一种用于高通量全自动化鸡血DNA高效抽提的试剂盒和方法与流程

一种用于高通量全自动化鸡血dna高效抽提的试剂盒和方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，涉及一种用于高通量全自动化鸡血dna高效抽提的试剂盒和方法。


背景技术：

2.用分子生物学技术研究复杂的基因组，特别是dna文库构建、测序、southern印迹、aflp扩增片段长度多态性、荧光定量pcr等复杂分子实验，对制备纯净的高分子质量dna要求是非常严苛的。比如测序技术中dna的质量包括浓度、纯度、完整性以及dna的准确定量都会直接影响测序的数据产出量和准确性。
3.鸡的羽茎角质层较厚，不易消化，同时蛋白含量较高，dna含量较少，不适合作为dna提取的原材料，动物生产上一般使用鸡血作为提取的原材料，但鸡血对于保存方式相对苛刻，需要使用抗凝剂低温保存，否则容易导致凝血或溶血的情况发生，生产中大规模的采样过程很容易形成凝血，凝血的dna抽提效果较差，表现为dna浓度、纯度、完整性较差，同时dna定量的准确性也受到较大影响。传统的酚-氯仿抽提法和离心柱法提取dna效果较好，但大批量提取的效率较低，无法实现自动化，而磁珠法是近年来发展得比较快的基因组dna提取方法，在保证提取效果的前提下能实现自动化，但目前市面上以48通量，96通量为主，仍有较大的空间提高效率。同时核酸抽提试剂盒市面上的价格较高，单个样品的核酸抽提成本高于10元，对于动物生产上的大范围推广应用形成较大限制。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于高通量全自动化鸡血dna高效抽提的试剂盒和方法。此试剂盒是基于磁珠法，通过一步裂解的方式从鸡血中全自动化大批量提取完整基因组dna，获得的dna纯度和浓度尚佳，可以用于高通量分子生物学实验。
5.为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于高通量全自动化鸡血dna高效抽提的试剂盒，所述试剂盒包括血细胞裂解液和加强版裂解液中的至少一种，结合液，洗涤液i，洗涤液ii以及洗脱液；
6.所述血细胞裂解液包括tris、edta、盐酸胍、nacl、triton x-100，所述加强版血细胞裂解液包括tris、edta、盐酸胍、异硫氰酸胍、nacl、triton x-100和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸；
[0007]
所述结合液包括peg600和nacl；
[0008]
所述洗涤液i由盐酸胍、nacl、tris、edta和异丙醇，所述洗涤液ii包括乙醇水溶液；
[0009]
所述洗脱液包括tris-hcl和edta。
[0010]
优选地，所述血细胞裂解液包括4～8m盐酸胍，150～200mm nacl，10～50mm edta，50～100mm tris，1％～4％triton x-100，ph为7.0～9.0；更优选地，所述血细胞裂解液包
括6m盐酸胍，150mm nacl，10mm edta，50mm tris，1％triton x-100，ph为7.8；
[0011]
优选地，所述加强版血细胞裂解液包括4～8m盐酸胍，3～6m异硫氰酸胍，150～200mm nacl，10～50mm edta，50～100mm tris，2％～4％triton x-100，30～100g/l的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸，ph为7.0～9.0；更优选地，所述加强版血细胞裂解液包括6m盐酸胍，4m异硫氰酸胍，200mm nacl，10mm edta，50mm tris，4％triton x-100，50g/l的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸，ph为7.8。凝血的核酸提取才需要使用加强版裂解液。
[0012]
优选地，所述结合液包括质量分数为5～25％的peg6000，0.25～2.5m nacl，ph为7.0～9.0；更优选地，所述结合液包括质量分数为10％的peg6000，1.25m nacl，ph为7.8。
[0013]
优选地，所述洗涤液i包括2～6m盐酸胍，2～5mm edta，10～50mm tris，质量分数为0.15％的hcl，体积分数为20～50％的异丙醇，ph为7.0～9.0；优选地，所述洗涤液i包括4m盐酸胍，2.5mm edta，20mm tris，质量分数为0.15％的hcl，体积分数为25％的异丙醇，ph为7.8；
[0014]
所述洗涤液ii包括体积分数为70％～75％的乙醇溶液；优选地，所述洗涤液ii包括体积分数为70％的乙醇溶液。
[0015]
优选地，所述洗脱液包括10～100mm的tris-hcl，0.1～1mm的edta，ph为7.0～9.0；优选地，所述洗脱液包括10mm的tris-hcl、1mm的edta，ph为8.0。
[0016]
优选地，所述试剂盒还包括磁珠、水和无水乙醇；更优选地，所述磁珠的浓度为50～200mg/ml，所述磁珠为羟基磁珠或硅基磁珠。磁珠可使用市面上用于核酸纯化的羟基磁珠或硅基磁珠，本发明使用了美基的硅基磁珠，长春志昂的羟基磁珠以及beckman的ampure磁珠配合自主研发的核酸提取试剂盒，dna效果均良好。
[0017]
本发明提供了上述所述的试剂盒在全自动化鸡血dna高效抽提中的应用。
[0018]
本发明为了达到高通量高效率提取高质量鸡血dna，同时采用了全自动化的核酸提取方案。优选地，所述全自动化通过采用全自动化工作站beckman nx
p
实现，工作站板位略微调整，亦同样适用于其他类型的工作站。
[0019]
本发明提供了一种用于高通量全自动化鸡血dna高效抽提的方法，所述方法采用上述所述的试剂盒抽提鸡血dna，包括如下步骤：
[0020]
(1)鸡血的吸取/挑取：对于抗凝效果较好的抗凝血(血液流动畅快，没有明显凝血块/丝)，将分层的抗凝血上下颠倒混匀后，用移液器吸取中层血，用超纯水稀释；对于凝血块/凝血丝，用注射器的针头挑取鸡凝血细头部位的血块/血丝，用超纯水稀释；
[0021]
(2)鸡血的消化：向步骤1得到的溶液加入血细胞裂解液和蛋白酶k，充分混匀，56℃消化0.5h-18h；
[0022]
(3)dna的结合：向步骤2得到的溶液加入结合液和无水乙醇以及磁珠进行振荡结合，移至磁力架上进行dna吸附，吸弃废液；
[0023]
(4)dna的洗涤：先加入洗涤液i洗涤磁珠两次，吸弃废液；再加入洗涤液ii洗涤两次，吸弃废液，56℃烘干；
[0024]
(5)dna的洗脱：加入te重悬磁珠，56℃高速振荡10～15min，移至磁力架上进行磁珠吸附，吸取含dna的上清，得到含有dna的溶液。
[0025]
优选地，所述步骤(1)中鸡血的吸取/挑取：对于抗凝效果较好的抗凝血，将分层的
抗凝血上下颠倒混匀后，用移液器吸取中层血2.5～5μl，用超纯水稀释至100μl；对于凝血块/凝血丝，用1ml注射器的针头挑取鸡凝血细头部位的血块/血丝，用超纯水稀释至100μl；所述步骤1)使用全自动化工作站beckman nx
p
进行超纯水的添加操作；
[0026]
所述步骤(2)中加入血细胞裂解液为200μl，20mg/ml蛋白酶k为20μl，56℃消化0.5h以上；所述步骤(2)使用全自动化工作站beckman nx
p
进行血细胞裂解液以及蛋白酶pk的添加、混匀、孵育的操作；
[0027]
所述步骤(3)中加入结合液100μl，无水乙醇300μl，磁珠10μl，间歇振荡8-10min，转移至磁力架吸附dna 1min，吸弃废液，所述步骤(3)使用全自动化工作站beckman nx
p
进行操作。
[0028]
所述步骤(4)中加入洗涤液i 600μl，振荡1min，转移至磁力架1min，吸弃废液，重复以上步骤1次；加入洗涤液ii，振荡1min，转移至磁力架1min，吸弃废液，重复以上步骤1次；晾干；所述步骤(4)使用全自动化工作站beckman nx
p
进行操作；
[0029]
所述步骤(5)中加入洗脱液te 120μl，振荡15min，转移至磁力架2～5min，吸取含dna的上清至dna样品保存板，放置-20℃保存；所述步骤(5)使用全自动化工作站beckman nx
p
进行操作。
[0030]
优选地，所述方法还包括dna的质检：利用酶标仪或nanodrop8000进行自动化或手动检测dna浓度，使用预混的dna与loading buffer进行电泳检测。
[0031]
步骤(1)中，挑取凝血时，需注意挑取部位为血块的细头部分，可用针头轻轻挑取血块下部位进行翻转。优选地，挑取的血块/血丝是花生碎大小的血块/血丝。
[0032]
步骤(2)中，鸡血消化的具体过程：使用96孔深孔板进行裂解消化，每个孔内加入血细胞裂解液200μl和蛋白酶k(20mg/ml)20μl，与鸡血样品充分振荡混匀、离心，放入56℃裂解0.5～18h，期间可振荡混匀2～4次。
[0033]
步骤(3)中，dna结合的具体过程：2个待抽提的样品消化板，2个96孔磁珠板(100μl的dna结合液和10μl的磁珠)，2个柱式磁力架，2盒吸头；使用beckman nx
p
的振荡模块先后振荡磁珠板，移液臂将196个样品消化液分别转入对应96孔磁珠板内的对应孔位，高速振荡8min，使dna充分与磁珠接触结合，beckman nx
p
抓手转移磁珠板至磁力架上静置1min，移液臂吸弃废液至样品消化板。
[0034]
步骤(4)中，dna洗涤的具体过程：步骤5的磁珠板，2个柱式磁力架，4盒吸头，4个废液板，2个液槽(分别装有洗涤液i和70％乙醇)；使用beckman nx
p
的移液臂转移600μl洗涤液i至步骤5的磁珠板，振荡洗涤1min，抓手转移磁珠板至磁力架静置20s，待磁珠充分吸附后，转移废液至废液板，重复洗涤wash a一次；使用beckman nx
p
的移液臂转移600μl70％etoh至步骤5的磁珠板，振荡洗涤1min，抓手转移磁珠板至磁力架静置20s，待磁珠充分吸附后，转移废液至废液板，重复洗涤70％etoh一次；抓手转移磁珠板至孵育模块进行56℃烘干2～5min；
[0035]
步骤(5)中，dna洗脱的具体过程：步骤6的磁珠板，2个柱式磁力架，2盒吸头，2个液槽(装有te和gel loading buffer)，2个dna保存板，2个96孔酶标板，2个96孔点样板(用于后续电泳的样品)；使用beckman nx
p
的移液臂转移120μlte至步骤6的磁珠板，高速振荡洗脱15min，抓手转移磁珠板至磁力架静置2～5min，待磁珠充分吸附后，缓慢吸取95μl含dna的上清至dna保存板。
[0036]
步骤(6)中，dna质检的具体过程：转移25μldna至96孔酶标板(已预分装25μl水)，2μldna至96孔点样板(已预分装8μlloading buffer)混匀，酶标板可以直接放入酶标仪检测dna浓度或使用nanodrop8000快速手动检测dna浓度，点样板可使用八通道排枪快速上样电泳。
[0037]
本发明相对于现有技术具有以下优点及效果：
[0038]
本发明试剂成本极低，配制方法简单可控，可在动物生产研究上大规模推广应用。
[0039]
本发明解决了鸡凝血抽提困难、纯度较差、浓度检测不准的问题，提高了鸡血的质量。
[0040]
本发明解决了dna抽提浓度高低差别较大，需进行均一化操作，耗时耗成本，本发明提取的dna浓度均一化程度较高，无需进行单独样品稀释，可直接根据实验要求统一稀释用于下游实验。
[0041]
本发明解决了用于高通量检测的dna需要经过qubit检测，费时费力费成本，而且需要专业人员操作，通过提高dna质量可达到使用nanodrop的紫外分光光度值即可直接用于后续实验。
[0042]
本发明采用全自动化工作站beckman nx
p
，通量最高可以达到每次192个样品。利用该方法抽提的基因组dna纯度、产量、条带完整性均较好，在保证高通量和高效率的前提下，成本大大下降，具有在动物生产研究应用上的推广价值。
附图说明
[0043]
图1为本发明高通量核酸抽提的全自动化工作站布局示意图。
[0044]
图2为实施例2从鸡正常血液提取基因组dna琼脂糖凝胶电泳检测结果。注：m:22120bpmarker，1、2为1μl鸡血dna，2、4为2μl鸡血dna，5、6为3μl鸡血dna，7、8为4μl鸡血dna，9、10为5μl鸡血dna。
[0045]
图3为实施例4从鸡凝血提取基因组dna琼脂糖凝胶电泳检测结果。注：m:22120bpmarker，1、2为1μl鸡凝血dna，3、4为2μl鸡凝血dna，5、6为3μl鸡凝血dna，7、8为5μl正常鸡血dna。
[0046]
图4为本发明核酸抽提流程示意图。
[0047]
图5为本发明提取的鸡血基因组dna的建库效果图。横坐标表示条带的长度，纵坐标表示条带的浓度。sample：样品。
具体实施方式
[0048]
以下通过实施例对本发明内容作进一步阐述，但本发明的实施方式不限于此。
[0049]
实施例1核酸提取试剂盒的效果及结果验证。
[0050]
表1核酸提取试剂盒的配方
[0051]
[0052][0053]
使用本发明的试剂盒对正常鸡血dna提取，试剂盒的配方如表1中实施例1所示，步骤如下：
[0054]
(1)为了在大批量采样的情况下获得正常状态的鸡血，可以通过加大抗凝剂用量以及减少鸡血采集体积两种方式。120μl的edta-2na抗凝剂(15mg/ml，ph4.5～8.0)可有效抗凝1ml鸡血，使用喉头喷雾器将edta-2na抗凝剂喷洒入离心管，得到抗凝管，注入鸡血至抗凝管后，关键在于让鸡血与抗凝剂快速接触混匀。吸取正常鸡血(无凝血/溶血状态)1-5μl至96孔板对应孔内。
[0055]
(2)使用beckman nx
p
工作站进行鸡血消化裂解步骤：添加裂解液200μl，蛋白酶k(20mg/ml)20μl至样品孔内，1000rpm振荡混匀1min，56℃振荡孵育30min，使蛋白质彻底变性。
[0056]
(3)使用beckman nx
p
工作站进行鸡血dna结合步骤：添加结合液100μl，无水乙醇300μl(无水乙醇：裂解液 步骤(1)稀释后的样品＝1：1)，磁珠10μl至样品孔内，1000rpm间
歇振荡8-10min，可利用运作静置时间，交互操作两块样品板，可节省整体操作时间，转移至磁力架上吸附dna，吸弃废液。
[0057]
(4)使用beckman nx
p
工作站进行鸡血dna洗涤步骤：添加洗液i 600μl至样品孔内，1000rpm振荡混匀1min，转移至磁力架上吸附dna1min，吸弃废液，重复以上所有操作一次；添加洗涤液ii 600μl至样品孔内，1000rpm振荡混匀1min，转移至磁力架上吸附dna 1min，吸弃废液，重复以上所有操作一次；可利用运作静置时间，交互操作两块样品板，可节省整体操作时间。56℃干燥样品板2-5min。
[0058]
(5)使用beckman nx
p
工作站进行鸡血dna洗脱步骤：添加te 120μl至样品孔内，1200rpm振荡15min，转移至磁力架静置2～5min，吸取95μl上清至dna保存板，25μl至酶标板，2μl至点样板。
[0059]
(6)dna质检步骤：可直接用酶标仪自动检测酶标板内的dna浓度，亦可以用nanorop8000手动检测dna保存板内的dna，每个样品上样量为2μl。电泳可直接使用已与loading buffer预混好的点样板内的dna进行检测，结果如表2所示。
[0060]
(7)使用beckman nx
p
工作站进行以上高通量禽血核酸抽提方法的台面布局如图1所示。
[0061]
表2实施例1从正常鸡血提取基因组dna浓度、总量及纯度
[0062][0063][0064]
实施例1-4、对比例2-4中步骤(3)中无水乙醇与裂解液 步骤(1)稀释后的样品的体积比均为无水乙醇：裂解液 稀释后的样品＝1：1；对比例1中步骤(3)中无水乙醇与裂解液 步骤(1)稀释后的样品的体积比为无水乙醇：裂解液 稀释后的样品＝3：7；
[0065]
对比例1-4均是使用3ul凝血样品1例(1)，3ul正常血样品2例(2)，提取步骤同上，检测浓度和纯度结果如下表3：
[0066]
表3对比例1-4试剂盒提取的基因组dna浓度、总量及纯度
[0067][0068]
实施例2
[0069]
此方法基于自主研发的dna磁珠法提取试剂盒进行鸡血dna提取，试剂盒的配方如表1中实施例2所示，步骤如下：
[0070]
(1)生产上大规模的采血无可避免地产生了个别凝血的样品。吸取凝血样品的部分流动血液2～5μl至96孔板对应孔内。
[0071]
(2)其余步骤与实施例1均相同。
[0072]
检测结果如表4和图2所示。
[0073]
表4实施例2从鸡凝血样品中提取基因组dna浓度、总量及纯度
[0074][0075][0076]
实施例3
[0077]
此方法基于实施例2进行改进优化提取鸡凝血dna，根据表4的结果，我们发现使用凝血样品的部分流动血提取的dna质量较差，浓度较低，无法满足实验要求，可能原因在于流动血液的主要成分是血浆，血细胞较少，同时可能存在溶血的情况，导致dna遗传少甚至无，对取样步骤进行了改进。
[0078]
具体步骤更改如下：
[0079]
(1)用1ml注射器的针头横截面挑取鸡凝血细头部位的适量血块；
[0080]
(2)其余步骤与实施例2均相同。
[0081]
检测结果如表5所示。
[0082]
表5实施例3从鸡凝血样品中提取基因组dna浓度、总量及纯度
[0083][0084]
实施例4
[0085]
此方法基于实施例3进行改进优化提取鸡凝血dna，根据表5的结果，我们发现使用凝血样品的血块提取的dna浓度有所提升，但浓度、纯度未满足实验需求，可能在于鸡血样品裂解不完全，对消化裂解步骤进行了改进。
[0086]
具体步骤更改如下：
[0087]
(1)步骤1中凝血的取样与实施例3相同，正常血的取样与实施例1相同，其中样品7-4，8-4为正常血液，可正常取样，其余样品1～6为凝血。
[0088]
(2)步骤2加入加强版血细胞裂解液200μl，pk蛋白酶20μl后振荡混匀，放入56℃振荡孵育1h以上，期间振荡2～4次，其余步骤与实施例3均相同。
[0089]
由表1可知，实施例1中鸡血基因组dna的浓度和纯度均尚佳，说明按照此方法提取的正常鸡血dna样品质量好，可满足高通量检测要求。实施例2中提取鸡凝血采用与正常血同样的提取方法，取样类型为凝血中的流动血液，考虑到流动血主要成分为血浆，dna含量少，影响整体提取效果，dna质量较差，且批次重复性较差。在实施例2的基础上，做出对取样类型的调整，取样类型改为用针头挑取适量的凝血部位，dna提取效果有所改善，浓度有较大提高，但纯度仍较差，考虑到凝血相当于组织块，如只是用温和的裂解液可能导致裂解不彻底的情况，故需要先使用加强版血细胞裂解液使蛋白质彻底步变性，试验结果如表6和图3所示，dna浓度、纯度、总量均较好，dna完整性也较好，随着鸡血体积的增加，浓度也呈现梯度增加，可根据实验需要，调整取样体积，获得所需浓度，有助于实现浓度均一化，不管是正常鸡血dna或凝血，用实施例4的方法(操作流程如图4所示)，均能提取较高质量的dna，并且重复性稳定性较好，满足高通量检测要求，效果如图5所示。
[0090]
表6实施例4从鸡凝血/正常血样品中提取基因组dna浓度、总量及纯度
[0091]
[0092]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。