三元des比二元des具有更优异的糖苷水解性能。
46.表1不同des水解体系在不同时间条件下对芦丁的水解效率
[0047][0048][0049]
实施例3：疏水des与三元des的液-液分相行为研究
[0050]
以己酸和正癸酸作为氢键供体，以薄荷醇和麝香草酚、正辛醇作为氢键受体，将其按1:2的摩尔比混合、加热制备了薄荷醇-正辛酸(men-n-oct)、薄荷醇-己酸(men-cap)、正癸酸-麝香草酚(n-dec-thy)和正癸酸-正辛醇(n-dec-n-oct)非离子型疏水des。以基于cu
2
和co
2
有色金属盐形成三元des(chcl-aa-cucl2、chcl-la-cucl2、chcl-aa-cocl2、chcl-la-cocl2、tbac-aa-cucl2、tbac-la-cucl2，这些三元des中季铵盐、有机酸和过渡金属盐的摩尔比为1:2:0.1，制备方法参见实施例1)，将疏水des分别与三元des按1:1的体积比混合，涡旋混匀，离心观察是否可以形成液-液两相。
[0051]
如图6a所示，chcl-aa-cucl2、chcl-la-cucl2三元des与四种非离子型疏水des(men-n-oct、men-cap、n-dec-thy、n-dec-n-oct)均可以形成液-液两相。chcl-aa-cocl2、chcl-la-cocl2、tbac-aa-cucl2、tbac-la-cucl2四种三元des与men-n-oct、men-cap非离子型疏水des形成液-液两相(6b)。在液-液两相体系中非离子型疏水des密度小，分配在液-液两相中的上相。当疏水性des与有色金属三元des混合后，在疏水性des相(上相)，图6未出现有色金属的颜色，表明金属离子未进入到疏水性des相，结果显示了疏水des液-液萃取具有金属离子除杂的潜力。
[0052]
实施例4：疏水des对苷元的纯化效果
[0053]
(1)疏水des对苷元的纯化效果
[0054]
将槲皮素分别溶于体积含水率为40％的chcl-oa-alcl3(chcl、oa与alcl3的摩尔比为1:2:0.1)或者chcl-la-cocl2(chcl、la与alcl3的摩尔比为1:2:0.1)三元des水溶液中，得20μg/ml的槲皮素三元des水溶液；向该液中加入等体积的非离子疏水des(薄荷醇-己酸、薄荷醇-正辛酸、正癸醇-正辛酸，其制备见实施例3)，涡旋离心，溶液分层，上相为疏水des，下相为亲水des，分别取上相、下相，用高效液相色谱仪测定两相中槲皮素的含量。
[0055]
(2)传统溶剂对苷元的纯化效果
[0056]
将槲皮素溶于体积含水率为40％的chcl-oa-alcl3或者chcl-la-cocl2三元des水溶液中，得20μg/ml的槲皮素三元des水溶液；向该液中加入等体积的氯仿、乙酸乙酯或正己烷，涡旋离心，溶液分层，上相为有机溶剂相，下相为亲水des，分别取上相、下相，用高效液相色谱仪测定两相中槲皮素的含量。
[0057]
依据萃取率公式计算疏水des对槲皮素的萃取效率：
[0058]
其中，c0和c
hdes
分别表示槲皮素在三元des中的初始浓度以及萃取后在疏水des或有机溶剂中的浓度
[0059]
如图7-8所示，在槲皮素的三元des溶液中(chcl-oa-alcl3未反萃和chcl-la-cocl2未反萃)有大量的杂质峰(3min前的峰为金属离子杂质峰)，且槲皮素的峰较矮。经过非离子疏水des萃取后，大量的槲皮素进入到疏水des相中。相比于三元des的色谱图，在疏水des中出现金属离子的色谱峰明显更少，表明非离子疏水des具有良好的纯化效果。萃取效率的结算结果显示(表2、图9)，基于对三元des中的苷元(槲皮素)具有良好的萃取效果，萃取效率均在80％以上。然而传统的有机溶剂乙酸乙酯和氯仿无法与三元des形成液-液两相体系，进而无法对苷元进行纯化。而正己烷对苷元的纯化效果差，对槲皮素的萃取效率仅为20％。结果显示，非离子疏水des对于三元des水解后的苷元具有良好的萃取和纯化效果。
[0060]
表2不同疏水des和有机溶剂对槲皮素的萃取效率
[0061]
[0062][0063]
实施例5：基于过渡金属盐的三元des对地锦草中芦丁萃取水解效率
[0064]
(1)基于chcl-oa-alcl3的三元des对地锦草中芦丁萃取水解效率
[0065]
将干燥的地锦草粉碎，过60目筛备用，将1.8g chcl-oa-alcl3(chcl、oa与alcl3的摩尔比为1:1.5:0.1)三元des、3.2g水和0.1g过筛地锦草粉末混合，在75℃条件下水浴加热，搅拌速度为500rpm，加热50min，对地锦草中的黄酮苷进行萃取和水解，离心，取上清夜，用高效液相色谱仪测量上清液中芦丁和槲皮素的含量。
[0066]
(2)基于二元des对地锦草中芦丁萃取水解效率
[0067]
将干燥的地锦草粉碎，过60目筛备用，将1.8g chcl-oa(chcl与oa的摩尔比为1:1.5)二元des、3.2g水和0.1g过筛地锦草粉末混合，在75℃条件下水浴加热，搅拌速度为500rpm，加热50min，对地锦草中的黄酮苷进行萃取和水解，离心，取上清夜，用高效液相色谱仪测量上清液中芦丁和槲皮素的含量。
[0068]
(3)传统有机溶剂对地锦草中芦丁萃取水解效率
[0069]
将干燥的地锦草粉碎，过60目筛备用，将1.8g甲醇、3.2g水和0.1g过筛地锦草粉末混合，在75℃条件下水浴加热，搅拌速度为500rpm，加热50min，对地锦草中的黄酮苷进行萃取和水解，离心，取上清夜，用高效液相色谱仪测量上清液中芦丁和槲皮素的含量。
[0070]
依据萃取产率公式计算不同萃取水解体系对槲皮素的萃取产率：依据萃取产率公式计算不同萃取水解体系对槲皮素的萃取产率：
[0071]
其中，c0和v0分别表示槲皮素的萃取水解溶剂中的含量以及萃取溶剂的体积；m0表示中药粉末的质量。
[0072]
如表3和图10所示，相比于传统溶剂，基于三元des和二元有机酸des的萃取溶剂，均可以将地锦草中的糖苷(芦丁)萃取并转化为槲皮素，而传统的有机溶剂则无法将其转化(图10)。此外，相比于现有技术报道的二元des，本发明的三元des萃取水解体系芦丁的萃取和水解效率更高，其槲皮素的产率是二元des的2倍之多(三元des萃取体系对槲皮素的萃取产量是2.78mg/g，二元des对槲皮素的萃取产量是1.2mg/g)。
[0073]
表3不同萃取体系对地锦草中槲皮素的萃取产率
[0074]