用于递送核酸的阳离子脂质化合物和组合物及用途的制作方法

1.本发明涉及脂质递送载体领域，是一类阳离子脂质化合物，与其他脂质成分结合后能够形成可载药的纳米脂质颗粒，从而在体外和体内实现细胞外向细胞内递送核酸。具体的说，本发明涉及用于递送核酸的阳离子脂质化合物和组合物及用途。


背景技术：

2.核酸药物通过将外源基因导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断或修正特定基因，以达到治疗和预防疾病的目的。其研发生产工艺相对简单，具有研发周期短、临床开发成功率高、改良可塑性更好等优势。核酸疫苗在近几年作为预防covid-19的主力军之一，也已经证明了它在市场的巨大潜力。
3.但是裸mrna在体内循环时间短、易被降解，且难以进入靶细胞或者靶组织。因此提高mrna药物的体内递送效率，是提高该类产品有效性的关键方向之一。
4.目前，应用最广的核酸药物的递送载体是脂质纳米颗粒，它具有提高基因药物疗效以及靶向递送作用等特点，可以保护核酸在体内不被迅速降解，延长循环时间，增强靶向递送。它由2~4个脂质组分组成，包括阳离子脂质化合物、0~2种辅助脂质和0~1种peg脂质构成。其中阳离子脂质化合物在核酸包载和释放中起关键作用，因此研发新型、高效、低毒的阳离子脂质化合物至关重要。


技术实现要素：

5.本发明提供了一类含硫的阳离子脂质化合物，包括其药物可接受的盐和其立体异构体或互变异构体。其主要用途是与其他脂质组分以特定比例联合使用，以形成用于递送预防或治疗剂（如治疗性核酸）的脂质纳米颗粒。
6.本发明的另一目的是提供该类脂质化合物的合成方法，使用原料易得、采用条件温和的反应路线、产品产率高、仪器设备要求低且操作简单。
7.在一些实例中，治疗性核酸包括质粒dna、信使rna、反义寡核苷酸(ason)、微小rna (mirna)、干扰rna(micrna)、dicer底物rna、互补dna(cdna)。
8.同时本发明还提供了此类阳离子脂质化合物与其他脂质组分联合使用时的制剂配比以及使用方法，以及在细胞和动物模型中的应用。
9.在本发明的实施方案中，采用的是具有如下式(i)结构的阳离子脂质化合物：（i）或其药物可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其特征在于：
l1、l2为连接键或二价连接基，所述二价连接基各自独立地选自-c(=o)-、-oc(=o)-、-c(=o)o-、-oc(=o)o-、-o-、-s-、-s-s-、-c(=o)s-、-sc(=o)-、-n(r8)c(=o)-、-c(=o)n(r8)-、-n(r8)c(=o)o-、-oc(=o)n(r8)-、-sc(＝o)n(r8)-、-n(r8)c(＝o)s-、-c(＝s)-、-sc(＝s)-、和-c(＝s)s-中任一种，所述r8为h或c
1-c
12
烷基；r2和r3独立地为取代或未取代的c
1-c
18
直链亚烷基或者-r
9-l
3-r
10-；所述r9和r
10
独立地为取代或未取代的c
1-c
10
直链亚烷基，l3为o或者s；r4，r5，r6和r7独立地为氢、或者是取代或未取代的c
1-c
30
脂肪烃基，或者是-r
11-l
4-r
12
；所述r
11
和r
12
每次出现时独立地为取代或未取代的c
1-c
18
脂肪烃基，l4为o或者s；上述r2，r3，r4，r5，r6和r7中至少含有一个o或者s；r1为h、-r
13
、-or
13
、-r
13-oh、-r
13-or
14
、-r
13-oc(=o)r
14
、-r
13-nhc(=o)-r
14
、-r
13-och3或-r
13-n(r
14
)(r
15
)；r
13
为c
1-c
12
直链烷基或支链烷基，r
14
和r
15
各自独立的分别为h或c
1-c
12
直链烷基，或者，r
14
与r
15
和其连接的n原子形成c
3-c
10
杂环烷基。
10.根据本发明一些具体实施方案，其中，r8为h或c
1-c8烷基。
11.根据本发明一些具体实施方案，其中，r1为-r
13-oh或-r
13-n(r
14
)(r
15
)，r
13
为c
1-c
12
直链烷基；r
14
和r
15
各自独立的分别为c
1-c
12
直链烷基；r2为c
1-c
18
直链亚烷基；l1为-c(=o)s-、-sc(=o)-、-oc(=o)-或-c(=o)o-；r4和r5各自独立的为c
1-c
30
脂肪烃基；r3为c
1-c
18
直链亚烷基；l2为-c(=o)s-、-sc(=o)-、-oc(=o)-或-c(=o)o-；r6为甲基或者乙基；r7为-r
11-l
4-r
12
；所述r
11
和r
12
每次出现时独立地为取代或未取代的c
1-c
18
脂肪烃基，l4为o或者s。
12.根据本发明一些具体实施方案，其中，r
13
为c
1-c8直链烷基或支链烷基，r
14
和r
15
各自独立的分别为h或c
1-c5直链烷基，或者，r
14
与r
15
和其连接的n原子形成c
3-c8杂环烷基。
13.根据本发明一些具体实施方案，其中，r2和r3独立地为取代或未取代的c
1-c
18
直链烷基。
14.根据本发明一些具体实施方案，其中，r2和r3独立地为取代或未取代的c
1-c
12
直链烷基。
15.根据本发明一些具体实施方案，其中，r4，r5，r6和r7独立地为氢、或者是取代或未取代的c
1-c
18
脂肪烃基，或者是-r
11-l
4-r
12
；所述r
11
和r
12
每次出现时独立地为取代或未取代的c
1-c
10
脂肪烃基，l4为o或者s；r4，r5，r6和r7中至少含有一个o或者s，至多有两个为氢。
16.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述式（i）结构中的r4，r5，r6和r7结构各自独立地为h或下述烷基链，或各自独立地为下述烷基链上任意一个碳原子被o或者s替代而形成的醚或者硫醚：
。
17.根据本发明一些具体实施方案，其中，r1为-r
13-oh或-r
13-n(r
14
)(r
15
)，r
13
为c
1-c5直链烷基，优选为c
2-c4直链烷基；r
14
和r
15
各自独立的分别为c
1-c
12
直链烷基，优选各自独立的分别为c
1-c3直链烷基；r2为c
2-c
12
直链亚烷基，优选为c
5-c9直链烷基，更优选为c
5-c7直链烷基；l1为-c(=o)s-、-sc(=o)-、-oc(=o)-或-c(=o)o-；r4和r5各自独立的为c
3-c
13
脂肪烃基，优选为c
6-c
10
直链烷基，更优选为c
6-c8直链烷基；r3为c
2-c
10
直链亚烷基，优选为c
3-c7直链烷基，更优选为c
5-c7直链烷基；l2为-c(=o)s-、-sc(=o)-、-oc(=o)-或-c(=o)o-；r6为甲基或者乙基；r7为-r
11-l
4-r
12
；所述r
11
为c
1-c
10
烷基，优选为c
1-c3烷基；r
12
为c
3-c
13
烷基，优选为c
6-c
10
烷基，更优选为c
6-c8烷基；l4为o或者s。
18.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质化合物具有以下表中所示的结构之一：
。
19.本发明还提供了包含一种或多种本发明的阳离子脂质化合物与预防性或治疗性核酸的脂质体制剂，其中，所述脂质体制剂用于预防或者治疗某种疾病。
20.该脂质体制剂包含选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的一种
或多种组分。本发明所用到的治疗物为治疗性核酸，包含质粒dna、信使rna、反义寡核苷酸(ason)、微小rna (mirna)、干扰rna(micrna)、dicer底物rna、互补dna(cdna)。优选为质粒dna、信使rna和反义寡核苷酸。
21.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述核酸与所述阳离子脂质化合物的摩尔比为20：1至1：1。
22.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述核酸与所述阳离子脂质化合物的摩尔比为10：1至4：1。
23.根据本发明一些具体实施方案，其中，该脂质体制剂的直径为50 nm至300 nm。
24.根据本发明一些具体实施方案，其中，该脂质体制剂的直径为50 nm至150 nm，或150 nm至200 nm。
25.根据本发明一些具体实施方案，其中，还包含一种或多种其他脂质组分，包括但不限于中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质。
26.根据本发明一些具体实施方案，其中，所包含的类固醇为胆固醇。
27.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述胆固醇与阳离子脂质化合物的摩尔比为（0-1.5）：1。
28.根据本发明一些具体实施方案，其中，聚合物缀合的脂质中的聚合物为聚乙二醇（peg）。
29.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质化合物与所述聚乙二醇化脂质的摩尔比为100:1至20:1。
30.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述聚乙二醇化脂质为peg-dag、peg-pe、peg-sdag、peg-cer、peg-dmg或alc-0159。
31.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述脂质体制剂包含选自dspc、dppc、dmpc、dopc、popc、dope和sm中的一种或多种中性脂质。
32.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述中性脂质为dspc或dope。
33.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述中性脂质与所述阳离子脂质化合物的摩尔比为（0-0.5）：1。
34.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述脂质体制剂包括核酸。
35.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述核酸选自反义rna和/或信使rna。
36.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述核酸为信使rna。
37.本发明还提供了本发明所述的阳离子脂质化合物或所述的脂质体制剂在制备用于在对象中诱导蛋白质表达的药物中的用途。
38.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述对象为哺乳动物。
39.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述对象是非人灵长类动物。
40.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述对象是人。
41.综上所述，本发明提供了用于递送核酸的阳离子脂质化合物和脂质体制剂及用途。本发明的技术方案具有如下优点：本发明的阳离子脂质化合物具有醚键或者硫醚键，醚键或者硫醚键的引入使得该化合物更易降解，提高了该脂质化合物的体内清除速度，使得由该化合物构成的载体毒性更低、体内残留更少。而且经过结构优化后，筛选出的阳离子化合物的体内转染效率优于部
分商业转染阳离子脂质化合物。且所述氨基脂质化合物的制备方法具有使用原料易得、反应条件温和、产品产率高、仪器设备要求低且操作简单的优点。
附图说明
42.图1为实施例20的肌肉注射小鼠活体成像相对荧光强度；图2为实施例21的肺部雾化递送小鼠活体成像相对荧光强度；图3为实施例22的中和抗体滴度。
具体实施方式
43.以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。
44.实施例1化合物2的合成步骤1：向化合物2-1（3.00 g）的叔丁醇（20 ml）溶液中依次加入 1-癸醇（3.23 g）和碳酸铯（11.1 g）。溶液在室温下搅拌4小时后，点板（石油醚：乙酸乙酯=10：1）显示有新点生成。将反应液过滤，所得滤液浓缩后的粗产品通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％乙酸乙
4h), 1.35
ꢀ–ꢀ
1.30 (m, 20h), 1.30
ꢀ–ꢀ
1.27 (m, 20h), 1.19
ꢀ–ꢀ
1.17 (m, 3h), 0.91
ꢀ–ꢀ
0.88 (m, 9h)。
51.实施例2化合物3的合成化合物3的合成步骤1：向化合物3-1（3.00 g）的叔丁醇（20 ml）溶液中依次加入 1-癸醇（4.45 g）和碳酸铯（15.3 g）。混合物在室温下搅拌4小时后，点板（石油醚：乙酸乙酯=10：1）显示有新点生成。将反应液过滤，所得滤液浓缩后的粗产品，将粗产品通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％乙酸乙酯（体积百分比）的石油醚溶液）纯化得到化合物3-2（3.1 g，46％收率）。
52.步骤2：向化合物3-2（3.00g）的thf（20 ml）和水的溶液中加入氢氧化锂（860 mg）将混合物在60℃搅拌16小时。tlc(石油醚：乙酸乙酯=10：1)显示有极性变大的点生成。将反应混合物浓缩去除四氢呋喃，加水稀释后，用乙酸乙酯（30 ml）萃取1次，将水相用稀盐酸调节ph=2，用乙酸乙酯（30 ml）萃取2次，合并有机层，浓缩得到化合物3-3（2.50 g，92％收率）。
53.步骤3：将化合物3-3（2.0 g）溶于dcm（20 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，2.0g），4-二甲氨基吡啶（dmap，1.3 g）和5-溴-1-戊醇（1.5 g）分批加入反应体系，室温搅拌3h。取少量反应液稀释与3-3标样对照点板（pe/ea=
10/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（10 g正相柱，pe/ea，0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min）得到无色油状液体化合物3-4（2.6 g，83％收率）。
54.步骤4：将化合物3-4（500 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（191 mg），k2co3（527 mg）和化合物2-7（673 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比2-7极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），浓缩得到淡黄色油状液体化合物3（750 mg，80%收率）。
[0055]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.78 (s, 1h), 4.14
ꢀ–ꢀ
4.02 (d, j = 2.6 hz, 2h), 3.73
ꢀ–ꢀ
3.46 (m, 6h), 2.61 (s, 1h), 2.59
ꢀ–ꢀ
2.50 (m, 2h), 2.49
ꢀ–ꢀ
2.45 (m, 4h), 2.29
ꢀ–ꢀ
2.18 (m, 2h), 1.71
ꢀ–ꢀ
1.63 (m, 4h), 1.60
ꢀ–ꢀ
1.50 (m, 12h), 1.49 (s, 2h), 1.38
ꢀ–ꢀ
1.36 (d, j = 0.6 hz, 4h), 1.35
ꢀ–ꢀ
1.30 (m, 20h), 1.30
ꢀ–ꢀ
1.26 (m, 20h), 0.92 (s, 3h), 0.91
ꢀ–ꢀ
0.87 (s, 9h)。
[0056]
实施例3化合物4的合成
步骤1：向化合物4-1（3.00 g）的叔丁醇（20 ml）溶液中依次加入 1-癸醇（4.6 g）和碳酸铯（16.1 g）。混合物在室温下搅拌4小时后，点板（石油醚：乙酸乙酯=10：1）显示有新点生成。将反应液过滤，所得滤液浓缩后的粗产品，将粗产品通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％乙酸乙酯（体积百分比）的石油醚溶液）纯化得到化合物4-2（3.0 g，47.3%收率）。
[0057]
步骤2：向化合物4-2（3.00g）的thf（20 ml）和水的溶液中加入氢氧化锂（860 mg）将混合物在60℃搅拌16小时。tlc(石油醚：乙酸乙酯=10：1)显示有极性变大的点生成。将反应混合物浓缩去除四氢呋喃，加水稀释后，用乙酸乙酯（30 ml）萃取1次，将水相用稀盐酸调节ph=2，用乙酸乙酯（30 ml）萃取2次，合并有机层，浓缩得到化合物4-3（2.50 g，92％收率）。
[0058]
步骤3：将化合物4-3（2.0 g）溶于dcm（20 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，2.1g），4-二甲氨基吡啶（dmap，1.4 g）和5-溴-1-戊醇（1.6 g）分批加入反应体系，室温搅拌3h。取少量反应液稀释与3-3标样对照点板（pe/ea=10/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（10 g正相柱，pe/ea，0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min）得到无色油状液体化合物4-4（2.6 g，84％收率）。
[0059]
步骤4：将化合物4-4（500 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（191 mg），k2co3（527 mg）和化合物2-7（673 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比2-7极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 %（甲醇在dcm/meoh溶液中的体积百分含量，后同） 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），浓缩得到淡黄色油状液体化合物4（610 mg，65.7% 收率）。
[0060]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.80
ꢀ–ꢀ
4.74 (s, 1h), 4.15
ꢀ–ꢀ
4.01 (d, j = 2.6 hz, 2h), 3.73
ꢀ–ꢀ
3.44 (m, 6h), 2.56
ꢀ–ꢀ
2.50 (m, 3h), 2.49
ꢀ–ꢀ
2.45 (m, 4h), 2.29
ꢀ–ꢀ
2.18 (m, 2h), 1.71
ꢀ–ꢀ
1.47 (m, 18h), 1.41
ꢀ–ꢀ
1.26 (m, 46h), 0.96
ꢀ–ꢀ
0.92 (m, 3h), 0.99 (s, 9h)。
[0061]
实施例4化合物6的合成合物6的合成步骤1：向化合物6-1（19.0 g）的叔丁醇（20 ml）溶液中依次加入 1-癸醇（3.0 g）和碳酸铯（12.4 g）。混合物在室温下搅拌4小时后，点板（石油醚：乙酸乙酯=10：1）显示有新点生成。将反应液过滤，所得滤液浓缩后的粗产品，将粗产品通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％乙酸乙酯（体积百分比）的石油醚溶液）纯化得到化合物6-2（2.1 g，43％收率）。
[0062]
步骤2：向化合物6-2（2.1g）的thf（20 ml）和水（10 ml）的溶液中加入氢氧化锂（584 mg）将混合物在60℃搅拌16小时。tlc(石油醚：乙酸乙酯=10：1)显示有极性变大的点生成。将反应混合物浓缩去除四氢呋喃，加水稀释后，用乙酸乙酯（30 ml）萃取1次，水相用稀盐酸调节ph=2，用乙酸乙酯（30 ml）萃取2次，合并有机相，浓缩得到化合物6-3（1.6 g，85％收率）。
[0063]
步骤3：将化合物6-3（2.0 g） 溶于dcm（20 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨
基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，2.0g），4-二甲氨基吡啶（dmap，1.3 g）和5-溴-1-戊醇（1.5 g）分批加入反应体系，室温搅拌3h。取少量反应液稀释与6-3标样对照点板（pe/ea=10/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（10 g正相柱，pe/ea，0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min）得到无色油状液体化合物6-4（2.5 g，82％收率）。
[0064]
步骤4：将化合物6-4（500 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（191 mg），k2co3（527 mg）和化合物2-7（673 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比2-7极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），浓缩得到淡黄色油状液体化合物6（742 mg，75%收率）。
[0065]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.78 (s, 1h), 4.11 (s, 2h), 3.68
ꢀ–ꢀ
3.57 (d, j = 5.0 hz, 4h), 3.55
ꢀ–ꢀ
3.46 (s, 2h), 2.61
ꢀ–ꢀ
2.43 (m, 8h), 2.28
ꢀ–ꢀ
2.17 (s, 2h), 1.73
ꢀ–ꢀ
1.63 (d, j = 3.9 hz, 4h), 1.60
ꢀ–ꢀ
1.46 (m, 12h), 1.39
ꢀ–ꢀ
1.23 (m, 40h), 0.96
ꢀ–ꢀ
0.84 (s, 9h)。
[0066]
实施例5化合物7的合成
步骤1：向化合物2-1（3.00 g）的叔丁醇（20 ml）溶液中依次加入辛醇（3.1 g）和碳酸铯（11.0 g）。溶液在室温下搅拌4小时后，点板（石油醚：乙酸乙酯=10：1）显示有新点生成。将反应液过滤，所得滤液浓缩后的粗产品通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％乙酸乙酯（体积百分比）的石油醚溶液）纯化得到化合物7-2（3.6 g，69％收率）。
[0067]
步骤2：向化合物7-2（3.00g）的thf（20 ml）和水的溶液中加入氢氧化锂（860 mg）将混合物在60℃搅拌16小时。tlc显示有极性变大的点生成。将反应混合物浓缩去除四氢呋喃，加水稀释后，用乙酸乙酯（30 ml）萃取1次，将水相用稀盐酸调节ph=2，用乙酸乙酯（30 ml）萃取2次，合并有机层，浓缩得到化合物7-3（2.0 g，94％收率）。
[0068]
步骤3：将化合物7-3（2.0 g）溶于dcm（20 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，2.0g），4-二甲氨基吡啶（dmap，1.3 g）和5-溴-1-戊醇（1.5 g）分批加入反应体系，室温搅拌3h。取少量反应液稀释与7-3标样对照点板（pe/ea=10/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（10 g正相柱，pe/ea， 0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min）得到无色油状液体化合物7-4（2.5 g，74％收率）。
[0069]
步骤4：将化合物7-4（500 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（191 mg），k2co3（527 mg）和化合物2-7（673 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比2-7极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱， dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），浓缩得到淡黄色油状液体化合物7（750 mg，75%收率）。
[0070]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.78 (s, 1h), 4.09 (d, j = 2.2 hz, 2h), 3.78
ꢀ–ꢀ
3.37 (m, 6h), 2.75 (s, 1h), 2.55 (d, j = 3.8 hz, 2h), 2.49
ꢀ–ꢀ
2.43 (m, 4h), 2.30
ꢀ–ꢀ
2.16 (m, 2h), 1.71
ꢀ–ꢀ
1.65 (m, 2h), 1.64 (s, 2h), 1.60
ꢀ–ꢀ
1.50 (m, 10h), 1.49 (s, 2h), 1.37(d, j = 0.6 hz, 4h), 1.35
ꢀ–ꢀ
1.30 (m, 20h), 1.30
ꢀ–ꢀ
1.26(m,16h),1.22
–
1.14(m,3h),0.99(s,9h)。
[0071]
实施例6化合物14的合成化合物14的合成步骤1：向化合物14-1（3.0g）和三乙胺（5.3g）的二氯甲烷（50ml）溶液中在冰浴条件下加入对甲苯磺酰氯（7.4g）。将混合物室温下搅拌3小时后，将反应混合物用dcm（30ml）稀释，并用稀盐酸和盐水（100ml）洗涤。合并有机层经na2so4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％ea（体积百分比）的正己烷溶液）纯化得到化合物14-2（6.0g，86％收率）。
[0072]
步骤2：冰浴条件下，向叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷(2.0g)的dmf(20ml)溶液中加入nah(680mg,60%)，将混合物0oc下搅拌半小时后，将14-2缓缓加入溶液中，溶液在80oc下搅拌两小时。待溶液降至室温后，加入饱和氯化铵溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机层经na2so4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％ea（体积百分比）的正己烷溶液）纯化得到化合物14-3（2.5g，80％收率）。
[0073]
步骤3：冰浴条件下，向14-3(2.5g)的无水四氢呋喃(20ml)溶液中加入1mtbaf溶液，将溶液升至室温，在室温下搅拌两小时，加入饱和氯化铵溶液，加水稀释后，乙酸乙酯萃
取，合并有机层经na2so4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-60％ea（体积百分比）的正己烷溶液）纯化得到化合物14-4（1.4 g，96％收率）。
[0074]
步骤4：向化合物14-4（1.4 g）的dcm（20 ml）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（dmap，1.07 g），7-溴庚酸（2.01 g）和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（edcl，2.01g），反应混合物25℃搅拌12小时，将反应混合物用dcm（30 ml）稀释，并用饱和nahco3（100 ml）和盐水（100 ml）洗涤。合并有机层经na2so4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％ea（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物14-5（2.10g，68％收率）。
[0075]
步骤5：将化合物14-5（500 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（191 mg），k2co3（527 mg）和化合物2-7（673 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比2-7极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），浓缩得到淡黄色油状液体化合物14（820 mg，81%收率）。
[0076]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.78 (s, 1h), 4.21 (s, 2h), 3.64 (d, j = 5.0 hz, 2h), 3.60 (s, 2h), 3.53 (s, 2h), 2.55 (s, 2h), 2.48 (s, 4h), 2.24 (s, 4h),1.71
ꢀ–ꢀ
1.65 (m, 4h), 1.58 (d, j = 6.4 hz, 4h), 1.53 (s, 4h), 1.51 (s, 2h), 1.38
ꢀ–ꢀ
1.35 (m, 6h), 1.35
ꢀ–ꢀ
1.33 (m, 8h), 1.32 (d, j = 1.0 hz, 4h), 1.32
ꢀ–ꢀ
1.31 (m, 10h), 1.29 (s, 4h), 1.29 (s, 2h), 1.29
ꢀ–ꢀ
1.27 (m, 8h), 0.97
ꢀ–ꢀ
0.82 (m, 9h).实施例7化合物17的合成
步骤1：向化合物2-1（5.00 g）的叔丁醇（40 ml）溶液中依次加入正己醇（2.90 g）和碳酸铯（27.8g）。溶液在室温下搅拌4小时后，点板（石油醚：乙酸乙酯=10：1）显示有新点生成。将反应液过滤，所得滤液浓缩后的粗产品通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％乙酸乙酯（体积百分比）的石油醚溶液）纯化得到化合物17-2（3.14 g，39.8％收率）。
[0077]
步骤2：向化合物17-2（3.00g）的thf（20 ml）和水（20 ml）的溶液中加入氢氧化锂（1.03 g）将混合物在60℃搅拌16小时。tlc显示有极性变大的点生成。将反应混合物浓缩去除四氢呋喃，加水稀释后，用乙酸乙酯（30 ml）萃取1次，将水相用稀盐酸调节ph=2，用乙酸乙酯（30 ml）萃取2次，合并有机层，浓缩得到化合物17-3（1.80 g，88.7％收率）。
[0078]
步骤3：将化合物17-3（2.0 g）溶于dcm（20 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，3.1g），4-二甲氨基吡啶（dmap，2.0 g）和7-溴-1-庚醇（2.3g）分批加入反应体系，室温搅拌3h。取少量反应液稀释与2-3标样对照点板（pe/ea=10/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（10 g正相柱，pe/ea，0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min）得到无色油状液体化合物17-4（2.8 g，74％收率）。
[0079]
步骤4：向化合物44-5 (2.00 g)的dcm（15 ml）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（dmap，200 mg）和7-溴-1-庚醇(1.51 g)。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（edcl，1.62 g），反应混合物25℃搅拌1小时。tlc显示起始化合物44-5完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％ea（体积百分比）的石油醚溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物44-6（2.4 g，74％收率）。
[0080]
步骤5：向化合物44-6（2.0 g）和乙醇胺（530 mg）的乙腈溶液（50 ml）溶液中加入碳酸钾（1.80 g）。将混合物在70℃搅拌3小时。tlc显示化合物44-6完全消失，有一个极性变大的点生成。将反应液过滤，所得滤液浓缩后的粗产品，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（25 g正相柱， pe/ea，0-0 % 5min，0-10% 20min，10-10% 5min，流速20ml/min）得到无色油状液体化合物
17-5（1.0 g，53.8％收率）。
[0081]
步骤6：将化合物17-4（500 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（191 mg），k2co3（527 mg）和化合物17-5（673 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌2h。取少量反应液稀释点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比17-5极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），浓缩得到淡黄色油状液体化合物17（725 mg，70%收率）。
[0082]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.15
ꢀ–ꢀ
4.03 (m, 4h), 3.56
ꢀ–ꢀ
3.45 (m, 6h), 2.75 (s, 1h), 2.55 (d, j = 3.8 hz, 2h), 2.48 (d, j = 1.0 hz, 4h), 2.29 (s, 1h), 1.65 (s, 4h), 1.50
ꢀ–ꢀ
1.46 (m, 10h), 1.40
ꢀ–ꢀ
1.38 (s, 4h), 1.36 (d, j = 0.6 hz, 2h), 1.34 (d, j = 0.6 hz, 4h), 1.32 (d, j = 1.0 hz, 10h), 1.32
ꢀ–ꢀ
1.30 (m, 10h), 1.28 (d, j = 1.2 hz, 12h), 1.18 (s, 3h), 0.94
ꢀ–ꢀ
0.84 (m, 9h).实施例8化合物28的合成步骤1：
向化合物2-6（2.0 g）和n,n-二乙基乙二胺（755 mg）的乙腈溶液（50 ml）溶液中加入碳酸钾（1.2 g）。将混合物在70℃搅拌3小时。有一个极性变大的点生成。将反应液过滤，所得滤液浓缩后的粗产品，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min）得到无色油状液体化合物28-1（900 mg，30％收率）。
[0083]
步骤2：将化合物28-1（500 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（146 mg），k2co3（406 mg）和化合物7-4（425 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌2h。取少量反应液稀释点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有新点生成。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min， 7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），浓缩得到淡黄色油状液体化合物7（94 mg，11%收率）。
[0084]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.78 (s, 1h), 4.09 (d, j = 2.2 hz, 2h), 3.73
ꢀ–ꢀ
3.60 (m, 4h), 2.75 (s, 1h), 2.69
ꢀ–ꢀ
2.57 (m, 8h), 2.51
ꢀ–ꢀ
2.40 (m, 4h), 2.31
ꢀ–ꢀ
2.17 (m, 2h), 1.72
ꢀ–ꢀ
1.65 (m, 4h), 1.60
ꢀ–ꢀ
1.50 (m, 10h), 1.48 (s, 2h), 1.36 (d, j = 0.6 hz, 4h), 1.35
ꢀ–ꢀ
1.30 (m, 20h), 1.30
ꢀ–ꢀ
1.26 (m, 16h), 1.19 (s, 3h), 1.00 (s, 6h), 0.90 (s, 9h)。
[0085]
实施例9化合物29的合成步骤1：将化合物1-癸硫醇（2.28 g）和koh（2.20 g）溶于乙醇（20 ml），室温搅拌。然后称
取化合物29-1（2.00 g）分批加入到上述反应体系中，室温下搅拌过夜。tlc（pe/ea=3/1，磷钼酸）有新点生成。反应混合液加200ml 水，滴加浓hcl调ph至3附近。用600ml乙酸乙酯萃取上述混合液，有机相na2so4干燥后减压蒸发。加适量dcm和硅胶拌样，纯化（30 g正相柱， pe/ea， 0-0 % 10min，0-2% 20min，2-2% 5min，流速30ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到白色固体29-2（950 mg，30％收率）。
[0086]
步骤2：将化合物29-2（950 mg）溶于dcm（10 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，924 mg），4-二甲氨基吡啶（dmap，95 mg）和5-溴-1-戊醇（708 mg）分批加入反应体系，室温搅拌3h。取少量反应液稀释与29-2标样对照点板（pe/ea=10/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（10 g正相柱， pe/ea，0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到无色油状液体化合物29-3（1.45 g，95％收率）。
[0087]
步骤3：将化合物29-3（750 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（170 mg），k2co3（350 mg）和化合物2-7（559 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌2h。取少量反应液稀释与2-7标样对照点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比2-7极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到淡黄色油状液体化合物29（850 mg）。
[0088]1h nmr (400 mhz, cdcl3) δ 4.86 (p, j = 6.4 hz, 1h), 4.09 (t, j = 6.8 hz, 2h), 3.56 (t, j = 5.4 hz, 2h), 2.77 (t, j = 7.4 hz, 2h), 2.61 (dt, j = 11.8, 6.4 hz, 4h), 2.51 (dd, j = 14.4, 6.8 hz, 6h), 2.28 (t, j = 7.6 hz, 2h), 1.70
ꢀ–ꢀ
1.55 (m, 6h), 1.50 (dd, j = 16.6, 10.9 hz, 8h), 1.40
ꢀ–ꢀ
1.21 (m, 46h), 0.88 (t, j = 6.8 hz, 9h)。
[0089]
实施例10化合物30的合成
步骤1：向化合物30-1 (2.00 g)的dmf（15 ml）溶液中依次加入1-癸硫醇（2.10 g）和氢氧化钠(1.20 g)，反应混合物在70℃搅拌3小时。tlc显示起始化合物30-1完全消失。将反应液倒入h2o(50 ml)，加ea(20 ml)萃取1次，水相用2m 稀盐酸调节ph为3，加ea(20 ml)萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥。抽滤，浓缩得到化合物30-2（1.70 g，54％收率）。
[0090]
步骤2：向化合物30-2 (1.70 g)的dcm（15 ml）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（dmap，160 mg）和5-溴戊醇(1.31 g)。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（edcl，1.56 g），反应混合物25℃搅拌2小时。tlc显示起始化合物30-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％ea（体积百分比）的石油醚溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物30-3（1.54 g，57％收率）。
[0091]
步骤3：向化合物30-3 (1.5 g)的乙醇（15 ml）溶液中加入乙醇胺 (783 mg)，混合物在70℃搅拌12小时。tlc显示起始化合物30-3有少量剩余。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％ch3oh（体积百分比）的二氯甲烷溶液，甲醇中加1%氨水）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物30-4（824 mg，58％收率）。
[0092]
步骤4：向化合物30-4 (724 mg)的dmf(7 ml)溶液中依次加入七烷-9-基8-溴辛酸酯(1.03 g )，nai(278 mg)和k2co3(770 mg)，反应混合物在50℃反应12小时。tlc显示起始化
合物30-4有少量剩余。将反应液倒入h2o(50ml)，加ea(20ml)萃取3次，合并有机相，有机相用饱和食盐(20ml)洗2次，有机相用无水硫酸钠干燥。抽滤，浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％ch3oh（体积百分比）的二氯甲烷溶液，甲醇中加1%氨水）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物30（1.02g，71％收率）。
[0093]1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ4.86(dd,j=12.4,6.0hz,1h),4.09(t,j=8.0hz,2h),3.54(t,j=6.0hz,2h),2.83(d,j=7.0hz,1h),2.73
–
2.38(m,12h),2.27(t,j=7.2hz,3h),1.68
–
1.18(m,61h),0.87(t,j=6.8hz,9h)。
[0094]
实施例11化合物35的合成化合物35的合成步骤1：向化合物35-1(2.00g)的dmf（15ml）溶液中依次加入1-辛硫醇（2.10g）和氢氧化钠(1.20g)，反应混合物在70℃搅拌3小时。tlc显示起始化合物35-1完全消失。将反应液倒入h2o(50ml)，加ea(20ml)萃取1次，水相用2m稀盐酸调节ph为3，加ea(20ml)萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥。抽滤，浓缩得到化合物35-2（1.80g，56.6％收率）。
[0095]
步骤2：将化合物35-2（1000mg）溶于dcm（10ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，924mg），4-二甲氨基吡啶（dmap，95mg）和5-溴-1-戊醇（708mg）分批加入反应体系，室温搅拌3h。取少量反应液稀释与35-2标样对照点板（pe/ea=10/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化
（10g正相柱，pe/ea，0-0%5min，0-5 min，5-5%5min，流速15ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到无色油状液体化合物35-3（1.30g，79.2％收率）。
[0096]
步骤3：将化合物35-3（750mg）溶于乙腈（10ml），室温搅拌。然后依次称取nai（170mg），k2co3（350mg）和化合物2-7（559mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释与35-3标样对照点板（dcm/meoh=10/1，1d氨水，磷钼酸），观察到有比35-3极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25g正相柱，dcm/meoh，0.1%氨水，0-0min，0-7.5 min，7.5-7.5%5min，流速25ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到淡黄色油状液体化合物35（830mg，56.9%收率）。
[0097]1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ4.86(dd,j=12.4,6.0hz,1h),4.09(t,j=8.0hz,2h),3.54(t,j=6.0hz,2h),2.83(d,j=7.0hz,1h),2.73
–
2.38(m,12h),2.27(t,j=7.2hz,3h),1.68
–
1.18(m,61h),0.87(t,j=6.8hz,9h)。
[0098]
实施例12化合物36的合成步骤1：将化合物1-辛硫醇（2.50g）和naoh（2.20g）溶于乙醇（20ml），室温搅拌。然后称取化合物36-1（2.00g）分批加入到上述反应体系中，室温搅拌过夜。tlc（pe/ea=3/1，磷钼酸）监测有新点生成。反应混合液加200ml水，滴加浓hcl调ph至3附近。用600ml乙酸乙酯萃取上述混合液，有机相na2so4干燥后减压蒸发。加适量dcm和硅胶拌样，纯化（30g正相柱，
pe/ea，0-0 % 10min，0-2% 20min，2-2% 5min，流速30ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到白色固体36-2（1.09 g，40.2％收率）。
[0099]
步骤2：将化合物36-2（1000 mg）溶于dcm（10 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，924 mg），4-二甲氨基吡啶（dmap，95 mg）和5-溴-1-戊醇（708 mg）分批加入反应体系，室温搅拌3h。取少量反应液稀释与36-2标样对照点板（pe/ea=10/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（10 g正相柱， pe/ea，0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到无色油状液体化合物36-3（1.20 g，74.7％收率）。
[0100]
步骤3：将化合物36-3（750 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（170 mg），k2co3（350 mg）和化合物2-7（559 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释与2-7标样对照点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比2-7极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱， dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到淡黄色油状液体化合物35（830 mg，56.9%收率）。
[0101]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.86 (dd, j = 12.4, 6.0 hz, 1h), 4.09 (t, j = 8.0 hz, 2h), 3.54 (t, j = 6.0 hz, 2h), 2.83 (d, j = 7.0 hz, 1h), 2.73
ꢀ–ꢀ
2.38 (m, 14h), 2.27 (t, j = 7.2 hz, 2h), 1.68
ꢀ–ꢀ
1.18 (m, 57h), 0.87 (t, j = 6.8 hz, 9h).实施例13化合物41的合成步骤1：
向化合物41-1 (2.00 g)的dmf（15 ml）溶液中依次加入1-癸硫醇（2.30 g）和氢氧化钠(1.20 g)，反应混合物在40℃搅拌4小时。tlc显示起始化合物41-1完全消失。将反应液倒入h2o(50 ml)，加乙酸乙酯(20 ml)萃取1次，水相用2m稀盐酸调节ph为3，加乙酸乙酯(20 ml)萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥。抽滤，浓缩得到化合物41-2（1.80 g，56.6％收率）。
[0102]
步骤2：将化合物41-2（1000 mg）溶于dcm（10 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，1.05 g），4-二甲氨基吡啶（dmap，560 mg）和8-溴辛酸（1.02 g）分批加入反应体系，室温搅拌2h。取少量反应液稀释与41-2标样对照点板（pe/ea=10/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（15 g正相柱， pe/ea，0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min）得到无色油状液体化合物41-3（1.5 g，77％收率）。
[0103]
步骤3：将化合物41-3（700 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（170 mg），k2co3（350 mg）和化合物2-7（559 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释与2-7标样对照点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比2-7极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱， dcm/meoh，0.1% 氨水， 0-0 % 10min， 0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），得到淡黄色油状液体化合物41（600 mg，44.8%收率）。
[0104]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.86 (p, j = 6.4 hz, 1h), 4.09 (t, j = 6.8 hz, 2h), 3.56 (t, j = 5.4 hz, 2h), 2.77 (t, j = 7.4 hz, 2h), 2.61 (dt, j = 11.8, 6.4 hz, 4h), 2.51 (dd, j = 14.4, 6.8 hz, 6h), 2.28 (t, j = 7.6 hz, 2h), 1.70
ꢀ–ꢀ
1.55 (m, 6h), 1.50 (dd, j = 16.6, 10.8 hz, 8h), 1.40
ꢀ–ꢀ
1.21 (m, 50h), 0.88 (t, j = 6.8 hz, 9h)。
[0105]
实施例14化合物44的合成
步骤1：向化合物44-1 (2.00 g)的dmf（15 ml）溶液中依次加入1-辛硫醇（2.63 g）和氢氧化钠(1.44 g)，反应混合物在70℃搅拌3小时。tlc显示起始化合物44-1完全消失。将反应液倒入h2o(50 ml)，加ea(20 ml)萃取1次，水相用2m 稀盐酸调节ph为3，加ea(20 ml)萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥。抽滤，浓缩得到化合物44-2（1.63 g，53％收率）。
[0106]
步骤2：向化合物44-2 (1.63 g)的dcm（15 ml）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（dmap，172 mg）和5-溴戊醇(1.41 g)。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（edcl，1.75 g），反应混合物25℃搅拌1小时。tlc显示起始化合物44-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％ea（体积百分比）的石油醚溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物44-3（1.65 g，62％收率）。
[0107]
步骤3：向化合物44-3 (1.5 g)的乙腈（15 ml）溶液中加入乙醇胺 (960 mg) 和碳酸钾（1.15 g）, 溶液在70℃搅拌12小时。tlc显示起始化合物44-3有少量剩余。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％ch3oh（体积百分比）的二氯甲烷溶液，甲醇中加1%氨水）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物44-4（800 mg，56％收率）。
[0108]
步骤4：向化合物44-5 (2.00 g)的dcm（15 ml）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（dmap，200 mg）和7-溴-1-庚醇(1.51 g)。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（edcl，1.62 g），反应混合物25℃搅拌1小时。tlc显示起始化合物44-5完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％ea（体积百分比）的石油醚溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物44-6（2.40 g，74％收率）。
[0109]
步骤5：向化合物44-4 (800 mg) 的dmf (7 ml) 溶液中依次加入44-6 (1.12 g )，nai(332 mg)和k2co3(918 mg)，反应混合物在50℃反应12小时。tlc显示起始化合物44-4有少量剩余。将反应液倒入h2o(50 ml)，加ea(20 ml)萃取3次，合并有机相，有机相用饱和食盐(20 ml)洗2次，有机相用无水硫酸钠干燥。抽滤，浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-10％ch3oh（体积百分比）的二氯甲烷溶液，甲醇中加1%氨水）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物44（950 mg，58％收率）。
[0110]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.78 (s, 1h), 4.09 (d, j = 3.2 hz, 2h), 3.72
ꢀ–ꢀ
3.55 (m, 2h), 3.05
ꢀ–ꢀ
2.86 (m, 2h), 2.84 (s, 1h), 2.59
ꢀ–ꢀ
2.41 (m, 8h), 2.31
ꢀ–ꢀ
2.17 (m, 2h), 1.72
ꢀ–ꢀ
1.64 (m, 4h), 1.62
ꢀ–ꢀ
1.60 (s, 2h), 1.59
ꢀ–ꢀ
1.51 (m, 8h), 1.55(s, 2h), 1.39
ꢀ–ꢀ
1.35 (m, 6h), 1.33 (d, j = 3.0 hz, 6h), 1.31 (d, j = 3.0 hz, 12h), 1.31
ꢀ–ꢀ
1.28 (m, 4h), 1.30-1.26(m, 12h), 1.24 (s, 3h), 0.94
ꢀ–ꢀ
0.82 (m, 9h)。
[0111]
实施例15化合物46的合成物46的合成步骤1：将化合物1-庚硫醇（2.1 g）和naoh（1.0 g）溶于dmf（20 ml），室温搅拌。然后称取化合物46-1（2.00 g）分批加入到上述反应体系中，60 o
c下搅拌过夜。tlc（pe/ea=3/1，磷钼酸）有新点生成。反应混合液加200ml 水，滴加浓hcl调ph至3附近。用600ml 乙酸乙酯萃取上述混合液，有机相na2so4干燥后减压蒸发。加适量dcm和硅胶拌样，纯化（30 g正相柱，pe/ea，0-0 % 10min，0-2% 20min， 2-2% 5min，流速30ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到无色油状液体46-2（1.5 g，62％收率）。
[0112]
步骤2：向化合物46-2（1.5 g）的thf（20 ml）和水的溶液中加入氢氧化锂（360 mg）将混合物在60℃搅拌16小时。tlc显示有极性变大的点生成。将反应混合物浓缩去除四氢呋喃，加水稀释后，用乙酸乙酯（30 ml）萃取1次，将水相用稀盐酸调节ph=2，用乙酸乙酯（30 ml）萃取2次，合并有机层，浓缩得到化合物46-3（1.2 g，88％收率）。
[0113]
步骤3：将化合物46-3（1.2 g）溶于dcm（10 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，1.01 g），4-二甲氨基吡啶（dmap，534 mg）和6-溴正己醇（792 mg）分批加入反应体系，室温搅拌3h。取少量反应液稀释与46-3标样对照点板（pe/ea=
10/1， 磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（10 g正相柱，pe/ea，0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到无色油状液体化合物46-4（1.6g，84％收率）。
[0114]
步骤4：向化合物46-4（1.6 g）和乙醇胺（447 mg）的乙腈溶液（50 ml）溶液中加入碳酸钾（1.52 g）。将混合物在85℃下回流2小时。tlc显示化合物46-4完全消失，有一个极性变大的点生成。将反应液过滤，所得滤液浓缩后的粗产品，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（25 g正相柱，pe/ea，0-0 % 5min，0-10% 20min，10-10% 5min，流速20ml/min）得到无色油状液体化合物46-5（870 mg，57％收率）。
[0115]
步骤5：将化合物46-6（2.0 g）溶于dcm（10 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edci，1.79 g），4-二甲氨基吡啶（dmap，950 mg）和6-溴正己醇（1.41 mg）分批加入反应体系，室温搅拌3h。取少量反应液稀释与46-6标样对照点板（pe/ea=10/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（25 g正相柱，pe/ea，0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到无色油状液体化合物46-7（2.8 g，86％收率）。
[0116]
步骤6：将化合物46-5（500 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（180 mg），k2co3（497 mg）和化合物46-7（502 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比46-7极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），浓缩得到淡黄色油状液体化合物46（700 mg，77%收率）。
[0117]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.10 (m, 4h), 3.64 (m, 3h), 2.61
ꢀ–ꢀ
2.42 (m, 8h), 2.29 (s, 1h), 1.98
ꢀ–
1.90 (m, 2h), 1.67
ꢀ–ꢀ
1.61 (m, 6h), 1.59
ꢀ–ꢀ
1.45 (m, 8h), 1.43 (s, 4h), 1.41
ꢀ–ꢀ
1.37 (m, 4h), 1.37
ꢀ–ꢀ
1.33 (m, 10h), 1.33
ꢀ–ꢀ
1.30 (m, 14h), 1.30
ꢀ–ꢀ
1.26 (m, 12h), 0.95
ꢀ–ꢀ
0.83 (m, 12h)。
[0118]
实施例16化合物48的合成
步骤1：向化合物2-6（8.0 g）和丙醇胺（1.9 g）的乙腈溶液（50 ml）溶液中加入碳酸钾（7.19 g）。将混合物在85℃下回流2小时。tlc显示化合物2-6完全消失，有一个极性变大的点生成。将反应液过滤，所得滤液浓缩后的粗产品，加适量硅胶和dcm拌样、纯化（40g正相柱，pe/ea，0-0 % 5min，0-10% 20min，10-10% 5min，流速20ml/min）得到无色油状液体化合物48-1（5.0 g，63.3％收率）。
[0119]
步骤2：将化合物35-3（750 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（170 mg），k2co3（350 mg）和化合物48-1（620 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释与48-1标样对照点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有比48-1极性小的新点。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到淡黄色油状液体化合物48（650 mg，69%收率）。
[0120]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.78 (s, 1h), 4.09 (d, j = 3.2 hz, 2h), 3.65
ꢀ–ꢀ
3.56 (m, 2h), 3.00
ꢀ–ꢀ
2.88 (m, 3h), 2.56
ꢀ–ꢀ
2.40 (m, 8h), 2.31
ꢀ–ꢀ
2.17 (m, 2h), 1.73
ꢀ–ꢀ
1.63 (m, 6h), 1.62 (d, j = 1.0 hz, 2h), 1.59
ꢀ–ꢀ
1.50 (m, 8h), 1.58 (s, 2h), 1.40
ꢀ–ꢀ
1.35 (m, 6h), 1.34
ꢀ–ꢀ
1.30 (m, 18h), 1.30
ꢀ–ꢀ
1.27 (m, 16h), 1.24 (s, 3h), 0.95
ꢀ–ꢀ
0.82 (m, 9h)。
[0121]
实施例17化合物55的合成
g正相柱， pe/ea，0-0 % 5min，0-5% 20min，5-5% 5min，流速15ml/min）得到无色油状液体化合物55-4（1.27 g，70％收率）。
[0124]
步骤4：将化合物55-1（500 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（146 mg），k2co3（406 mg）和化合物55-4（393 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌3h。取少量反应液稀释点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有新点生成。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min，7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），浓缩得到淡黄色油状液体化合物55（108 mg，14%收率）。
[0125]1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.78 (s, 1h), 4.23 (s, 2h), 2.80 (s, 2h), 2.60 (s, 2h), 2.57 (s, 2h), 2.52 (s, 2h), 2.45 (s, 4h), 2.30 (s, 6h), 2.27 (s, 2h), 2.24 (s, 2h), 1.71
ꢀ–ꢀ
1.66 (m, 2h), 1.62 (s, 2h), 1.58
ꢀ–ꢀ
1.57 (d, j = 6.8 hz, 4h), 1.54 (d, j = 6.8 hz, 2h), 1.53
ꢀ–ꢀ
1.50 (m, 4h), 1.37 (d, j = 1.0 hz, 6h), 1.35
ꢀ–ꢀ
1.30 (m, 24h), 1.30
ꢀ–ꢀ
1.25 (m, 16h), 0.96
ꢀ–ꢀ
0.81 (m, 9h)。
[0126]
实施例18化合物57的合成
步骤1：将化合物55-1（500 mg）溶于乙腈（10 ml），室温搅拌。然后依次称取nai（146 mg），k2co3（406 mg）和化合物29-3（422 mg）分批加入到上述反应体系中，在85℃下加热回流搅拌2h。取少量反应液稀释点板（dcm/meoh=10/1，1d 氨水，磷钼酸），观察到有新点生成。反应液冷却至室温后减压蒸发，加适量dcm和硅胶拌样，纯化（25 g正相柱，dcm/meoh，0.1% 氨水，0-0 % 10min，0-7.5% 20min， 7.5-7.5% 5min，流速25ml/min），浓缩得到淡黄色油状液体化合物57（103 mg，12%收率）1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 4.78 (s, 1h), 4.12 (s, 2h), 2.96
ꢀ–ꢀ
2.77 (m, 2h), 2.62
ꢀ–ꢀ
2.56 (m, 6h), 2.50 (s, 2h), 2.45 (d, j = 2.2 hz, 4h), 2.30 (s, 6h), 2.24 (s, 2h), 1.71
ꢀ–ꢀ
1.66 (m, 2h), 1.65 (s, 2h), 1.62 (s, 2h), 1.58 (s, 2h), 1.57
ꢀ–ꢀ
1.50 (m, 6h), 1.49 (s, 2h), 1.38 (d, j = 0.8 hz, 6h), 1.34
ꢀ–ꢀ
1.30 (m, 18h), 1.30
ꢀ–ꢀ
1.26 (m, 20h), 0.94
ꢀ–ꢀ
0.82 (m, 9h)。
[0127]
实施例19将荧光素酶mrna稀释于10-100 mm，ph 4.0的柠檬酸缓冲液中；将各脂质组分（本发明所示阳离子脂质：dspc：胆固醇：peg脂质（dmg-peg2000））按照摩尔比50：10：38.5：1.5
溶于乙醇。
[0128]
将3 ml mrna缓冲液和1 ml脂质溶液分别装入两个5 ml注射器，安装于微流控注射泵上，将芯片连接到注射器，设定注射泵流速，点击注射泵的开始按键，以流速比3：1的方式注入芯片。观察芯片出口的产品颜色，弃去前5滴乳白色液滴（约为100 μl）后，后端样品收集到ep管中。将收集到的产品放入透析袋中，隔10 mm pbs（ph 7.4）透析6小时（截留分子量：100 kda），随后超滤浓缩至理想浓度，再将脂质纳米颗粒经0.22 μm无菌过滤器过滤，保存于4℃。
[0129]
按照ribogreen试剂盒说明，测试计算产品的包封率；于马尔文公司的zetasizer nano仪器上使用标准检测方法进行粒径与多分散系数（pdi）检测、zeta电位分析。
[0130]
本实施例所制备得到的负载mrna的lnp的粒径、pdi和包封率的检测结果如表1所示。结果表明，该配方下的脂质和mrna形成的纳米颗粒包封率较高、粒径均一，为100 nm左右，符合核酸递送载体的基本特征。
[0131]
表1、不同阳离子脂质制备的纳米颗粒表征结果
*dlin-mc3-dma为商业核酸递送系统onpattro的阳离子脂质。
[0132]
**表1的lipid m出自《optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mrna vaccines》mol ther nucleic acids 2019 vol. 15 pages 1-11，为sm-102的同类脂质。
[0133]
实施例20 利用纳米脂质颗粒组合物尾静脉注射递送荧光素酶mrna在体内表达效果测定在6-8周龄的balb/c小鼠通过尾静脉注射含5 μg mrna的luc-mrna-脂质纳米颗粒（luc-mrna对应的核苷酸序列见专利公开cn114380724a的seq id no:1），制备方法同实施例19。在特定时间点小鼠尾静脉注射d-luciferin potassium salt 100 μg，使用
perkinelmer小动物成像系统进行检测。fluc通常用于哺乳动物细胞培养物中以测量基因表达和细胞活力，其在底物荧光素存在下发射出生物性荧光。所用到的mrna的基本特征为arca帽结构，polya尾长度为100-120 nt，假尿嘧啶完全取代。检测结果如图1，其中本发明设计的化合物组成的纳米脂质颗粒组合物递送mrna至肝脏的水平大部分等效或者优于dlin-mc3-dma；部分化合物优于lipid m。
[0134]
实施例21 利用纳米脂质颗粒组合物肺部雾化递送荧光素酶mrna在体内表达效果测定6-8周龄的balb/c小鼠通过雾化方式，进行肺部递送入含有5 μg mrna的luc-mrna-脂质纳米颗粒，制备方法同实施例19。在特定时间点小鼠尾静脉注射d-luciferin potassium salt 100 μg，使用perkinelmer小动物成像系统进行检测。检测结果如图2，其中化合物7，35组成的纳米脂质颗粒组合物递送mrna表达的荧光水平优于lipid m和sm-102。
[0135]
实施例22 利用纳米脂质颗粒组合物递送新型冠状病毒mrna疫苗使用6周balb/c小鼠，于0、14天肌肉注射给与不同纳米脂质颗粒组合物递送的mrna新冠肺炎疫苗（omicron抗原mrna，对应的核苷酸序列见专利公开cn114380724a的seq id no:6）进行免疫，第28天（二次免疫后第14天）采血，通过酶联免疫吸附测定中和抗体滴度，评价不同纳米脂质颗粒组合物递送的mrna新冠肺炎疫苗对sars-cov-2病毒毒株感染的保护效果。结果如图3所示，由结果可知，化合物35组成的纳米脂质颗粒组合物递送新冠mrna的引起的中和抗体滴度为140万，而lipid m的为93万左右。
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实施例23 不同脂质组分和比例的纳米脂质颗粒组合物表征为研究不同辅助脂质和脂质比例下的成药性，对化合物35展开了实验设计。尝试将不同结构脂质（dope、dspc）、不同脂质比例（阳离子45~55%，peg脂质1.5~2.5%，结构脂质8~22%，胆固醇20.5~45.5%）、不同氮磷比（5~10）的脂质混合物，和luc mrna通过微流控法（方法同实施例19）混合制备纳米颗粒。结果见表2所示。
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表2、不同脂质比例（摩尔比例）制备的纳米颗粒表征结果
从表2结果可知，在该范围内的脂质混合物和mrna形成的纳米颗粒粒径均一、包封率高、成药性好。