角蛋白酶突变体及与胆汁酸的复配制剂和在添加剂的应用的制作方法

1.本发明属于酶工程领域，具体涉及角蛋白酶突变体及与胆汁酸的复配制剂和在添加剂的应用。


背景技术：

2.角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如角质，皮屑，羽毛等)的特异性角蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物以角蛋白为单一碳源生长时产生。角蛋白酶作为一种底物专一性较宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，广泛地运用于日化行业、畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中，具有巨大的研究与应用价值。角蛋白中其粗蛋白含量在80％以上，各种氨基酸总量在70％以上，动物必需氨基酸种类齐全，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白以及肥料来源，对它的开发利用具有重要的应用前景。目前，野生角蛋白酶大多属于高温碱性蛋白酶，其最适反应温度一般为60℃左右，在20℃-40℃条件下的酶活或者催化活性一般不高。
3.易错pcr技术是采用dna聚合酶在进行pcr反应扩增目的片段的同时，通过调整反应条件，增加基因突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，再通过高通量方式筛选需要的正向突变体。易错pcr技术是蛋白质分子改造中的重要手段。


技术实现要素：

4.本发明提供了角蛋白酶突变体及与胆汁酸的复配制剂和在添加剂的应用。本发明通过筛选得到在低温条件下，酶活力提高的突变体km1、km2、km3，且能够与胆汁酸混合制成新的饲料添加剂，有效的降低禽畜动物的腹泻情况，提高其肠道功能。
5.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明提供了角蛋白酶突变体，所述角蛋白酶突变体为角蛋白酶突变体km，其氨基酸序列如seq id no：3所示、或者如seq id no：5所示、或者如seq id no：7所示。
6.进一步的，所述角蛋白酶突变体km具体为由氨基酸序列为seq id no：1的角蛋白酶的第191位的天冬酰胺变为天冬氨酸获得的角蛋白酶突变体km1；由氨基酸序列为seq id no：1的角蛋白酶的第191位的天冬酰胺变为天冬氨酸和第149位的缬氨酸变为丙氨酸获得的角蛋白酶突变体km2；由氨基酸序列为seq id no：1的角蛋白酶的第191位的天冬酰胺变为天冬氨酸和第232位的甘氨酸变为谷氨酸获得的角蛋白酶突变体km3。
7.本发明还提供了一种编码基因，所述编码基因为所述的角蛋白酶突变体km的编码基因，其核苷酸序列如seq id no：4所示、或者如seq id no：6所示、或者如seq id no：8所示。
8.本发明还提供了一种重组表达载体，其包含所述的角蛋白酶突变体km的编码基因。
9.本发明还提供了一种重组工程菌，其包含所述的角蛋白酶突变体km的编码基因。
10.进一步的，所述重组工程菌为枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌。
11.本发明还提供了一种含胆汁酸的复配制剂，所述复配制剂中同时包含角蛋白酶突变体km和胆汁酸。
12.进一步的，所述复配制剂是由含角蛋白酶突变体km的重组工程菌经发酵、过滤干燥制得的粉制剂与胆汁酸以1:1~5的质量体积比混合而成的。
13.进一步的，所述角蛋白酶突变体km为角蛋白酶突变体km3。
14.本发明还提供了所述的角蛋白酶突变体km或者所述的复配制剂在用于酶解动物角蛋白中的应用。
15.进一步的，所述动物角蛋白为鸡毛、鸭毛、鹅毛、羊毛、牛毛、猪毛以及角和指甲中的角蛋白。
16.本发明还提供了所述的角蛋白酶突变体km或者所述的复配制剂在用于制备降低动物腹泻的动物饲料添加剂中的应用。
17.进一步的，所述角蛋白酶突变体km或复配制剂的用量为100 g/t动物饲料~500 g/t动物饲料。
18.与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明以bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因为基础，筛选得到了包含n191d的单点突变体km1，以及包含n191d/v149a、n191d/g232e的双位点突变体km2和km3。本发明改造后的突变体km1，km2，km3相比于原始角蛋白酶，突变体在30℃反应条件下，酶活力分别是原始角蛋白酶的1.5、2.05、2.9倍。本发明还利用含突变体km3的工程菌经发酵、过滤干燥制得的酶制剂与胆汁酸进行复配，不仅其具有很好的酶解豆粕抗原蛋白的效果，而且用于禽畜养殖中，能够明显起到防腹泻作用，并保护动物的肠胃。
附图说明
19.图1是所述角蛋白酶基因扩增电泳结果图。
20.图2是所述角蛋白酶突变体筛选图。
21.图3是所述角蛋白酶突变体在30℃条件下酶活力分析。
22.图4是所述角蛋白酶突变体km3在15l发酵罐中的发酵数据。
23.图5是角蛋白酶突变体体外酶解豆粕抗原蛋白的胶图，其中编号1是豆粕未做处理，编号2-5分别是加入200u/ml角蛋白酶后处理2h、4h、8h、16h。
具体实施方式
24.为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
25.以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
26.1、菌株和载体枯草芽胞杆菌wb600，质粒pwb980，大肠杆菌bl21，质粒pet-21a( )购自
invitrogen公司。
27.2、试剂与培养基质粒提取试剂盒，片段纯化回收试剂盒，限制性内切酶，蛋白marker：blue plus ii protein marker (14-120 kda)等购自南京诺唯赞股份有限公司；氨苄青霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；genemorph ii随机突变pcr试剂盒购自stratagene公司。
28.lb培养基配方：1％胰蛋白胨，0 .5％酵母提取物，1％nacl。
29.发酵培养基配方：豆粕3.5-10%、棉籽粕5-10%、玉米粉2-6%、ppg-20000 0.5-1.0%、蛋白酶0.5-1.0%、淀粉酶0.5-1.0%、磷酸氢二钠0.2-0.5%，以质量比计。
30.3、酶活力测定：参照《gbt 23527-2009 蛋白酶制剂》中蛋白酶的测定方法。
31.实施例1：角蛋白酶基因重组菌构建及其突变体文库构建参考bacillus licheniformis来源的角蛋白酶氨基酸序列(seq id no：1)和dna序列(seq id no：2)设计引物，在5’端设计kpn i限制性酶切位点，3’端设计bamh i限制性酶切位点，进行pcr扩增目的条带，使用的引物如下：kf: cggggtaccatgatgaggaaaaagagttt（seq id no：9）；kr: cgcccatccttattgagcggcagcttcga（seq id no：10）。
32.反应体系如下：pcr上游引物（25pmol/
µ
l）1
µ
lpcr下游引物（25pmol/
µ
l）1
µ
l dntp混合液4
µ
l pcrbuffer5
µ
l模板dna1
µ
ldna聚合酶0.5
µ
l加双蒸水至总体积50
µ
l反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性10 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸1min，循环30次，72℃，后延伸10min，15℃保存。
33.将pcr产物进行电泳，电泳结果如图1所示，将条带单一的pcr产物进行纯化，双酶切，与pwb980载体进行连接（按照试剂盒说明步骤进行），并转化枯草芽胞杆菌wb600，涂布含有抗生素的平板，筛选重组菌。
34.突变体文库构建，用genemorph ii随机突变pcr试剂盒，以seq id no：2的基因为模版，进行随机突变，使用的引物序列如下：kf: cggggtaccatgatgaggaaaaagagttt（seq id no：9）；kr: cgcccatccttattgagcggcagcttcga（seq id no：10）。
35.将扩增好的随机突变pcr产物用kpn i和bamh i双酶切，连接到pwb980载体上，转化枯草芽孢杆菌wb600，卡那霉素抗性lb平板筛选阳性克隆。
36.将筛选的转化子单菌落接种到96孔深孔板。每个平板接入3个表达原始角蛋白酶的单菌落k0为对照。每孔装入500
µ
l 含卡那霉素抗性的lb液体培养基， 37℃200rpm震荡培养24小时后， 将发酵液离心取上清，然后检测角蛋白酶的酶活性。结果如图2所示，将低温条件下（20℃-40℃）酶活明显高于对照k0的突变体基因进行重复验证和测序分析。
37.筛选到以原始角蛋白酶为出发模板，低温条件下酶活力提高的突变体n191d，命名
为km1，氨基酸序列如seq id no：3所示，其编码的核苷酸序列如 seq id no：4所示。
38.实施例2：易错pcr方式构建角蛋白酶km1的突变体文库以实施例1中筛选到的角蛋白酶基因km1为模版，进行第二轮随机突变，突变库构建过程以及使用材料试剂和操作条件等均同实施例1；突变体培养和筛选时以km1为对照，经过检测角蛋白酶突变体的酶活力，将低温条件下酶活力高于km1的突变体基因进行测序。
39.最终筛选到以下突变体：km2突变方式为n191d/v149a，其氨基酸序列如seq id no：5所示，核苷酸序列如seq id no：6所示；km3突变方式为n191d/g232e，其氨基酸序列如seq id no：7所示，核苷酸序列如seq id no：8所示。
40.实施例3：角蛋白酶突变体重组菌摇瓶发酵表达验证分别将上述含有突变体km1，km2，km3的重组菌接种到发酵培养基中，进行摇瓶发酵78h后，将培养液离心获得上清，30℃条件下测定每个突变体发酵液上清的平均酶活。
41.结果如图3所示，突变后得到的角蛋白酶km1，km2，km3在30℃条件下的酶活力分别是原始角蛋白酶k0的1.5，2.05，2.9倍，其中km3突变体能够更好地在低温条件下发挥酶解催化功能。
42.实施例4：角蛋白酶突变体在15l发酵罐中发酵和制备将表达角蛋白酶突变体km3的基因工程菌分别划线于含有卡那霉素抗性的（终浓度为20μg/ml）lb平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落进行发酵。发酵生产工艺如下：（1）重组进接种于lb液体培养基，37℃，200 rpm，过夜震荡培养；（2）将过夜培养的种子液接种15l发酵罐，装液量为8l；（3）控制条件：37℃，300-600rpm；溶氧20%-60%；罐压0.05mpa；通气量0-8h 0.6 m3/h； 8h至停罐 0.8-0.9 m3/h。
43.（4）发酵至镜检芽孢生成率为90%以上。
44.（5）停罐，发酵液经过5000 rpm离心5 min后，获得上清酶液。
45.（6）发酵过程ph自然，发酵24h后开始测定酶活力，待发酵结束后（一般48h），发酵液通过板框过滤机处理得到粗酶液，再经喷塔喷干成角蛋白酶粉制剂，用于应用测试。
46.发酵过程曲线如图4所示：每隔4h取样，测定产酶水平，角蛋白酶突变体km3发酵48h后抑菌活性达到最高点。
47.实施例5：角蛋白酶体外酶解豆粕抗原蛋白实验豆粕是最常用的饲料原料，是畜禽重要的蛋白质营养来源，多年来一直占我国蛋白质饲料原料的70%以上。角蛋白酶可以有效消除胰蛋白酶抑制因子的作用，降解植物角蛋白、抗原蛋白（致敏原），提高蛋白原料的利用效率，显著降低粪尿中氮排出量，预防食源性腹泻和促进生长。已经确认的大豆抗原蛋白有32种，其中大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白是免疫原性最强的大豆抗原蛋白，占大豆籽实总蛋白的65%～80%，是大豆中主要的抗原蛋白。
48.本实施例中，将豆粕经过研磨，磨成细粉后，用磷酸缓冲液（ph 7.5-9.0）配制成0.1g/ml的豆粕悬浮液。将实施例4制备的角蛋白酶发酵酶液经过0.22μm的无菌过滤膜除菌后，稀释至200u/ml备用。对照组取5ml上述悬浮液加入1ml无菌水；实验组取5ml上述悬浮液
加入1ml含有200u/ml的角蛋白酶的酶液。试验组和对照组一起放入40℃、100转的水浴摇床，进行酶解消化，分别取2h、4h、8h和16h的酶解样品。经过sds-page分析酶解消化情况和抗原蛋白去除情况。
49.从图5可以看出，经过酶解8h后，角蛋白酶突变体可以去除大部分抗原蛋白，显著降低致敏原，同时将难以消化的大分子蛋白质酶解成小肽，可以对畜禽等动物起到很好的促生长作用。
50.实施例6：复配制剂的制备及动物养殖试验将实施例4中制备的角蛋白酶粉制剂以1:1的质量体积比与胆汁酸均匀混合，制备成复配制剂。其中，胆汁酸的有效成分组成包括猪胆酸、猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸，所述猪胆酸和猪去氧胆酸之和的重量百分比为78.0％，鹅去氧胆酸的重量百分比为20.0％，其余为水分和灰分 (重量百分比总和以100％计算)。
51.选取某养殖场断奶仔猪，体重在10
±
0.60 kg/头，对照组选取30头，做3个重复，每个重复选取10头；试验组选取30头，做3个重复，每个重复选取10头。对照组和试验组均饲喂低蛋白日粮，粗蛋白含量20%，但试验组同时在饲料中添加200 g/t的复配制剂；分别饲喂，试验期共30天。定期统计断奶仔猪的采食量，并称重，计算料重比和腹泻指数。
52.结果如表1所示，两组的日增重和料重比基本上差异不大，而从腹泻指数来看，试验组腹泻指数降低了40%。说明通过在饲料中添加含本发明的角蛋白酶和胆汁酸的复配制剂，可以有效降低乳仔猪饲料中的粗蛋白，促进蛋白质利用率，同时可以起到显著的防腹泻作用，保护乳仔猪的肠胃。
53.表1动物养殖试验数据 日增重/g料重比腹泻指数对照组444
±
3.111.44
±
0.0562.51
±
0.22试验组448
±
0.751.42
±
0.0281.50
±
0.24以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。