一种裂殖壶菌基因工程菌株、其构建方法及其应用

1.本发明属于基因工程的技术领域，涉及基因重组，具体地说，是一种裂殖壶菌基因工程菌株、其构建方法及其应用。


背景技术：

2.众所周知，含有dha、epa(二十碳五烯酸)等ω-3多不饱和脂肪酸(pufas)的食物被认为有利于促进视网膜和大脑功能发育、降低心血管疾病风险。饱和脂肪酸中的奇链脂肪酸(ocfas，如c17：0和c15：0)，因为具有抗真菌和抗炎的特性而使其商业价值大大提升。
3.裂殖壶菌是一种富含dha(二十二碳六烯酸)等脂肪酸的异养海洋原生生物，因其生长速度快、dha含量丰富、安全认证、易于培养等特点，被广泛应用于科研和商业生产。考虑到ω-3脂肪酸和奇链脂肪酸的巨大效益和消费者日益增长的需求，提高ω-3脂肪酸和奇链脂肪酸占裂殖壶菌总脂肪酸的比例已成为人们关注的重点。
4.脂肪酶是一类具有多种催化功能的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些不溶性酯类水解为游离脂肪酸和丙三醇；水解后的游离脂肪酸可以进入脂肪酸氧化途径，产生能量和乙酰辅酶a供机体使用。目前，市场上的脂肪酶多以饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶为主，且主要是针对c16：0、c14：0和c18：0等偶数链脂肪酸为主，而针对奇数链脂肪酸甘油酯和多不饱和脂肪酸甘油酯的脂肪酶却鲜有报道。
5.裂殖壶菌hx-308中含有80多种脂肪酶基因，裂殖壶菌中的脂肪酸成分同样多种多样，且以dha、dpa(二十二碳五烯酸)、c16：0和c14：0为主。目前对裂殖壶菌脂肪酸的研究主要集中在脂肪酸合成方式上，然而裂殖壶菌脂肪酶对脂质的消耗同样不容忽视。


技术实现要素：

6.本发明的目的，旨在要提供一种裂殖壶菌基因工程菌株，通过敲除奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶和多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶基因(le1和le2)，实现提高基因工程菌株中多不饱和脂肪酸和奇数链脂肪酸产量的目的；
7.本发明的另一个目的，旨在提供上述裂殖壶菌基因工程菌株的一种构建方法，以达到对该菌株简便、快速、有效、精准构建的目标；
8.本发明还有一个目的，旨在提供上述裂殖壶菌基因工程菌株的一种应用，以实现提高多不饱和脂肪酸和奇数链脂肪酸产量的目的。
9.本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：
10.一种裂殖壶菌基因工程菌株，它以裂殖壶菌为出发菌株，敲除奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶基因和多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶基因。
11.作为一种限定，所述奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶基因le1的序列为：
12.atgggggcgattacagccttcgcagcggcgacggccatcgcggcagcgggactcgcgagcgaagcgagggcgcaggatactgtgcgcggactcgaggagatagactttcgcatcgcgcaagaggcatggacgcagatcgaaaacgcgacctacgatgacgagctcgccgtgatgtatgagaatgacagagttcaggtgacaagaacggctgacacgattt
tcgagctcggaaactcgctgtgctggatcgtttccgaggagaccaacgatgccgaggactggatcgacaatctcgatttcggacaaacgaagatcttgtccgtggaagaaggcgagaacgagagtggctcgccttccgaggagtgcggatgcgctttttccttgttcgggtggtgcctcaagtacaacacctgcgacgacgagtcgaatggcagctacaaaacacttggcaagggatattccggctttgtcaacgcctacaatggtctgcgccatgatgtgtgggagcgcgtaaaggacgtctgcgacatggaaaacgatgtgctcatgatcgccggctactctcgcggtggcgccctcgccaacctctttggttttgcagtctattcagaaggcctttgggaccccgagcgaatggcttcaatcacctttggatccccacgcgtccttgtcaacaatgatagcgacaacgtgcacagtcagtactaccagcttcgcctcgtgtaccgtgacgacccagttcctgcctttcccatgaacaactttggttttgagcactttggcgagatgcactgcttcgagtgccagtaccaggaatcgcgtgacgccccttcaagtcttcagttattgtatggtaccgatgtcgatgaccacaccagctacaatgaatggttcgactaa。
13.作为另一种限定，所述多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶基因le2的序列为：
14.atgagcctttgctcttgctactatgttttctgctgctttatgtgctgcagctacgctcgctgtgcgagcagaacctccattcgcggtgtcctccgtcttggcatggcgtggaaatttctcgttggcctcctcatctacaccatcttctttgccctgctcgaggaggtcttcaacttcaactgtagccttgtgccgtttgtcggcatgttgagcgttcttcgcgtctgcactacttccgatgagaacggcgatctctactgctcgatggatgtgtatcctaccgcctttcgtcgcgcaatcggcgttaccgtcctctttgtcctcgaaatctcaatcttttggtacattggtcgcacctcgaaaagggttcatcagcgaattgcggcaattccgtatgccctcaatcggtacaattacctcagtgtgacctttactcaagctactatttcgcttttctggacacttatttttctccttggtgtactggaaacatgcgttccaagtgtttctgtcaacattcaacgtccgatggtgaatatcaccgcggatggattgctcgatagcgtgtatctcgagacggaccccctttatatggtaggcattacttcatcggcagtcaccttttcatgccttggcgtttgctttacagcttgggttctcatcatggcgtatgcgtggcttcctgcagactcgacccggatccggggatggttccttggtcttccttcgaggccgggcccaatgactgggattgcaacacaggaagcgcacaatccatcgcatcagcatgttctcaatccatttgacatgatcaaaagcgagagcctcgaaattattctcgagcgttactttgacgagaatccagttctcatttctagagagcgccgcttccgcaaagtattcatgcagcagctcagcactgctccgaaaccaaagctccggaagagccaaatgatgctcttgcaggccacgggcatctcctcgcgcattctcttcgagaacccagttcctgagcctcccacgccaatgactgccggcacagcaaatgaggccgatggcgaggagaattacctcgagagttctgagactcgtcaggtctacgctgactcggccgtgtcactcgcgagtaaccgctctagccgccttcgcacgatccagcgtcagcttttaagccacgtctgcgtcatcgagacagagattgccctctttaactttgctgcgctcgcatacaaggttggaaacgaagcatgggcgactcctcccccggagcaatctgaactggttgcctccgctccagagtacaagcttctgcggcacattgttgacgaaaagcttgatactcacgtcatcgtcgccaagagcgcagaccgcatcatcatctcctttcgtggcaccgtttcttcgctcaacgtggacaccgactttgactggaagctcgaacgatatgatcaggcctgcgaagtcgagccattgccgagcacgaccccgcgtgagcgcttctggagcgaaaaggaacccacggtgcatcgcggttttcaaattgcatatgccggagtgagagaggcattgcacgaactcgttgacccgctcatttccccgcgaattggacctgacggaaggcttcgacagcgtcgcgcagttctctgctcgggtcactccctgggtggtgcacttgctgttatctgtgcctttgactttgcctgctatctcgactcggtcctgtccgattctgaaagacctgcggtgggttgcactacatttggctgtccacgcatcggctcgtactcctttctcatgcgctatcgtcgcatggtgccctccacgaagcgattcgttctcgcaagcgacatcattcccaagacgcccccacgcttattcaagggccaatacgctggctaccatcacattggcactgaatttttgctggacctcaatggaaaccttctcatttctccgcacatggttgagcgcgcgatattgcatggccttcgaagcgtcaagtcgcgtatgcactttgcctctctgtacactcttgccctcgcgctgtggtgctcacgcatgaagattgaacctgatctctgggtggtccacattacagatacgttgaaatacgccaaggcagacattcttagccggcacgaagagctttttcgcgcctcctataatatcttcaatagagagggtgtaatttacgac
cttaatgtggcgccacgacgcaacattgggatccaggtcgaccccgaggaagtttccgagcacgaagaggaagtcaagccttttatgccgcgacatcgctcggcccccgttcgtctttcgtccacggaagcgacacgactcgatcaggctctcaactttgcaattagcacccacggggagcgcgacccgagcaccctcacgctggaccagctgcgctcgctgcggatccttgtaaaggcgacggcggagcaccggccgcacctataa。
15.本发明还提供了上述裂殖壶菌基因工程菌株的一种构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
16.s1.构建重组质粒pbs-zeo-le1
17.克隆来源于裂殖壶菌hx-308的奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶基因le1的上游和下游片段，通过基因同源重组技术将该基因插入pbs-zeo质粒中，构建得敲除载体pbs-zeo-le1；
18.s2.构建重组质粒pbs-zeo-le2
19.克隆来源于裂殖壶菌hx-308的多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶基因le2的上游和下游片段，并通过基因同源重组技术将该基因插入pbs-zeo质粒中，构建敲除载体pbs-zeo-le2；
20.s3.构建裂殖壶菌基因工程菌株
21.利用电转化法将线性化后的重组质粒pbs-zeo-le1和pbs-zeo-le2电转导入裂殖壶菌hx-308，即得所述裂殖壶菌基因工程菌株。
22.本发明还提供了上述裂殖壶菌基因工程菌株的一种应用，所述裂殖壶菌基因工程菌株通过发酵生产奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸。
23.作为一种限定，所述发酵生产的方法为，将所述裂殖壶菌基因工程菌株活化后，得发酵用菌种，将发酵用菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集菌体提取奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸。
24.作为进一步限定，所述活化是将裂殖壶菌基因工程菌株接种于种子培养基中，连续培养三次。
25.作为更进一步限定，所述培养是在25～30℃，150～250r/min振摇培养的条件下进行的。
26.作为进一步限定，所述收集菌体提取奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸的方法包括依次进行的以下步骤：
27.s1.向发酵培养结束后的发酵液中加入naoh溶液将ph值调至11～14，加入破壁酶，于40～60℃，100～200r/min条件下振荡5～15h，得液体x；
28.s2.将液体x冷却至20～30℃后，加入与液体x等体积的无水乙醇，得液体y；
29.s3.液体y中加入正己烷萃取，收集上层有机相，重复提取3～5次，合并有机相，蒸发溶剂，得到含奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸的油脂。
30.由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
31.①
本发明使用的schizochytrium sp.hx-308菌株，是一种安全认证的产油菌株，可在胞内生成大量的油脂，可以为奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸的生产提供稳定的胞内环境；
32.②
本发明构建的裂殖壶菌基因工程菌株，在裂殖壶菌转化系统的基础上，采用电转的基因转化方式，构建了在裂殖壶菌中敲除奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)和多不饱和脂肪酸甘油酯的脂肪酶(le2)基因的裂殖壶菌工程菌株，获得的菌株具有多次传代的遗
传稳定性；
33.③
本发明在裂殖壶菌脂质利用途径代谢通路上，选择了敲除奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)和多不饱和脂肪酸甘油酯的脂肪酶(le2)，增强了ocfas或者pufas的积累，这为该菌株工业化定向合成ocfas或者pufas提供了基础；
34.④
本发明的构建方法可以简便、快速、高效、精准地构建产ocfas或者pufas的裂殖壶菌基因工程菌株；
35.本发明适用于构建产奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸的裂殖壶菌基因工程菌株，构建出的裂殖壶菌基因工程菌株在提高奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸生物合成量的同时，还可以减少偶数链脂肪酸的产量。
附图说明
36.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
37.在附图中：
38.图1为本发明实施例1和2中裂殖壶菌le1基因和le2基因片段的电泳图；
39.图2为本发明实施例3和4中构建裂殖壶菌le1基因和le2基因上游和下游片段的电泳图；
40.图3为本发明实施例5中构建大肠杆菌奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)基因敲除载体示意图；
41.图4为本发明实施例6中构建大肠杆菌多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因敲除载体示意图；
42.图5为本发明实施例8中schizochytrium sp.hx-308野生型菌株与敲除脂肪酶(le1)基因工程菌的脂肪酸含量图；
43.图6为本发明实施例8中schizochytrium sp.hx-308野生型菌株与敲除脂肪酶(le2)基因工程菌的脂肪酸含量图。
44.图7为本发明实施例8中schizochytrium sp.hx-308野生型菌株与过表达脂肪酶(le)基因工程菌的脂肪酸含量图。
具体实施方式
45.本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件；
46.下述各实施例中采用的培养基如下：
47.平板培养基的ph为6.6，且该培养基成分为：琼脂15g/l，葡萄糖40g/l，酵母浸粉10g/l，硫酸钠10g/l，硫酸镁2g/l，硫酸铵6g/l，氯化钾1g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.6g/l，磷酸二氢钾1g/l，谷氨酸钠10g/l，0.1％的微量矿物质(由七水合硫酸锌3g/l，六水合氯化钴0.05g/l，五水合硫酸铜5g/l，六水合硫酸镍1g/l，七水合硫酸铁10g/l，泛酸钙4g/l，四水合氯化锰5g/l和二水合钼酸钠0.04g/l组成)，维生素b6 5 mg/l、维生素b12 0.5 mg/l；
48.种子液的种子培养基的ph为6.6，且该培养基成分为：葡萄糖50g/l，酵母浸粉5g/l，硫酸钠5g/l，硫酸镁2g/l，硫酸铵6g/l，氯化钾1g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.6g/l，磷酸
二氢钾1g/l，谷氨酸钠10g/l，0.1％的微量矿物质，维生素b6 5 mg/l、维生素b12 0.5 mg/；
49.发酵培养基的ph值为6.0，且该培养基成分为：葡萄糖80g/l，酵母浸粉10g/l，硫酸钠10g/l，硫酸镁2g/l，硫酸铵6g/l，氯化钾1g/l，氯化钙0.1g/l，硫酸钾0.6g/l，磷酸二氢钾1g/l，谷氨酸钠20g/l，0.1％的微量矿物质(由七水合硫酸锌3g/l，六水合氯化钴0.05g/l，五水合硫酸铜5g/l，六水合硫酸镍1g/l，七水合硫酸铁10g/l，泛酸钙4g/l，四水合氯化锰5g/l和二水合钼酸钠0.04g/l组成)，维生素b6 5 mg/l、维生素b12 0.5 mg/l。
50.下面将结合实施例作进一步详细说明。
51.实施例1裂殖壶菌奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)基因的克隆
52.根据裂殖壶菌奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)基因的序列信息：
53.atgggggcgattacagccttcgcagcggcgacggccatcgcggcagcgggactcgcgagcgaagcgagggcgcaggatactgtgcgcggactcgaggagatagactttcgcatcgcgcaagaggcatggacgcagatcgaaaacgcgacctacgatgacgagctcgccgtgatgtatgagaatgacagagttcaggtgacaagaacggctgacacgattttcgagctcggaaactcgctgtgctggatcgtttccgaggagaccaacgatgccgaggactggatcgacaatctcgatttcggacaaacgaagatcttgtccgtggaagaaggcgagaacgagagtggctcgccttccgaggagtgcggatgcgctttttccttgttcgggtggtgcctcaagtacaacacctgcgacgacgagtcgaatggcagctacaaaacacttggcaagggatattccggctttgtcaacgcctacaatggtctgcgccatgatgtgtgggagcgcgtaaaggacgtctgcgacatggaaaacgatgtgctcatgatcgccggctactctcgcggtggcgccctcgccaacctctttggttttgcagtctattcagaaggcctttgggaccccgagcgaatggcttcaatcacctttggatccccacgcgtccttgtcaacaatgatagcgacaacgtgcacagtcagtactaccagcttcgcctcgtgtaccgtgacgacccagttcctgcctttcccatgaacaactttggttttgagcactttggcgagatgcactgcttcgagtgccagtaccaggaatcgcgtgacgccccttcaagtcttcagttattgtatggtaccgatgtcgatgaccacaccagctacaatgaatggttcgactaa
54.分别设计如seq id no.1和seq id no.2所示的引物p1和p2，以schizochytrium sp.hx-308基因组为模版，分别用引物p1/p2、primerstar高保真聚合酶，通过pcr对奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)进行扩增，得到奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)片段；
55.pcr扩增的程序为：94℃，30s；55℃，30s；70℃，40s；进行33个循环后，对pcr产物进行纯化，并使用琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图1所示，由图1可知，奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶le1被成功克隆。
56.seq id no.1 p1(sense)：atgggggcgattacagcct
57.seq id no.2 p2(antisense)：ttagtcgaaccattcattg
58.实施例2裂殖壶菌多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因的克隆
59.根据裂殖壶菌多不饱和脂肪酸甘油酯的脂肪酶(le2)基因的序列信息：
60.atgagcctttgctcttgctactatgttttctgctgctttatgtgctgcagctacgctcgctgtgcgagcagaacctccattcgcggtgtcctccgtcttggcatggcgtggaaatttctcgttggcctcctcatctacaccatcttctttgccctgctcgaggaggtcttcaacttcaactgtagccttgtgccgtttgtcggcatgttgagcgttcttcgcgtctgcactacttccgatgagaacggcgatctctactgctcgatggatgtgtatcctaccgcctttcgtcgcgcaatcggcgttaccgtcctctttgtcctcgaaatctcaatcttttggtacattggtcgcacctcgaaaagggttcatcagcgaattgcggcaattccgtatgccctcaatcggtacaattacctcagtgtgacctttactcaagctactatttcgcttttctggacacttatttttctccttggtgtactggaaacatgcgttccaagtgtttctgtcaacattcaacgtccgatggtgaatatcaccgcggatggattgctcgatagcgtgtatctcgagacggaccccctttatatggtaggcattacttc
atcggcagtcaccttttcatgccttggcgtttgctttacagcttgggttctcatcatggcgtatgcgtggcttcctgcagactcgacccggatccggggatggttccttggtcttccttcgaggccgggcccaatgactgggattgcaacacaggaagcgcacaatccatcgcatcagcatgttctcaatccatttgacatgatcaaaagcgagagcctcgaaattattctcgagcgttactttgacgagaatccagttctcatttctagagagcgccgcttccgcaaagtattcatgcagcagctcagcactgctccgaaaccaaagctccggaagagccaaatgatgctcttgcaggccacgggcatctcctcgcgcattctcttcgagaacccagttcctgagcctcccacgccaatgactgccggcacagcaaatgaggccgatggcgaggagaattacctcgagagttctgagactcgtcaggtctacgctgactcggccgtgtcactcgcgagtaaccgctctagccgccttcgcacgatccagcgtcagcttttaagccacgtctgcgtcatcgagacagagattgccctctttaactttgctgcgctcgcatacaaggttggaaacgaagcatgggcgactcctcccccggagcaatctgaactggttgcctccgctccagagtacaagcttctgcggcacattgttgacgaaaagcttgatactcacgtcatcgtcgccaagagcgcagaccgcatcatcatctcctttcgtggcaccgtttcttcgctcaacgtggacaccgactttgactggaagctcgaacgatatgatcaggcctgcgaagtcgagccattgccgagcacgaccccgcgtgagcgcttctggagcgaaaaggaacccacggtgcatcgcggttttcaaattgcatatgccggagtgagagaggcattgcacgaactcgttgacccgctcatttccccgcgaattggacctgacggaaggcttcgacagcgtcgcgcagttctctgctcgggtcactccctgggtggtgcacttgctgttatctgtgcctttgactttgcctgctatctcgactcggtcctgtccgattctgaaagacctgcggtgggttgcactacatttggctgtccacgcatcggctcgtactcctttctcatgcgctatcgtcgcatggtgccctccacgaagcgattcgttctcgcaagcgacatcattcccaagacgcccccacgcttattcaagggccaatacgctggctaccatcacattggcactgaatttttgctggacctcaatggaaaccttctcatttctccgcacatggttgagcgcgcgatattgcatggccttcgaagcgtcaagtcgcgtatgcactttgcctctctgtacactcttgccctcgcgctgtggtgctcacgcatgaagattgaacctgatctctgggtggtccacattacagatacgttgaaatacgccaaggcagacattcttagccggcacgaagagctttttcgcgcctcctataatatcttcaatagagagggtgtaatttacgaccttaatgtggcgccacgacgcaacattgggatccaggtcgaccccgaggaagtttccgagcacgaagaggaagtcaagccttttatgccgcgacatcgctcggcccccgttcgtctttcgtccacggaagcgacacgactcgatcaggctctcaactttgcaattagcacccacggggagcgcgacccgagcaccctcacgctggaccagctgcgctcgctgcggatccttgtaaaggcgacggcggagcaccggccgcacctataa
61.分别设计如seq id no.3和seq id no.4所示的引物p3和p4，以schizochytrium sp.hx-308基因组为模版，分别用引物p3/p4、primerstar高保真聚合酶，通过pcr对多不饱和脂肪酸甘油酯的脂肪酶(le2)进行扩增，得到多不饱和脂肪酸甘油酯的脂肪酶(le2)片段；
62.pcr扩增的程序为：94℃，30s；55℃，30s；70℃，60s；进行33个循环后，对pcr产物进行纯化，并使用琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图1所示，由图1可知，多不饱和脂肪酸甘油酯的脂肪酶le2被成功克隆。
63.seq id no.3p3(sense)：atgggggcgattacagcct
64.seq id no.4p4(antisense)：ttagtcgaaccattcattg
65.实施例3裂殖壶菌奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)基因上游和下游片段的克隆
66.根据裂殖壶菌脂肪酶(le1)基因的序列信息，设计分别如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7和seq id no.8所示的引物p5、p6、p7和p8，下划线部分分别为酶切位点nhe i和xbai以及ncoi和bmahi，以schizochytrium sp.hx-308基因组为模版，用引物p5/p6、p7/p8、primerstar高保真聚合酶，通过pcr对奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)基因上
游和下游片段进行扩增，得到脂肪酶(le1)基因上游和下游片段；
67.le1基因上游(up)基因序列：
68.gagatttcgattttgagttttattttgatgacgacgacaacgactatgatgatgatgatgatgatgatgatgacaacgatggcaacactcacttcagcggtgtgcagaagaaagtggatcgatgggacgaccttacaaacgactacgagagtggagaacttctccacagtggtcgcttccacgatattgaggccgttgccgacgaaatgattgaaaagtaccctgagcttcttgaggctgcaatccgacccgccgaaccaggacgcatcgattcaaaggatctggaaaatctgaattgggaagcaatttccggcgatgacgacacatgggaccaggccttgaccacctttaagaaaacgtccccgttaacactcagcaaagaagaagacaatgacggtacggcttgggaagaagaattcgacgagggcgatctcgaattcatgcaagaaatcaacgacactttcgttaacttgcacaggttggaaagagatctaaagttcgatggatctccggatgcttcaaaggacaaagagaccagagaagaacccgagtctccacaattgccagcggacggagtgaaaaagctgctgcaacgcgctttggatggggagattcccttgacacacgatagtttgcaacgtgccgtccgtgtgctcgtcgatgcaggtttcccagcactatcgaatatgtccatgtacagtcgcgccgaagttgaaattcttaatgacgcgcagctcaagcttctcttgaagcttgccttgccccatgtc
69.le1基因下游(down)基因序列：
70.atggaggatccctttgtgcagcagcaggaagctctcctgcgtcgtatcacgaactcggccgagcgtctcgccgaggtggtcgaggaggtgaacggcgagctccaacacgctgaggcttcttatgcgcagattgaaaaggcgcatgctgtgtggaagctgtacgagaccaagatgcaaaagcctggcgctggagggaaacctggtgtaccacccgagaagatcgacgcaatggacaacgcagagcagccggacgatagccccgtcgagacaattgagggcgacgaggtcacagtctttgtgaatggactcttcaaccccaaggacgaggccacgtggaccgccaataaggccaaactcctcgacatcttcggatgtcctgctgtgcacattcacaatcccacgctcgcgagagatattccccacgaacgtgtcacgagccttgtgcggaaaaatgccggcctcgcctttggcgctgcgctcatggccgccgccgccgtggccgtcgactcgtacctggacacaggctacagggaacgcgtcattgctacctccatggatggcattcgttcccagctcgaaccg
71.pcr扩增的程序为：94℃，30s；55℃，30s；70℃，30s，进行32个循环后，对pcr产物进行纯化，并使用琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图2所示，由图2可知，奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶le1基因上游和下游片段被成功克隆。
72.seq id no.5p5(sense)：gcgtctagagagatttcgattttgag
73.seq id no.6p6(antisense)：gcggctagcgacatggggcaaggcaagc
74.seq id no.7p7(sense)：atgccatggatggaggatccctttgtgcag
75.seq id no.8p8(antisense)：cgcggatcccggttcgagctgggaacg
76.实施例4裂殖壶菌多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因上游和下游片段的克隆
77.根据裂殖壶菌多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因的序列信息，设计分别如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11和seq id no.12所示的引物p9、p10、p11和p12，下划线部分分别为酶切位点nhe i和xbai以及ncoi和bmahi，以schizochytrium sp.hx-308基因组为模版，用引物p9/p10、p11/p12、primerstar高保真聚合酶，通过pcr对多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因上游和下游片段进行扩增，得到脂肪酶(le2)基因上游和下游片段；
78.le2基因上游(up)基因序列：
79.cgtacaccccaaccaaggccgtccaggacgagatcgaaaagcggaaaaaggaggacgaggaggcgcgcg
agcaggccaaaaaggatgtcagcgcgcgcatgaagaagcttgccggtactggtggacaagcgcctggcttcagcacggcgcaacttggggcgcagatcgctgccgtgacaaagtccgccggaagcgacaagcgtaataagaacggcggactctccgtcaaagcgatcgccaaagctgccggtgatgatgacgacgaggacgaggacgatgacgacgaggacaacgacaaataacgtacaccccaaccaaggccgtccaggacgagatcgaaaagcggaaaaaggaggacgaggaggcgcgcgagcaggccaaaaaggatgtcagcgcgcgcatgaagaagcttgccggtactggtggacaagcgcctggcttcagcacggcgcaacttggggcgcagatcgctgccgtgacaaagtccgccggaagcgacaagcgtaataagaacggcggactctccgtcaaagcgatcgccaaagctgccggtgatgatgacgacgaggacgaggacgatgacgacgaggacaacgacaaataa
80.le2基因下游(down)基因序列：
81.caaaatcgagacggccgcgaaaagcaacgcccaagcgggccaccagcacaaccagcacaagagaaagaaggtgaccaattcgcggaacaaaggcgtcgtccgaaagaccgccgtagcgcccagccaagtgcagggcgccgtgccctttgacctcatggacgctcgcggcaaaatcgaggctttgctaaaggggatccacgccgtcgagaccgcccgatcggatcccgttctcggcgaacgaatcccgctttcctcttctcatgaacatgaattccaactcccagccaccgtctgcgagctctccagaatggcgcgcccagacctcgagcgcgcctgtgtgcagctcaagattactgactttcatgccaaacccgaccgcgacctcatcgccctcatcgcgctccgtggcccgtacggcaaggatggtaagatgtacgccgtccgaaaggtccgcgaactcgtgcaatccgtggactgtctgctgcgtgagattggcctcgtgcgccctgacggccctgccgttgtcgatattctcgacgcgagattcaagaacctaaaacgcgccaa
82.pcr扩增的程序为：94℃，30s；55℃，30s；70℃，30s，进行32个循环后，对pcr产物进行纯化，并使用琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图2所示，由图2可知，多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶le2基因上游和下游片段被成功克隆。
83.seq id no.9p9(sense)：gcgtctagacgtacaccccaaccaagg
84.seq id no.10p10(antisense)：gcggctagcttatttgtcgttgtcctcgt
85.seq id no.11p11(sense)：atgccatggcaaaatcgagacggccgcg
86.seq id no.12p12(antisense)：cgcggatccttggcgcgttttaggttct
87.实施例5敲除载体pbs-zeo-le1的构建
88.本实施例提供一种敲除载体pbs-zeo-le1的构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
89.s1.酶切反应
90.用限制性内切酶nhei和xbai分别于30℃水浴条件下双酶切载体质粒pbs-zeo和pcr纯化产物奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)基因上游，酶切反应3h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳回收；
91.50μl的酶切体系包括：2μl nhei，2μl xbai，5μl 10x loading buffer，20μl质粒，21μl ddh2o；
92.s2.连接反应
93.用gibson组装酶切后的载体pbs-zeo片段和裂殖壶菌奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)基因上游片段连接，得到重组敲除载体pbs-zeo-le1a；
94.25μl的连接体系包括：2μl目的基因片段，1μl载体酶切后片段，2.5μl连接酶buffer，19.5μl ddh2o，50℃连接2h；
95.s3.连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞
96.s31.在无菌状态下取100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞，加入20μl连接产物重组敲
除载体pbs-zeo-le1a混匀，冰上放置30min，于42℃条件下热激90s后，迅速放置冰上2min，得混合体系β；
97.s32.向混合体系β中加入900μl lb培养基，于37℃，180r/min条件下孵育1h，得混合体系γ；
98.s33.取200μl混合体系γ涂布于含100μg/ml zeo抗性lb平板上，于37℃条件下倒置培养12h；
99.s34.对s33中菌落进行pcr确认结果，挑选阳性转化子，提取质粒，进行测序，测序验证结果表明连接成功，获得敲除载体pbs-zeo-le1a；
100.s4.用限制性内切酶ncoi和bmahi分别于30℃水浴条件下双酶切载体质粒pbs-zeo-le1a和pcr纯化产物奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)基因下游片段，酶切反应3h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳回收；
101.50μl的酶切体系包括：2μl nhei，2μl xbai，5μl 10x loading buffer，20μl质粒，21μl ddh2o；
102.s5.用gibson组装酶切后的载体pbs-zeo-le1a片段和裂殖壶菌奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)基因下游片段连接，得到重组敲除载体pbs-zeo-le1；
103.25μl的连接体系包括：2μl目的基因片段，1μl载体酶切后片段，2.5μl连接酶buffer，19.5μlddh2o，50℃连接2h；
104.s6.连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞
105.s61.在无菌状态下取100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞，加入20μl连接产物重组敲除载体pbs-zeo-le1混匀，冰上放置30min，于42℃条件下热激90s后，迅速放置冰上2min，得混合体系δ；
106.s62.向混合体系δ中加入900μl lb培养基，于37℃，180r/min条件下孵育1h，得混合体系ε；
107.s63.取200μl混合体系ε涂布于含100μg/ml zeo抗性lb平板上，于37℃条件下倒置培养12h；
108.s64.对s63中菌落进行pcr确认结果，挑选阳性转化子，提取质粒，进行测序，测序验证结果表明连接成功，获得敲除载体pbs-zeo-le1，如图3所示。
109.实施例6敲除载体pbs-zeo-le2的构建
110.本实施例提供一种敲除载体pbs-zeo-le2的构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
111.s1.酶切反应
112.用限制性内切酶nhei和xbai分别于30℃水浴条件下双酶切过表达载体质粒pbs-zeo和pcr纯化产物多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因片段，酶切反应3h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳回收；
113.50μl的酶切体系包括：2μl nhei，2μl xbai，5μl 10x loading buffer，20μl质粒，21μl ddh2o；
114.s2.连接反应
115.用gibson组装酶切后的载体pbs-zeo片段和裂殖壶菌多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因上游片段连接，得到重组敲除载体pbs-zeo-le2a；
116.25μl的连接体系包括：2μl目的基因片段，1μl载体酶切后片段，2.5μl连接酶buffer，19.5μl ddh2o，50℃连接2h；
117.s3.连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞
118.s31.在无菌状态下取100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞，加入20μl连接产物重组敲除载体pbs-zeo-le2a混匀，冰上放置30min，于42℃条件下热激90s后，迅速放置冰上2min，得混合体系ζ；
119.s32.向混合体系ζ中加入900μl lb培养基，于37℃，180r/min条件下孵育1h，得混合体系η；
120.s33.取200μl混合体系η涂布于含100μg/ml zeo抗性lb平板上，于37℃条件下倒置培养12h；
121.s34.对s33中菌落进行pcr确认结果，挑选阳性转化子，提取质粒，进行测序，测序验证结果表明连接成功，获得敲除载体pbs-zeo-le2a；
122.s4.用限制性内切酶ncoi和bmahi分别于30℃水浴条件下双酶切载体质粒pbs-zeo-le2a和pcr纯化产物多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因下游片段，酶切反应3h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳回收；
123.50μl的酶切体系包括：2μl nhei，2μl xbai，5μl 10x loading buffer，20μl质粒，21μl ddh2o；
124.s5.用gibson组装酶切后的载体pbs-zeo-le2a片段和裂殖壶菌多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因下游片段连接，得到重组敲除载体pbs-zeo-le2；
125.25μl的连接体系包括：2μl目的基因片段，1μl载体酶切后片段，2.5μl连接酶buffer，19.5μl ddh2o，50℃连接2h；
126.s6.连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞
127.s61.在无菌状态下取100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞，加入20μl连接产物重组敲除载体pbs-zeo-le2混匀，冰上放置30min，于42℃条件下热激90s后，迅速放置冰上2min，得混合体系θ；
128.s62.向混合体系θ中加入900μl lb培养基，于37℃，180r/min条件下孵育1h，得混合体系φ；
129.s63.取200μl混合体系φ涂布于含100μg/ml zeo抗性lb平板上，于37℃条件下倒置培养12h；
130.s64.对s63中菌落进行pcr确认结果，挑选阳性转化子，提取质粒，进行测序，测序验证结果表明连接成功，获得敲除载体pbs-zeo-le2，如图4所示。
131.实施例7敲除奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)和多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因的裂殖壶菌基因工程菌株的构建
132.本实施例提供一种敲除奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶(le1)和多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶(le2)基因的裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
133.s1.裂殖壶菌感受态细胞的制备
134.s11.挑取平板上已活化好的schizochytrium sp.hx-308裂殖壶菌单菌落至50ml种子培养基中，于28℃，170r/min条件下摇床培养24h，重复培养三次，得菌液ⅰ；
135.s12.取25ml菌液ⅰ，于25℃，4000rpm条件下离心2min，弃上清，得菌体ⅱ；
136.s13.使用25ml的预处理液(将20mm dtt和0.1m cacl2溶于ph为6.5的tris-hcl缓冲液制备而成)重悬菌体ⅱ，轻微震荡以使细胞壁松散；
137.于4℃，4000rpm条件下离心2min，用25ml无菌水洗涤离心后的菌体两次，于4℃，4000rpm条件下离心2min，用1m的无菌预冷山梨醇溶液(含0.1m cacl2)洗涤菌体两次，得裂殖壶菌感受态细胞；
138.s14.用200μl浓度为1m的无菌预冷山梨醇溶液(含0.1m cacl2)重悬裂殖壶菌感受态细胞，分装于1.5ml的无菌离心管，每管100μl，冰上备用；
139.s2.裂殖壶菌电转化
140.s21.分别将10μl线性化后的重组敲除载体pbs-zeo-le1和敲除载体pbs-zeo-le2加入100μls14中制备的裂殖壶菌感受态细胞中，混匀后转移至预冷的电转杯，冰上静置30min，于2kv条件下施以一个脉冲的电击；
141.s22.向电转杯加入1ml预冷的含1m山梨醇的种子培养基，混匀后转移至含1m山梨醇的种子培养基，于28℃，180rpm条件下培养3h，得菌液ⅲ；
142.s23.取菌液ⅲ涂板，于28℃条件下培养3天，得菌落ⅳ；
143.s3.裂殖壶菌基因工程菌株的筛选
144.s31.挑取菌落ⅳ接种至含50mg/l博莱霉素的种子培养基中，于28℃，180rpm条件下培养24h；
145.s32.传代5次保证过表达载体稳定遗传，每一代都重复步骤s31中描述实验；
146.s33.稳定遗传的菌株为所述敲除奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶和多不饱和脂肪酸甘油酯的脂肪酶的裂殖壶菌基因工程菌株，保藏于-80℃的冰箱。
147.实施例8基因工程菌株脂质中ocfa和pufa的测定
148.本实施例为过表达酰基-acp硫脂酶基因te的裂殖壶菌基因工程菌株脂质中epa含量的测定实验，包括依次进行的以下步骤：
149.s1.发酵种子培养
150.分别将裂殖壶菌野生型菌株schizochytrium sp.hx-308、工程菌pbs-zeo-le1、工程菌pbs-zeo-le2和敲除奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶和多不饱和脂肪酸甘油酯的脂肪酶的裂殖壶菌基因工程菌株与经抗性平板培养后，挑取单菌落接种于250ml锥形瓶(含种子培养基50ml)中，于28℃，180r/min条件下摇床培养24h后为一级种子，取1ml一级种子培养液接种于250ml锥形瓶(含种子培养基50ml)中，于28℃，180r/min条件下摇床培养24h为二级种子，取1ml二级种子培养液接种于250ml锥形瓶(含种子培养基50ml)中，于28℃，180r/min条件下摇床培养24h为三级种子，作为发酵用菌种；
151.s2.摇瓶发酵培养
152.分别取10ml基因工程菌株和裂殖壶菌野生型菌株schizochytrium sp.hx-308的三级种子培养液接种于500ml锥形瓶(含发酵培养基90ml)中，于28℃，180r/min条件下摇床培养120h，每隔24h取样测量ocfa和pufa的比例；
153.s3.收集菌体提取脂质
154.向发酵培养结束后的发酵液中分别加入naoh溶液调ph为12，加入0.2％的破壁酶，于50℃，180r/min条件下振荡10h，冷却至室温后，加入等体积无水乙醇使破壁酶失活，加入
正己烷萃取，收集上层有机相，进行气相检测，分析脂肪酸，结果如图5、图6、图7所示；
155.由图5、图6、图7可知，通过本发明的方法获得的裂殖壶菌基因工程菌株具有多次传代遗传稳定性；总ocfa或pufa的比例分别有大幅提升，相比于野生型菌株ocfa和pufa占比分别为2％和60％，工程菌pbs-zeo-le1中ocfas的比例达到20％，工程菌pbs-zeo-le2中pufas的比例达到75％，而工程菌pbs-zeo-le1 le2中ocfas和pufas的比例分别是13.7％和71.3％，是野生型的8.05和1.14倍。因此利用此方法构建的基因工程菌株及构建方法为后续理论研究和工业化生产奠定了有力的基础。
156.以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。