代谢工程方法、产羊毛甾醇工程菌及其构建方法、应用与流程

技术特征：
1.一种基于m6a甲基转移酶ime4的代谢工程方法，其特征在于，包括：将酵母内源性ime4基因的启动子替换为组成型启动子pgk1p。2.一种根据权利要求1所述的基于m6a甲基转移酶ime4的代谢工程方法在构建酿酒酵母工程菌中的应用。3.一种产羊毛甾醇工程菌，其特征在于，所述产羊毛甾醇工程菌以酿酒酵母为出发菌株，过表达ime4、thmgr、upc2-1和erg9基因；其中，替换酵母内源性ime4基因的启动子为组成型启动子pgk1p；thmg1和upc2-1基因整合到酿酒酵母染色体ndt80位点；替换酵母内源性erg9基因的启动子为组成型启动子tef1p；所述upc2-1基因为upc2基因第888位的甘氨酸突变为天冬氨酸得到的upc2-1基因。4.根据权利要求3所述的产羊毛甾醇工程菌，其特征在于，所述thmgr和upc2基因的核苷酸序列分别如seq id no.1～2所示；所述upc2-1基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述pgk1p和tef1p启动子的核苷酸序列分别如seq id no.4～5所示。5.根据权利要求3所述的产羊毛甾醇工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母为酿酒酵母by4741。6.一种产羊毛甾醇工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将启动子pgk1p和筛选标记met重叠，构建表达模块met-pgk1p；将基因thmgr、启动子tdh2p和终止子adh1t重叠，构建基因表达模块tdh2p-thmer-adh1t；将基因upc2-1、启动子tpi1p和终止子cyc1t重叠，构建基因表达模块tpi1p-upc2-1-cyc1t；所述upc2-1基因为upc2基因第888位的甘氨酸突变为天冬氨酸得到的upc2-1基因；将所述基因表达模块tdh2p-thmer-adh1t、基因表达模块tpi1p-upc2-1-cyc1t和ura筛选标记重叠，构建基因表达模块ura-tdh2p-thmer-adh1t-tpi1p-upc2-1-cyc1t；将启动子tef1p和筛选标记leu重叠，构建表达模块leu-tef1p；将所述表达模块met-pgk1p转化酵母菌株，利用酵母缺陷型培养基筛选培养sd-met，得到菌株st01；将所述基因表达模块ura-tdh2p-thmer-adh1t-tpi1p-upc2-1-cyc1t转化所述菌株st01，利用酵母缺陷型培养基sd-met-ura筛选培养，得到菌株st02；将所述表达模块leu-tef1p转化所述菌株st02，利用酵母缺陷型培养基sd-met-ura-leu筛选培养，即得产羊毛甾醇工程菌。7.根据权利要求6所述的产羊毛甾醇工程菌的构建方法，其特征在于，所述thmgr和upc2基因的核苷酸序列分别如seq id no.1～2所示；所述upc2-1基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述pgk1p、tef1p、tdh2p和tpi1p为启动子序列，对应核苷酸序列分别如seq id no.4～7所示；所述adh1t和cyc1t为终止子序列，对应核苷酸序列分别为seq id no.8～9所示；所述筛选标记met的核苷酸序列如seq id no.10所示；所述筛选标记ura的核苷酸序列如seq id no.11所示；
所述筛选标记leu的核苷酸序列如seq id no.12所示。8.根据权利要求6所述的产羊毛甾醇工程菌的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母为酿酒酵母by4741。9.一种根据权利要求3-5任一所述的产羊毛甾醇工程菌或者根据权利要求6-8任一所述的产羊毛甾醇工程菌的构建方法所构建得到的产羊毛甾醇工程菌在生产羊毛甾醇中的应用。10.一种羊毛甾醇的生产方法，其特征在于，包括：将权利要求3-5任一所述的产羊毛甾醇工程菌或者权利要求6-8任一所述的产羊毛甾醇工程菌的构建方法所构建得到的产羊毛甾醇工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到羊毛甾醇。

技术总结
本申请适用于微生物技术领域，提供了一种代谢工程方法、产羊毛甾醇工程菌及其构建方法、应用。其中，所述基于m6A甲基转移酶IME4的代谢工程方法，包括：将酵母内源性IME4基因的启动子替换为组成型启动子PGK1p。本申请提供的基于酿酒酵母m6A甲基转移酶IME4的代谢工程方法，可有效促进单倍体酿酒酵母工程菌羊毛甾醇产量。醇产量。醇产量。


技术研发人员：李德芳 安天悦 王国丽 林春华 李明凯 武振科 郑秋生
受保护的技术使用者：烟台毓璜顶医院
技术研发日：2022.05.16
技术公布日：2022/7/22