一种基因工程醋酸杆菌、其构建方法及其应用

aldh）。
7.本发明中的菌株已提交菌种保藏。
8.【生物保藏说明】保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉；保藏日期：2022年5月3日；保藏编号：cctcc no：m2022536；分类命名：巴氏醋酸杆菌as1.41/pbbr1mcs-2-adha-aldh acetobacter pasteurianusas1.41/pbbr1mcs-2-adha-aldh。
9.本发明的目的之二在于提供一种上述基因工程醋酸杆菌的构建方法，包括以下步骤：步骤a、将醋酸杆菌组成型启动子、adha基因和aldh基因依次连接到可以在醋酸杆菌中稳定复制的质粒中，得到重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh；步骤b、将经过步骤a得到的重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh转入醋酸菌中，即得基因工程醋酸杆菌；其中，步骤a中，所述醋酸杆菌组成型启动子、adha基因和aldh基因均来源于巴氏醋杆菌as1.41；步骤a中，可以在醋酸菌中稳定复制的质粒为pbbr1mcs-2质粒。
10.在上述技术方案的基础上，本发明还可以作出如下的改进：进一步，所述步骤a具体包括如下步骤：步骤a1、pcr扩增醋酸杆菌组成型启动子；步骤a2、构建重组质粒pbbr-pro-adha；步骤a3、构建重组质粒pbbr-pro-aldh；步骤a4、以步骤a2的重组质粒pbbr-pro-adha为模板，进行pcr反应，得到扩增目的基因pro-adha序列；步骤a5、将步骤a3的重组质粒pbbr-pro-aldh和步骤a4得到的pro-adha序列进行连接反应，构建重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh。
11.进一步，所述步骤a1的具体操作为：以巴氏醋杆菌as1.41基因组为模板，设计引物对一和引物对二，分别进行pcr反应，采用引物对一得到醋酸杆菌adha的组成型启动子序列；采用引物对二得到醋酸杆菌aldh的组成型启动子序列；所述引物对一为：其中，单下划线部分为酶切位点上游sacⅰ，下游sacⅰ，双下划线部分为保护碱基；所述引物对二为：
其中，单下划线部分为酶切位点上游salⅰ，下游salⅰ，双下划线部分为保护碱基。
12.进一步，所述步骤a2的具体操作为：步骤a21、以巴氏醋杆菌as1.41基因组为模板，设计引物对三，进行pcr反应，得到adha基因序列；其中，pcr反应条件为:94-95℃预变性5分钟，94-95℃变性30秒，50-60℃退火30秒，72℃延伸3-5分钟，30-35个循环后72℃10分钟；所述引物对三为：其中，单下划线部分为酶切位点，上游sacⅰ，下游hindⅲ，双下划线部分为保护碱基；步骤a22、将质粒pbbr1mcs-2用限制性内切酶sacⅰ和hindⅲ处理，步骤a21得到的adha基因序列用限制性内切酶sacⅰ和hindⅲ处理，37℃条件下，处理0.5-10h，纯化回收；将酶切纯化回收的质粒和adha基因序列按摩尔比1：3-10混合，利用t
4 dna连接酶进行连接反应，16-21℃，连接1-12h；然后将连接产物转入大肠杆菌jm109感受态细胞中，获得重组质粒pbbr-adha。
13.步骤a23、将步骤a22得到的重组质粒pbbr-adha用限制性内切酶sacⅰ处理，步骤a1得到的醋酸杆菌adha的组成型启动子序列用限制性内切酶sacⅰ处理，37℃条件下，处理0.5-10h，纯化回收；将酶切纯化回收的质粒和启动子序列按摩尔比1：3-10混合，利用t
4 dna连接酶进行连接反应，反应温度16-21℃，连接1-12h；然后将连接产物转入大肠杆菌jm109感受态细胞中，获得重组质粒pbbr-pro-adha。
14.进一步，所述步骤a3的具体操作为：步骤a31、将质粒pbbr1mcs-2和步骤a1得到的醋酸杆菌aldh的组成型启动子序列用限制性内切酶salⅰ处理，37℃条件下，处理0.5-10h，纯化回收；将酶切纯化回收的质粒和启动子序列按摩尔比1：3-10混合，利用t
4 dna连接酶进行连接反应，反应温度16-21℃，连接1-12h；然后将连接产物转入大肠杆菌jm109感受态细胞中，获得重组质粒pbbr-pro2；步骤a32、以巴氏醋杆菌as1.41基因组为模板，设计引物对四，进行pcr反应，得到aldh基因序列；其中，pcr反应条件为:94-95℃预变性5分钟，94-95℃变性30秒，50-60℃退火 30秒，72℃延伸 3-5分钟，30-35个循环后72℃10分钟；所述引物对四为：其中，单下划线部分为酶切位点，上游xhoⅰ，下游kpnⅰ，双下划线部分为保护碱基；步骤a33、将pbbr-pro2用xhoⅰ和kpnⅰ处理，aldh基因序列用xhoⅰ和kpnⅰ处理，37℃条件下，处理0.5-10小时，纯化回收；将酶切纯化回收的序列pbbr-pro2和aldh基因序列按
摩尔比1：3-10混合，利用t
4 dna连接酶进行连接反应，16-21℃，连接1-12h；然后将连接产物转入大肠杆菌jm109感受态细胞中，获得重组质粒pbbr-pro-aldh。
15.进一步，所述步骤a4的具体操作为：以重组质粒pbbr-pro-adha为模板，设计引物对五，进行pcr反应，得到扩增目的基因pro-adha序列；所述引物对五为：其中，pcr反应条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃变性30秒，50-60℃退火30秒，72℃延伸2-4分钟，30-35个循环后72℃10分钟。
16.进一步，所述步骤a5的具体操作为：将步骤a3重组质粒pbbr-pro-aldh和步骤a4得到的pro-adha序列采用同源重组的方式进行连接反应，反应温度16-21℃，连接1-12h；然后将连接产物转入大肠杆菌jm109感受态细胞中，获得重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh。
17.进一步，所述步骤b利用电激转化法将重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh转入醋酸杆菌as1.41中，获得含有重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh的基因工程醋酸杆菌。
18.进一步，所述步骤b的具体操作为：步骤b1、在平板上挑取一环醋酸杆菌as1.41接入种子培养基，30℃，180-220转/分钟预培养12-24小时，至od
600
＞0.6；取2.5ml预培养的种子液接入装有50-100ml种子培养基的三角瓶中，30℃，180-220转/分钟培养6-10小时，至od
600
为0.5-0.9；步骤b2、将装有菌液的三角瓶冰水浴30-60分钟，取1ml菌液于1.5ml离心管中，4℃，5000转/分钟，离心5-10分钟，弃上清；步骤b3、在离心管中加入提前预冷的10%的甘油溶液重悬菌体，使菌体充分扩散后于4℃，5000转/分钟，离心5-10分钟，弃上清；步骤b4、重复两次步骤b3后，在离心管中加入100μl预冷的10%的甘油溶液，吹吸混匀;步骤b5、在离心管中加入构建好的重组质粒1-5μl，混匀，加入预冷的2mm电脉冲杯中，冰浴1-5分钟；步骤b6、打开电脉冲仪，2500kv，5ms电激后，立即加入1ml预冷的种子培养基，混匀后转入离心管中，30℃，100转/分钟，培养6-10小时后，涂布到加有卡那霉素的选择平板上，30℃倒置培养24-60小时，获得含有重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh的基因工程醋酸杆菌as1.41。
19.本发明的目的之三在于提供一种上述基因工程醋酸杆菌的应用，其应用于发酵生产醋酸产品。
20.本发明的优点在于：本发明通过构建含有adha和aldh的重组质粒并转入醋酸杆菌中，获得过量表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的基因工程醋酸杆菌，从而提高醋酸发酵过程中乙醇到醋酸的转化效率。发酵结束后，基因工程菌株乙酸浓度为39.77g/l，与原始菌株相比乙酸产量提高24.6%，乙醇转化率高达85.48%，比原始菌株提高18.2%。
附图说明
21.图1为本发明的重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh用kpnⅰ单酶切示意图；图2为醋酸杆菌adha的组成型启动子扩增示意图；图3为adha基因序列扩增示意图；图4为重组质粒pbbr-adha用sacⅰ，hindⅲ双酶切验证示意图；图5为醋酸杆菌aldh的组成型启动子扩增示意图；图6为aldh基因序列扩增示意图；图7为重组质粒pbbr-pro-aldh用xhoⅰ、kpnⅰ双酶切验证示意图；图8为目的基因pro-adha序列的扩增示意图；图9为基因工程菌和原始菌株发酵结束后的产乙酸图；图10为基因工程菌和原始菌株发酵结束后的乙醇转化率图。
具体实施方式
22.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
23.本实施例提供一种过量表达adha、aldh的高产乙酸的基因工程醋酸杆菌（as1.41/pbbr1mcs-2-adha-aldh），于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为：cctcc no：m 2022536；分类命名为：巴氏醋酸杆菌as1.41/pbbr1mcs-2-adha-aldh acetobacter pasteurianusas1.41/pbbr1mcs-2-adha-aldh。
24.其构建方法主要包括如下操作步骤：步骤a、将醋酸杆菌高效组成型启动子、adha、aldh基因在可以在醋酸杆菌中稳定复制的质粒pbbr1mcs-2中依次连接，得到重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh。
25.步骤b、将经过步骤a得到的重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh转入醋酸菌中，即得基因工程醋酸杆菌。
26.本实施例中，操作步骤a中所述醋酸杆菌高效组成型启动子来源于巴氏醋杆菌as1.41，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmcc 1.2269。
27.本实施例中，操作步骤a中得到的重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh用kpnⅰ单酶切示意图如图1所示，其中，m:dna marker；1:质粒单酶切对照；2：双基因单酶切（kpnⅰ）本实施例中，操作步骤a具体包括如下步骤：（1）以巴氏醋杆菌as1.41基因组为模板，设计引物对一，进行pcr反应，得到醋酸杆菌adha的组成型启动子序列如序列seq id no:1所示；其中pcr反应所用到的引物对一为：其中，单下划线部分为酶切位点上游sacⅰ，下游sacⅰ，双下划线部分为保护碱基；pcr反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火 30秒，72℃延伸60秒，34个循环后72℃10分钟；pcr反应体系如下表1所示：
adha，该重组质粒pbbr-adha用sacⅰ，hindⅲ双酶切验证示意图如图4所示，其中，m:dna marker；1：padha双酶切（sacⅰ，hindⅲ）；2:质粒单酶切对照。
31.利用基因测序反应对重组质粒pbbr-adha的序列进行验证。
32.（4）将重组质粒pbbr-adha和步骤（1）得到的醋酸杆菌adha的组成型启动子序列分别用限制性内切酶sacⅰ处理，37℃条件下，处理0.5-10h，纯化回收；将酶切纯化回收的质粒和启动子序列按摩尔比1：3-10混合，利用t
4 dna连接酶进行连接反应，反应温度16-21℃，连接1-12h；然后将连接产物转入大肠杆菌jm109感受态细胞中，获得重组质粒pbbr-pro-adha；利用基因测序反应对重组质粒pbbr-pro-adha的序列进行验证。
33.（5）以巴氏醋杆菌as1.41基因组为模板，设计引物对二，进行pcr反应，得到醋酸杆菌aldh的组成型启动子序列如序列seq id no:3所示；其中pcr反应所用到的引物对二为：其中，单下划线部分为酶切位点上游salⅰ，下游salⅰ，双下划线部分为保护碱基；醋酸杆菌aldh的组成型启动子扩增示意图如图5所示，其中，m:dna marker；1:醋酸杆菌aldh的组成型启动子pcr扩增；pcr反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火 30秒，72℃延伸60秒，34个循环后72℃10分钟；pcr反应体系如下表3所示：表3 步骤（5）的pcr反应体系(50μl)利用基因测序反应进行醋酸菌组成型启动子序列的验证。
34.（6）将质粒pbbr1mcs-2和步骤（5）得到的启动子序列分别用限制性内切酶salⅰ处理，37℃条件下，处理0.5-10h，纯化回收；将酶切纯化回收的质粒和启动子序列按摩尔比1：3-10混合，利用t
4 dna连接酶进行连接反应，反应温度16-21℃，连接1-12h；然后将连接产物转入大肠杆菌jm109感受态细胞中，获得重组质粒pbbr-pro2。
35.利用基因测序反应对重组质粒pbbr-pro2的序列进行验证。
36.（7）以巴氏醋杆菌as1.41基因组为模板，设计引物对四，进行pcr反应，得到aldh基因序列如序列seq id no:4所示；其中pcr反应所用到的引物对四为:
其中，单下划线部分为酶切位点，上游xhoⅰ，下游kpnⅰ，双下划线部分为保护碱基；pcr反应条件为:95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火 30秒，72℃延伸90分钟，34个循环后72℃10分钟；pcr反应体系如下表4所示：表4 步骤（7）的pcr反应体系(50μl)aldh基因序列扩增示意图参见图6；其中m:dna marker；1:aldh pcr扩增。
37.利用基因测序反应进行aldh基因的序列进行验证。
38.（8）将步骤（6）得到的重组质粒pbbr-pro2用用xhoⅰ和kpnⅰ处理，步骤（7）得到的aldh基因序列限制性内切酶xhoⅰ和kpnⅰ处理，37℃条件下，处理0.5-10h，纯化回收；将酶切纯化回收的质粒和aldh基因序列按摩尔比1：3-10混合，利用t
4 dna连接酶进行连接反应，16-21℃，连接1-12h；然后将连接产物转入大肠杆菌jm109感受态细胞中，获得重组质粒pbbr-pro-aldh。
39.该重组质粒pbbr-pro-aldh用xhoⅰ、kpnⅰ双酶切验证示意图参见图7，其中，m:dna marker；1：paldh双酶切（xhoⅰ、kpnⅰ）；2:质粒单酶切对照。
40.利用基因测序反应对重组质粒pbbr-pro-aldh的序列进行验证。
41.（9）以重组质粒pbbr-pro-adha为模板，设计引物对五，进行pcr反应，得到扩增目的基因pro-adha序列；其中pcr反应所用到的引物对五为：其中pcr反应所用到的引物对五为：其中，双下划线部分为同源重组连接时的同源臂；pcr反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2.5分钟，34个循环后72℃10分钟；pcr反应体系如下表5所示：表5 步骤（9）的pcr反应体系(50μl)
目的基因pro-adha序列的扩增示意图参见图8，其中，m:dna marker；1:pro-adha pcr扩增。
42.（10）将重组质粒pbbr-pro-aldh和步骤（9）得到的pro-adha序列采用同源重组的方式进行连接反应，反应温度16-21℃，连接1-12h；然后将连接产物转入大肠杆菌jm109感受态细胞中，获得重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh。
43.利用基因测序反应对重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh的序列进行验证。
44.本实施例中，步骤b利用电激转化法将验证成功的重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh转入醋酸杆菌as1.41中，获得含有重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh的基因工程醋酸杆菌。
45.本发明中电激转化法具体操作如下：
①
在平板上挑取一环醋酸杆菌as1.41接入种子培养基，30℃，180-220转/分钟预培养12-24小时，至od
600
＞0.6；取2.5ml预培养的种子液接入装有50-100ml种子培养基的三角瓶中，30℃，180-220转/分钟培养6-10小时，至od6
00
为0.5-0.9；
②
将装有菌液的三角瓶冰水浴30-60分钟，取1ml菌液于1.5ml离心管中，4℃，5000转/分钟，离心5-10分钟，弃上清；
③
在离心管中加入提前预冷的10%的甘油溶液重悬菌体，使菌体充分扩散后于4℃，5000转/分钟，离心5-10分钟，弃上清；
④
重复两次步骤
③
后，在离心管中加入100μl预冷的10%的甘油溶液，吹吸混匀;
⑤
在离心管中加入构建好的重组质粒1-5μl，混匀，加入预冷的2mm电脉冲杯中，冰浴1-5分钟；
⑥
打开电脉冲仪，2500kv，5ms电激后，立即加入1ml预冷的种子培养基，混匀后转入离心管中，30℃，100转/分钟，培养6-10小时后，涂布到加有适当卡那霉素的选择平板上，30℃倒置培养24-60小时，获得含有重组质粒pbbr-pro-adha-pro-aldh的基因工程醋酸杆菌as1.41.本实施例提供的过量表达adha、aldh的高产乙酸的基因工程醋酸杆菌可以应用于醋酸发酵中，具体的可应用于发酵生产蜂蜜醋，以蜂蜜酒为发酵原料。
46.本发明通过构建含有adha和aldh的重组质粒并转入醋酸杆菌中，获得过量表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的基因工程醋酸杆菌，从而提高醋酸发酵过程中乙醇到醋酸的转化效率。
47.将本发明构建的基因工程醋酸杆菌、接入空质粒的醋酸杆菌和原始菌株进行无水
乙醇的发酵培养，考察其乙酸产率和乙醇转化效率。
48.具体实验操作：菌株扩培：挑取平板上一环菌落，接入种子培养基（250ml摇瓶，50ml培养基）中，培养温度30℃，转速200rpm条件下，培养至od
600
为0.8～1.2。
49.接种：在发酵培养基中（300ml摇瓶，60ml培养基）中，添加25μg/ml卡那抗生素，接种前添加4%（v/v)的无水乙醇，按初始0.03mg/ml菌体量接入种子液，发酵温度30℃，转速200rpm条件下进行发酵培养，直至发酵结束，利用高效液相色谱法测量其乙酸浓度和酒精浓度。
50.（1）乙酸浓度测量条件色谱条件：色谱柱：aminex hpx-87h （300 mm
×
7.8 nm，bio-rad，hercules）有机酸分析柱，检测器：waters 2487紫外检测器，检测器波长：205nm，流动相：0.005 mol/l h2so4，流速：0.5 m l/min，进样量：20 μl。
51.（2）乙醇浓度测量色谱条件：色谱柱：aminex hpx-87h （300 mm
×
7.8 nm，bio-rad，hercules）有机酸分析柱，检测器：waters 2414示差折光检测器，流动相：0.005 mol/l h2so4，流速：0.5 m l/min，柱温50℃，进样量：20 μl。
52.乙醇转化率：cr（%）=（c
acid
/c
alcohol
x1.304）x100%，其中c
acid
是发酵过程中生成的乙酸浓度（g/l)，c
alcohol
是培养基中消耗的乙醇浓度（g/l)。
53.参见图9，本发明的基因工程菌和原始菌株发酵结束后的产乙酸图和图10，本发明的基因工程菌和原始菌株发酵结束后的乙醇转化率图，发酵结束后，基因工程菌株乙酸浓度为39.77g/l，与原始菌株相比乙酸产量提高24.6%，乙醇转化率高达85.48%，比原始菌株提高18.2%。
54.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。