一株产琥珀酸的菌株及其生产琥珀酸的方法和应用

1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株产琥珀酸的菌株及其生产琥珀酸的方法和应用。


背景技术：

2.琥珀酸(丁二酸)是继酒精和乳酸之后另一种重要的采用厌氧工艺生产的大宗发酵产品，而琥珀酸生产技术要求之高又不是前两者可以比拟的，而且产品的理论转化率更高，同时兼具二氧化碳的固定作用。由于厌氧发酵工艺先天具有的生产能耗低，设备投入小的优点，尤其适合对成本要求很严格的化工原料和中间体的生产。随着发酵琥珀酸系列产品的大规模入市场，会带动更多的厌氧发酵产品的问世，从而提高整个生物发酵产业的原料利用效率、能源效率和设备投资效率，对建设绿色、节约型社会发挥积极的作用。
3.以往琥珀酸都是通过化学方法生产的，通常采用顺丁烯二酸(酐)催化加氢得到。工业化的历史可以追溯到上世纪20年代。在1929年当时的美国苯胺公司开始了用顺丁烯二酸酐电解还原法生产，该技术延续至今。从上世纪70年代初就有日本人对发酵法生产琥珀酸的技术进行了探索性的研究(日本专利：昭48-26982、昭50-142782和昭50-63190)。进入21世纪发酵法生产琥珀酸已成为有机酸发酵研究的热门课题，其代表性的工艺就是利用厌氧细菌转化糖质原料为琥珀酸，并利用琥珀酸为原料开辟功能各异的衍生产品，以试图替代传统上以石油、天然气等矿物资源生产的化学品，以部分摆脱对这些不可再生资源的依赖。
4.目前，琥珀酸发酵菌种的工作主要围绕两个方面：1、筛选天然的非重组微生物菌种；2、经过代谢工程改造的大肠杆菌。但是，天然的这些微生物只能产生微量的琥珀酸。若使其投入工业化生产，需要大量的菌种诱变和驯化工作。采用代谢工程改造的大肠杆菌的琥珀酸工艺，基本上是建立在先期有氧积累高生物量的前提之上的厌氧工艺，这对发酵条件和设备提出了比较复杂的要求。而且基因工程改造菌属于转基因技术改造菌，其生产的琥珀酸如果在食品领域使用将很难提供“非转基因”等宣传标识。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一株能够在厌氧条件下稳定高产琥珀酸的菌株，以及利用其生产琥珀酸的方法和应用。
6.为实现上述目的，本发明提供了一株产琥珀酸的菌株，所述菌株的分类命名为大肠埃希氏菌(escherichia coli)suc37，其保藏号为cgmcc no.24150。
7.本发明还提供了一种生产琥珀酸的方法，是通过发酵所述的大肠埃希氏菌suc37得到琥珀酸。
8.进一步的，所述方法包括：
9.1)将大肠埃希氏菌suc37接种至固体培养基，37℃，静置培养24-26小时；
10.2)挑取一接种环固体平板培养基培养的大肠埃希氏菌suc37，接种于种子培养基
中，37℃，静置培养10-12小培养得到种子液；
11.3)将种子液按照体积比2％的接种量接种到发酵培养基中培养得到含琥珀酸镁盐的发酵液；
12.发酵培养基的配方为：葡萄糖78-82g/l、玉米浆24-26g/l、mgco
3 68-75g/l，蛋白胨8-10g/l，121℃下灭菌20min；
13.培养条件为：37℃，150转/分钟的条件下培养72-75小时；前24小时通气co2；
14.4)发酵液过滤后弃上清，滤饼过h型阳离子交换树脂柱交换后得到粗琥珀酸溶液，粗琥珀酸溶液经过浓缩结晶和脱色精制，得到琥珀酸纯品。
15.进一步的，所述固体培养基的配方为：葡萄糖50-55g/l、磷酸氢二钾0.8-1g/l、蛋白胨10-12g/l、琼脂10-12g/l。
16.更进一步的，所述种子培养基的配方为：葡萄糖50-55g/l、磷酸氢二钾0.8-1g/l、多价胨15-18g/l、半胱氨酸5g/l、碳酸镁0.8-1g/l。
17.本发明还提供了所述的菌株在发酵生产有机酸中的应用。
18.进一步的，所述有机酸包括琥珀酸、甲酸、乳酸和乙酸。
19.本发明具有如下有益效果：
20.1)本发明的大肠埃希氏菌(escherichia coli)suc37兼性厌氧，可以在以固体碱式盐为中和剂的厌氧条件下进行稳定的琥珀酸发酵，对氧气敏感性差，因此大大降低了发酵过程的控制难度和对设备的要求，该菌株转化葡萄糖(6c)到琥珀酸(4c)的摩尔分子转化率能够达到1:1.1，即一分子葡萄糖能够获得1.1分子的琥珀酸，通过中试验证，发酵产酸可达到80g/l，基于消耗葡萄糖的分子转化率达到110％以上，该技术同时具有了高转化率，低能耗，低过程控制成本的优良特征，已经达到琥珀酸发酵的国际先进水平。
21.2)本发明生产琥珀酸的方法不依赖于资源约束型的矿物资源，生物法原料选择更具有灵活性和可再生性，生产成本的稳定性更好。
22.3)本发明生产的琥珀酸纯度和安全性更高，符合国家绿色生产的环保要求。
附图说明
23.图1为大肠埃希氏菌suc37发酵菌株菌落照片。
24.图2为大肠埃希氏菌suc37发酵菌株显微镜照片。
具体实施方式
25.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.本发明披露了一株产琥珀酸的菌株及其生产琥珀酸的方法和应用。所述菌株的分类命名为大肠埃希氏菌(escherichia coli)suc37，其保藏日期为2021年12月20日，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，简称cgmcc，保藏编号：cgmcc no.24150。
27.本发明的大肠埃希氏菌(escherichia coli)suc37(以下或简称为suc37)分离筛选自瘤胃中，如图1-2所示，其形态及生理特征鉴定如下：
28.单菌落凸起，呈圆形，乳白色，不透明，表面有光泽，边缘完整，挑起有粘稠感。经16s鉴定属于大肠杆菌属(escherichia coli)。
29.实施例1：利用suc37生产琥珀酸的方法
30.1)将大肠埃希氏菌suc37接种至固体培养基培养；
31.固体培养基的配方为：葡萄糖50g/l、磷酸氢二钾1g/l、蛋白胨10g/l、琼脂10g/l；
32.培养条件为：37℃，静置培养24小时；
33.2)挑取一接种环固体平板培养基培养的大肠埃希氏菌suc37，接种于种子培养基中培养得到种子液；
34.种子培养基的配方为：葡萄糖50g/l、磷酸氢二钾1g/l、多价胨15g/l、半胱氨酸5g/l(创造厌氧环境)、碳酸镁1g/l；
35.培养条件为：37℃，静置培养12小时；
36.3)将种子液按体积比2％接种到发酵培养基中培养得到含琥珀酸镁盐的发酵液；
37.发酵培养基的配方为：葡萄糖80g/l、玉米浆25g/l、mgco368-75g/l(具体参见表1)，蛋白胨10g/l，121℃下灭菌20min；
38.培养条件为：37℃，150转/分钟的条件下培养72小时；前24小时通气co2保持发酵液厌氧环境，待发酵过程进入主生长期，自身产生大量co2后，停止通气。
39.4)发酵液过滤(0.22um)后弃上清，滤饼过h型阳离子交换树脂柱交换后得到粗琥珀酸溶液，粗琥珀酸溶液经过浓缩结晶和脱色精制，得到琥珀酸纯品。
40.具体步骤包括：
41.a.过滤
42.发酵液121℃半小时高温灭菌后，将发酵液用泥浆泵或者柱塞泵打入板框，初期的不清液体可以适当回流，滤液排放到污水处理场进行生化处理，滤饼适当水洗后用压缩空气压干后通过传送带输送到交换树脂柱。
43.b.离子交换
44.发酵过程中由于连续的中和反应，发酵液中主要是水溶性的琥珀酸镁盐，反应式：
45.c4h6o4(琥珀酸) mgco3＝mgc4h4o4(琥珀酸镁) co2 h2o
46.发酵液过滤后，经过与h型的例子交换树脂柱交换后得到粗琥珀酸溶液。反应式：
47.mgc4h4o4(琥珀酸镁) 2hr(阳树脂)＝mgr2 c4h6o4(琥珀酸)(结晶分离过程排出含有机物废水)；
48.交换柱饱和后的树脂用盐酸再生恢复h型，再生剂结合镁离子生成氯化镁。反应式为：
49.mgr2 2hcl＝2hr mgcl2(树脂再生过程排出含盐废水)；
50.反应式为：
51.mgcl2 na2co3＝2nacl mgco3↓
(镁盐回收过程产生含盐废水)；
52.总的净反应式为：
53.2hcl na2co3＝co2 h2o 2nacl；
54.故琥珀酸提取过程中产生的废水中除了未被利用的原料和未提取出的产品外还增加了一定浓度的盐分(氯化钠)。在离子交换和中和剂再生中产生的废水为最主要的部分，总量相当于总发酵液体积的约两倍。琥珀酸精制和发酵过程产生的废水量非常有限。
55.c、浓缩结晶
56.结晶罐进料开始后即开动搅拌器，夹套通蒸汽保持溶液完全加热。当粗琥珀酸溶液加满后，控制料液降温幅度为10℃/小时，直到温度达到10℃左右。保温搅拌1小时后，放料到离心机进行甩干操作。
57.晶体适当水洗后，甩干，得到粗结晶，送到精制工序，离心母液返回到离交设备。
58.d、琥珀酸的脱色精制
59.在溶晶罐中按照粗结晶和水的比例为1：2的比例加入无盐水，升温溶解，加入粗结晶质量的1％的活性碳后，维持30分钟。过滤除去活性碳，清液打入结晶罐，冷却结晶，结晶条件同前。
60.结晶的灰分和硫酸根检验合格后，即可用流化床干燥器进行干燥，直到水份含量低于0.2％，测定其质量和纯度。
61.为验证不同蛋白胨、不同碳酸镁和碳酸镁含量对产酸量的影响，特进行如表1所示分组实验，其中，发酵培养基中的蛋白胨与固体培养基中的蛋白胨一致。
62.表1不同分组的发酵培养基配方组成及产酸量
[0063][0064]
如表1所示，本发明的suc37发酵产酸可达到80.86g/l，基于消耗葡萄糖的分子转化率达到110％以上，一次结晶纯度可以达到95％以上，该技术同时具有了高转化率，低能耗，低过程控制成本的优良特征，已经达到琥珀酸发酵的国际先进水平。
[0065]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0066]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。