一种促进微生物降解风化煤产腐殖酸的方法

1.本发明涉及风化煤的综合利用技术领域，具体涉及一种促进微生物降解风化煤产腐殖酸的方法。


背景技术：

2.风化煤主要是指埋深较浅的煤，其与外界环境接触的几率较大，并在这种长期与外界雨雪霜冻等气候现象相接触后，发生一系列物理化学变化，从而导致内部产生大量腐殖酸的一种变质煤，具有脆性较大、易碎裂、机械性能恶化、结焦性、黏结性等指标均变差、热值低等特性。风化煤在地球上储量巨大，在山西和内蒙二省(区)储量为80亿吨和50亿吨，储量较多的还有新疆、黑龙江、江西、云南、四川、河南、甘肃、贵州等省，但无法直接作为燃煤使用，造成了大量的资源浪费。有的地区的某些煤风化程度很深，通过一些物理、化学方法在一定程度上提高了风化煤腐殖酸的利用效率，但在得到相关目标产物的同时，环境污染不可避免的产生，另外使用物理、化学的转化方式或者成本较高、对转化条件要求严苛又或者转化率较低。因此急需探究一种能够高效、简便、不产生二次污染的风化煤产腐殖酸的方法。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种促进微生物降解风化煤产腐殖酸的方法，以解决现有利用风化煤提取腐殖酸时成本高、产生二次污染等问题。
4.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种促进微生物降解风化煤产腐殖酸的方法，包括以下步骤：
5.将微生物接种到含有风化煤和非离子表面活性剂的pda培养基上进行培养；其中，微生物为云栓孔芝菌和/或黄孢原毛平革菌。
6.本发明的有益效果为：黄孢原毛平革菌和云栓孔芝菌在生长过程中能够产生多种对木质素类物质有极强降解能力的酶，如黄孢原毛平革菌能够产木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶，云栓孔芝菌具有较强的产木质素过氧化物酶和漆酶能力，而风化煤中含有类木质素结构，可以利用黄孢原毛平革菌降解风化煤产腐殖酸。但黄孢原毛平革菌产降解木质素类物质的酶受各方面因素影响，pda培养基中含有黄孢原毛平革菌生长所需的营养，而风化煤也能为黄孢原毛平革菌提供部分碳源，非离子表面活性剂能促进酶对风化煤的降解，从而产生更多含量的腐殖酸，有效提高了风化煤降解提取腐殖酸的效率，同时本发明方法操作简单，成本低，也不会产生二次污染。
7.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
8.进一步，非离子表面活性剂为吐温80或吐温20。
9.采用上述进一步技术方案的有益效果为：吐温80或吐温20可提高云栓孔芝菌和黄孢原毛平革菌细胞膜的渗透性，使细胞内的酶溶液透过细胞膜分泌出来，进而提高了云栓孔芝菌中木质素过氧化物酶和漆酶产生，提高了黄孢原毛平革菌中木质素过氧化物酶和锰
过氧化物酶的产生，尤其是在降解风化煤过程中，这些酶能在长时间内稳定维持高酶活状态。
10.进一步，非离子表面活性剂和培养基的体积比为0.8-1.2:100，优选体积比为1:100。
11.采用上述进一步技术方案的有益效果为：非离子表面活性剂的加入量不能过多，也不能过少，只有在特定用量范围之内才能有效起到提高云栓孔芝菌和黄孢原毛平革菌中木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶的产生，进而促进降解风化煤的效率。
12.进一步，风化煤与pda培养基的重量体积比为(8-15)g：100ml，优选10g：100ml。
13.进一步，风化煤加入pda培养基时经过预处理，具体过程为：将风化煤粉碎过0.2-0.5mm筛。
14.采用上述进一步技术方案的有益效果为：对风化煤的预处理会影响微生物对其的降解作用，当将风化煤粉碎过0.2-0.5mm筛后，其颗粒大小能够有效的与微生物接触，同时在非离子表面活性剂的作用下，将微生物产生的酶与风化煤充分接触后，可将风化煤进行有效降解，形成腐殖酸。
15.进一步，pda培养基包括以下组分：马铃薯浸出液1l、葡萄糖20g、kh2po
4 3g、mgso4·
7h2o 1.5g、维生素b1 0.01-0.03g，ph自然。
16.采用上述进一步技术方案的有益效果为：pda培养基中含有能促进云栓孔芝菌和黄孢原毛平革菌生长的营养物质，如马铃薯浸出液可为云栓孔芝菌和黄孢原毛平革菌提供碳源、氮源、水和无机盐等营养物质，葡萄糖为云栓孔芝菌和黄孢原毛平革菌提供碳源，kh2po
4 3g、mgso4·
7h2o提供无机盐等。
17.进一步，培养条件为：温度25-30℃，转速120-160r/min，时间为20-40天，优选培养温度为28℃，转速为150r/min，时间为30天。
18.采用上述进一步技术方案的有益效果为：培养过程中为了促进菌的生长以及与风化煤的充分接触，以及菌的良好生长，可进行摇床培养，转速为120-160r/min，培养过程中培养温度为25-30℃，在该培养时间条件下，微生物能够快速生长，从开始生长就不断与风化煤接触，并且在生长过程中非离子表面活性剂在不断的促进微生物中酶的产生，更多的酶不断的渗透到细胞膜外，与风化煤充分接触，对风化煤进行降解产生腐殖酸，随着培养时间的增加，产生的腐殖酸也在增加，当培养时间达到30天时，腐殖酸产量最高。
19.本发明具有以下有益效果：
20.本发明利用云栓孔芝菌和/或黄孢原毛平革菌对风化煤进行降解，在降解过程中还加入了非离子表面活性剂，非离子表面活性剂能够使细胞内的酶溶液透过细胞膜分泌出来，进而提高了云栓孔芝菌中木质素过氧化物酶和漆酶产生，提高了黄孢原毛平革菌中木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的产生，尤其是在降解风化煤过程中，这些酶能在长时间内稳定维持高酶活状态。而风化煤中含有类木质素结构物质，这些酶可对这些物质进行酶解进而产生腐殖酸。本发明采用微生物高效降解风化煤提取腐殖酸的方法可以最大限度在经济且环保的基础上增加风化煤腐殖酸的利用效率，增加土壤肥力，改善土壤性质。
具体实施方式
21.以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明
具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
22.本发明中使用的黄孢原毛平革菌和云栓孔芝菌均为购买菌株，具体过程如下：
23.实施例1：
24.一种促进微生物降解风化煤产腐殖酸的方法，包括以下步骤：
25.(1)活化菌株
26.将黄孢原毛平革菌接种到pda固体培养基中进行活化培养；其中，pda固体培养基按以下成分进行配置：马铃薯浸出液1l、葡萄糖20g、kh2po
4 3g、mgso4·
7h2o 1.5g、维生素b1 0.02g、琼脂20g，ph自然。
27.(2)液体培养基的配置
28.液体培养基即pda液体培养基按以下成分进行配置：马铃薯浸出液1l、葡萄糖20g、kh2po
4 3g、mgso4·
7h2o 1.5g、维生素b1 0.02g，ph自然。
29.(3)将配置好的pda液体培养基倒入250ml的三角瓶中，每瓶装100ml的pda液体培养基，然后加入10ml吐温80，10g风化煤，混匀后置于121℃高压灭菌21min；其中，风化煤加入前经过预处理，具体过程为：将风化煤粉碎过0.25mm筛。
30.(3)将灭菌后的培养基冷却，然后在无菌操作台将固体培养基上的菌种分成大小均匀的0.5cm*0.5cm菌块，每个三角瓶接入5块进行培养，培养条件为：培养温度为28℃，转速为150r/min，在培养第1、10、20、30天时分别取10ml培养物检测腐殖酸含量。
31.实施例2：
32.实施例2与实施例1不同之处在于，所加入的菌株为云栓孔芝菌，其余过程与实施例1相同。
33.实施例3：
34.实施例3与实施例1不同之处在于，所加入的非离子表面活性剂为吐温20，其余过程与实施例1相同。
35.实施例4：
36.实施例4与实施例2不同之处在于，所加入的非离子表面活性剂为吐温20，其余过程与实施例2相同。
37.实施例5：
38.实施例5与实施例1不同之处在于，所加入的菌株为黄孢原毛平革菌和云栓孔芝菌，加入量各占一半，其余过程与实施例1相同。
39.对比例1：
40.对比例1与实施例1不同之处在于，没有添加吐温80，其余过程与实施例1相同。
41.对比例2：
42.对比例2与实施例2不同之处在于，没有添加吐温80，其余过程与实施例2相同。
43.对比例3：
44.对比例3与实施例5不同之处在于，所加入的菌为白腐真菌，其余过程与实施例5相同。
45.对比例4：
46.对比例4与实施例5不同之处在于，所加入的菌为白腐真菌和黄孢原毛平革菌，加
入量各占一半，其余过程与实施例5相同。
47.对比例5：
48.对比例5与实施例5不同之处在于，所加入的表面活性剂为甘油，其余过程与实施例5相同。
49.腐殖酸含量检测过程如下：将取出的10ml培养物转入250ml容量瓶中，然后加入100ml焦磷酸钠碱溶液，沸水浴60min取出，在容量瓶内加入1％的氢氧化钠溶液冷却定容至250ml，过滤抽10ml浸提液在油浴蒸干，然后加入10ml重铬酸钾硫酸溶液，在170-180℃油浴锅煮至沸腾继续持续五分钟，取出试管冷却，将液体转移至烧杯用蒸馏水冲洗试管内壁，加4滴邻菲啉指示剂，用硫酸亚铁滴定至砖红色为终点，记录硫酸亚铁使用量。腐殖酸含量计算公式参照土壤腐殖酸检测公式。
50.将实施例1-5以及对比例1-5所获得的培养物进行腐殖酸含量测定，其检测结果为：
[0051] 第1天第10天第20天第30天实施例14.56％7.35％12.89％19.79％实施例24.51％6.21％10.78％16.24％实施例34.54％7.20％12.17％19.32％实施例44.45％6.01％10.53％15.88％实施例54.55％10.56％18.65％28.31％对比例14.50％6.12％8.25％11.93％对比例24.42％6.08％8.13％12.76％对比例34.48％5.86％7.56％10.51％对比例44.59％8.87％14.15％20.16％对比例54.21％8.91％15.36％22.25％
[0052]
由上表可知，当仅仅加入黄孢原毛平革菌，而未加入非离子表面活性剂时，每10ml菌液内腐殖酸含量由最初的4.50％增加至11.93％，腐殖酸含量增加了7.43％。而将菌株换为云栓孔芝菌，在不添加非离子表面活性剂时，每10ml菌液内腐殖酸含量由最初的4.42％增加至12.76％，腐殖酸含量增加了8.34％。由此可知，两种微生物对风化煤的降解有一定的效果，但无显著差异。
[0053]
当黄孢原毛平革菌和非离子表面活性剂均加入时，如表面活性剂为吐温80时，每10ml菌液内腐殖酸含量由最初的4.56％增加至19.79％，腐殖酸含量增加了15.23％。相比不添加吐温80而言，腐殖酸含量明显提高，由此可知，表面活性剂对黄孢原毛平革菌降解风化煤产生显著影响。而当菌株换为云栓孔芝菌，在与吐温80共同作用下，每10ml菌液内腐殖酸含量由最初的4.51％增加至16.24％，腐殖酸含量增加了11.73％。由此可知，非离子表面活性剂对黄孢原毛平革菌在降解风化煤产腐殖酸方面的影响比对云栓孔芝菌影响更大。
[0054]
当黄孢原毛平革菌和云栓孔芝菌以及非离子表面活性剂如吐温80共同降解风化煤产腐殖酸时，两者菌株结合非离子表面活性剂比单独一种菌株降解风化煤效果要更显著，但当非离子表面活性剂由吐温80或吐温20换为其他表面活性剂如甘油时，腐殖酸产率却降低，说明仅仅当吐温80或吐温20才能与黄孢原毛平革菌和云栓孔芝菌产生协同降解风化煤产腐殖酸的作用。此外，将菌株由黄孢原毛平革菌和云栓孔芝菌替换为白腐真菌和黄
孢原毛平革菌时，腐殖酸的产量也远低于黄孢原毛平革菌和云栓孔芝菌的作用。
[0055]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。