以N-甲基吡咯烷酮为电子供体的反硝化菌及其应用的制作方法

以n-甲基吡咯烷酮为电子供体的反硝化菌及其应用
技术领域
1.本发明属于降解有机污染物的微生物技术领域，涉及一株以n-甲基吡咯烷酮为电子供体的反硝化菌及其应用。


背景技术：

2.n-甲基吡咯烷酮(n-methylpyrrolidone,nmp)，是典型的含氮杂环化合物，因其可与水以任意比混溶，且可与各种有机溶剂完全混合，在工业生产中常被用做有机极性溶剂。nmp由于具有高极性、低挥发性及无腐蚀性等特点，被广泛应用于燃料、粘合剂、涂料、锂电池及药品等行业中。nmp结构稳定，可生化性差，并且由于其具有良好的水混溶性，极易随废水排放进入河流、湖泊等自然水体中，并进一步吸收、迁移、挥发和转化，会严重危害自然生态环境。此外，nmp具有较高的生物毒性和致畸性，易对人体造成严重的危害，刺激呼吸系统和眼睛，还会引起头痛，尤其对婴幼儿具有较高的发育毒性。据报道，化学工业释放到环境中的nmp总量为2450吨，高浓度的nmp会对自然生态环境造成严重的损害。因此，处理含高浓度nmp废水成为亟待解决的问题。
3.目前，处理nmp的方法主要包括物理法、化学法和生物法。物理法包括吸附法、萃取法和膜分离法，化学法包括臭氧氧化法、光催化氧化法及电化学氧化法等。但由于物理化学法存在易造成二次污染、成本高、能耗高等问题，在实际应用中往往受到限制。相比较物理化学法，生物法是一种经济、绿色、友好的处理方法，因此生物法是目前废水处理中应用最广泛的技术。但由于nmp具有较高的生物毒性且可生化性差，现有的菌株难以实现对nmp的高效降解和矿化。因此，亟需寻找可耐受nmp的高生物毒性，且可高效降解nmp的菌株。
4.文献1报道了一株副球菌paracoccus sp.nmd-4，其可以在24h内降解500mg l-1
的nmp，该菌株可以利用nmp为唯一碳源和氮源进行生长，并将其降解矿化。尽管该菌株可以有效降解nmp，但其需在好氧条件下培养，成本较高，在处理过程中易造成二次污染，且适用的nmp浓度较低，不能满足实际工业nmp废水处理需求(cai,s.,cai,t.m.,liu,s.y.,et al.biodegradation of n-methylpyrrolidone by paracoccus sp.nmd-4 and its degradation pathway.int.biodeter.biodegr.2014,93,70-77.)。中国专利申请202010549899公开了一株耐盐缓慢葡萄球菌，其可应用于工业nmp含盐废水中对nmp的降解，2000mg l-1
的nmp在经过6天处理后浓度降至140mg l-1
以下。虽然该菌株能够有效降解nmp，但耗费时间较长，处理效率并不高，处理方法有待进一步强化。


技术实现要素：

5.针对现有的用于降解n-甲基吡咯烷酮的菌株通常在好氧条件下进行，应用成本较高，本发明提供了一株以n-甲基吡咯烷酮为电子供体的反硝化菌。该菌株能够在缺氧条件下，利用n-甲基吡咯烷酮作为电子供体、硝态氮为电子受体，高效降解n-甲基吡咯烷酮，同步实现反硝化脱氮。
6.发明人以用于反硝化脱氮的活性污泥为菌源，利用以n-甲基吡咯烷酮为唯一碳源
的筛选培养基，进行菌株的纯化分离，得到了一株可以利用n-甲基吡咯烷酮为电子供体进行反硝化的菌株菌，经分子生物学鉴定为寡养单胞菌(stenotrophomonas sp.)，命名为stenotrophomonas sp.njust52。该菌株已于2022年03月02日在中国典型物保藏中心(cctcc)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为cctcc no：m2022177。
7.本发明还提供上述stenotrophomonas sp.njust52的培养方法，具体步骤为：将stenotrophomonas sp.njust52接种在培养基中，培养基ph为6.0～8.0，培养温度为30℃～35℃。
8.本发明还提供上述stenotrophomonas sp.njust52在含有n-甲基吡咯烷酮的废水处理中的应用。
9.进一步地，上述含有n-甲基吡咯烷酮的废水中还含有硝态氮。
10.本发明的寡养单胞菌stenotrophomonas sp.njust52，在缺氧反硝化条件下，可以利用n-甲基吡咯烷酮作为电子供体，硝态氮为电子受体进行代谢和生长，同时具有高效的n-甲基吡咯烷酮降解能力和反硝化脱氮能力。相比于好氧条件，stenotrophomonassp.njust52对生存环境的适应能力和耐受能力更强，应用于工业废水的工艺处理中可减少好氧曝气工段，节约经济成本。在含有n-甲基吡咯烷酮的模拟废水中加入寡养单胞菌stenotrophomonas sp.njust52进行处理，可以实现n-甲基吡咯烷酮和硝态氮同步的高效去除率。
附图说明
11.图1是寡养单胞菌stenotrophomonas sp.njust52的扫描电子显微镜图。
12.图2是寡养单胞菌stenotrophomonas sp.njust52在n-甲基吡咯烷酮初始浓度为10.0～10.2mm、硝态氮初始浓度为20.7～22.3mm的液体培养基中对n-甲基吡咯烷酮的降解效果图。
13.图3寡养单胞菌stenotrophomonas sp.njust52在n-甲基吡咯烷酮初始浓度为10.0～10.2mm、硝态氮初始浓度为20.7～22.3mm的液体培养基中对硝态氮的脱氮效果图。
14.图4是寡养单胞菌stenotrophomonas sp.njust52在不同进水ph条件下降解n-甲基吡咯烷酮同步反硝化脱氮的效果图。
具体实施方式
15.下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明。
16.实施例1
17.stenotrophomonas sp.njust52的筛选分离及鉴定。
18.(1)菌株的筛选及分离
19.从实验室长期用于降解n-甲基吡咯烷酮的活性污泥中取样5g，加入到100ml无菌生理盐水(0.85％氯化钠溶液)中，搅拌均匀后，静置两个小时。取1ml上清液加入到经121℃高温灭菌20分钟后的无机盐液体培养基中，180转/分钟摇床富集培养三天，连续三次富集后，取培养液用无菌生理盐水(0.85％氯化钠溶液)梯度稀释至10-4-10-10
倍。制备无机盐琼脂固体培养基平板，取稀释后的培养液20μl，分别涂布于无机盐琼脂固体培养基平板上，置于生化培养箱中30～35℃恒温培养三天。挑选培养皿上具有明显差异的单菌落，采用平板
划线分离的方法进行纯化培养，连续纯化五次后，得到单一菌株，进行斜面保存。
20.配制100ml含有n-甲基吡咯烷酮及硝态氮的无机盐液体培养基装入120ml血清瓶中，用纯氦气进行曝气以去除溶解氧，121℃高温灭菌20分钟后接种分离纯化得到的纯菌株，在恒温震荡培养箱中180转/分钟和30～35℃的条件下缺氧培养，监测n-甲基吡咯烷酮及硝态氮的浓度变化。选取能有效去除培养基中n-甲基吡咯烷酮和硝态氮的菌株，命名为njust52，将其进行斜面保存和-80℃低温保存。
21.lb培养基的组成如下：10g l-1
胰蛋白胨，5g l-1
酵母提取物，10g l-1
氯化钠。
22.无机盐培养基的组成如下：1.53g l-1
nahpo4·
12h2o，0.38g l-1
kh2po4，0.1g l-1
mgso4·
7h2o，0.05g l-1
cacl2，10ml l-1
微量元素溶液sl-4，n-甲基吡咯烷酮和硝酸钠的量根据实验需要投加
23.微量元素sl-4组成：0.5g l-1
edta，0.2g l-1
feso4·
7h2o，微量元素100ml l-1
sl-6。
24.微量元素sl-6组成：0.01g l-1
znso4·
7h2o，0.03g l-1
mncl2·
4h2o，0.3g l-1
h3bo4，0.2g l-1
cocl2·
6h2o，0.01g l-1
cucl2·
2h2o，0.02g l-1
nicl2·
6h2o，0.03g l-1
na2moo4·
2h2o。
25.在无机盐培养基的基础上加入20g l-1
的琼脂，高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20分钟后，倒入无菌培养皿中冷却至室温后获得无机盐琼脂固体培养基平板。
26.(2)菌株的鉴定
27.对菌株进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16s rrna基因序列，将菌株的16s rrna基因序列与genbank数据库中的基因序列进行同源性比较并分析结果，从分子生物学水平上确定该菌的种属。
28.①
形态学特征：njust52的菌落呈扁平状，表面粗糙不透明，微黄色，在液体培养基中程扩散性混浊。该菌株njust52的细胞呈杆状，尺寸为0.9～1.9μm
×
0.2～0.3μm，图1为寡养单胞菌njust52的扫描电子显微镜照片。
29.②
生理生化特征：过氧化氢酶呈阳性，硝酸盐还原酶呈阳性。
30.③
分子生物学鉴定：以njust52菌株的核dna为模板，以细菌扩增的通用引物进行pcr扩增，测定菌株njust52的基因序列。将菌株的16s rrna基因序列提交到genbank数据库进行同源性比较，结果表明，njust52与stenotrophomonas sp.strain gamma-29(mh703460.1)的序列相似度达99％以上。
31.根据njust52的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，菌株njust52被鉴定为stenotrophomonas，命名为stenotrophomonas sp.njust52。
32.实施例2
33.菌株stenotrophomonas sp.njust52降解n-甲基吡咯烷酮及同步反硝化脱氮性能。
34.将stenotrophomonas sp.njust52接种至含有5mm的n-甲基吡咯烷酮的lb液体培养基中，30～35℃条件下180转/分钟摇床培养，进行njust52的菌株富集，待菌株进入对数生长期后(约48小时)，将所得菌液用超低温离心机离心10分钟(4℃，6000转/分钟)，得到沉积菌体。用灭菌后的无机盐液体培养基重悬，离心，重复洗涤三次，将菌体重悬于无菌液体无机盐培养基中，得到种子液(控制od
600
约为1.5～2.0)。
35.向120ml血清瓶中加入100ml含有n-甲基吡咯烷酮初始浓度为10.1
±
0.1mm，硝酸
钠初始浓度为21.5
±
0.8mm的无机盐液体培养基作为模拟废水，并连续通入高纯氦气以去除血清瓶及废水中溶解的氧气，构建缺氧反硝化体系。随后，将血清瓶用丁基橡胶塞和铝盖密封，在121℃条件下高压灭菌20分钟，静置至室温。将上述种子液接种至血清瓶中，接种量为5％，在30～35℃、180转/分钟的条件下摇床培养，监测废水中n-甲基吡咯烷酮和硝态氮的浓度变化(n-甲基吡咯烷酮浓度通过高效液相色谱仪进行测定，硝态氮浓度通过离子色谱仪进行测定)。设立未添加硝酸钠的实验组作为厌氧对照体系，其余操作同缺氧反硝化体系；设立未接种njust52的实验组作为非生物对照体系，其余操作同缺氧反硝化体系。
36.实验结果如图2所示，在含有硝酸钠的缺氧反硝化体系中，10.1
±
0.1mm(1001.22
±
9.91mg l-1
)的n-甲基吡咯烷酮在27小时内被完全降解。如图3所示，在含有硝酸钠的缺氧反硝化体系中，21.5
±
0.8mm硝态氮在25小时内实现完全脱氮。然而，在未添加电子受体硝酸钠的厌氧对照体系中，相同浓度的n-甲基吡咯烷酮的去除率低于30％(图2)。在未接种njust52的非生物对照体系中，硝态氮和n-甲基吡咯烷酮的浓度没有明显变化(图2)。本实施例说明分离得到的stenotrophomonas sp.njust52可成功应用于同时含有硝态氮和n-甲基吡咯烷酮废水的生化处理，实现废水中硝态氮和n-甲基吡咯烷酮的高效去除。
37.实施例3
38.配制100ml含n-甲基吡咯烷酮初始浓度为5.1
±
0.4mm，硝态氮初始浓度为10.8
±
0.9mm，初始ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的无机盐液体培养基作为模拟废水，加入到120ml血清瓶中，并连续通入高纯氦气以去除血清瓶及废水中溶解的氧气，构建缺氧反硝化体系。随后，将血清瓶用丁基橡胶塞和铝盖密封，在121℃条件下高压灭菌20分钟，静置至室温。将上述种子液接种至血清瓶中，接种量为4％～10％，在30～35℃、180转/分钟的条件下摇床培养，监测废水中n-甲基吡咯烷酮和硝态氮的浓度变化。
39.实验结果如图4所示，在初始ph为6.0、7.0和8.0的条件下，stenotrophomonas sp.njust52均可实现n-甲基吡咯烷酮和硝态氮的高效去除，且在初始ph为7.0时去除效果最好；在初始ph为9.0的条件下，stenotrophomonas sp.njust52也可实现n-甲基吡咯烷酮和硝态氮的部分去除，但去除率较低；在ph为5.0的条件下，n-甲基吡咯烷酮和和硝态氮的去除率低至10％左右。
40.本实施例说明菌株stenotrophomonas sp.njust52降解n-甲基吡咯烷酮和反硝化脱氮的适合ph范围在6.0～8.0之间，最佳进水ph值为中性，弱酸或弱碱会略微降低n-甲基吡咯烷酮和硝态氮的去除能力，而过酸和过碱都会显著抑制菌株stenotrophomonas sp.njust52降解n-甲基吡咯烷酮和反硝化脱氮的性能。