一种检测BCR-ABL融合基因的ERA引物和探针及试剂盒的制作方法

一种检测bcr-abl融合基因的era引物和探针及试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测bcr-abl融合基因的era引物和探针及试剂盒。


背景技术：

2.慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，cml)是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，占成人白血病的15％。针对cml分子发病机制的小分子酪氨酸激酶抑制剂(tki)将cml的治疗带入了分子靶向治疗阶段，显著延长了患者的生存时间。cml发病机制主要为9号染色体和22号染色体易位形成ph染色体，产生bcr-abl融合基因。bcr-abl融合基因中bcr基因的断裂区主要分为三个类型：major-bcr(m-bcr)、minor(m-bcr)和u-bcr。其中，m-bcr区bcr基因的断裂点通常被限制在一个5.8kb的dna片段区域，断裂点发生在外显子e13和e14或e14和e15之间，断裂后的bcr基因外显子上游留在22号染色体上，并与abl基因断裂后的外显子a2融合，转录为e13a2或e14a2型mrna，编码p210融合蛋白，见于95％以上的cml病例中；m-bcr区域的bcr基因断裂点通常发生在外显子e1和e2之间，转录为e1a2型的mrna，编码p190融合蛋白，见于3％非典型cml和2/3的ph 急性b淋巴细胞白血病病例中；u-bcr区域的bcr基因断裂点通常发生在外显子e19和e20之间，转录为e19a2型mrna，编码p230融合蛋白，常见于慢性中性粒细胞白血病病例中。cml表现为持续、进行性外周血白细胞数量增加，且分类中出现不同分化阶段的粒细胞(主要以中性粒细胞增多为主)，90％以上患者白血病细胞中有恒定的、特征性的ph染色体及其分子标志bcr-abl融合基因。因此，bcr-abl融合基因检测已经成为cml诊断的“黄金标准”。
3.目前检测bcr-abl融合基因的方法主要有荧光原位杂交法、荧光定量pcr法、基因芯片法、pcr测序法等。然而，该类方法均存在设备依赖性、成本高、实验方法繁琐，时间长等缺点。
4.酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification，era)方法自近年来被开发出来后，因其快速(15-30分钟)、简易(无需特殊设备)、灵敏、特异等特点近年来被广泛用于病毒、细菌等物种的鉴定工作，为物种大规模快速检测做出了巨大贡献。


技术实现要素：

5.本发明的目的是解决现有技术中检测bcr-abl融合基因的方法存在的不足，提供一种检测bcr-abl融合基因的era引物和探针及试剂盒。
6.技术方案
7.一种检测bcr-abl融合基因的era引物和探针，包括检测bcr-abl1基因的era引物和探针以及检测bcr-abl2基因的era引物和探针；
8.所述检测bcr-abl1基因的era引物和探针包括bcr-abl1-f1引物、bcr-abl12-r反向引物和bcr-abl12-pb探针，所述bcr-abl1-f1引物的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述bcr-abl12-r反向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述bcr-abl12-pb探针引物的
核苷酸序列如seq id no:4所示；
9.所述检测bcr-abl2基因的era引物和探针包括bcr-abl2-f78引物、bcr-abl12-r反向引物和bcr-abl12-pb探针，所述bcr-abl2-f78引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述bcr-abl12-r反向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述bcr-abl12-pb探针引物的核苷酸序列如seq id no:4所示。
10.一种检测bcr-abl融合基因的试剂盒，包括上述检测bcr-abl1基因的era引物和探针以及检测bcr-abl2基因的era引物和探针。
11.进一步，所述试剂盒还包括溶解剂和激活剂。
12.一种检测bcr-abl融合基因的方法：以待测样本dna为模板，采用上述检测bcr-abl1基因的era引物和探针以及检测bcr-abl2基因的era引物和探针进行酶促重组等温扩增，得到扩增产物，对扩增产物进行检测，根据检测结果进行判断。
13.所述检测bcr-abl1基因的反应体系为：
[0014][0015]
所述检测bcr-abl2基因的反应体系为：
[0016][0017][0018]
所述酶促重组等温扩增的反应条件为：37℃下恒温反应20min。
[0019]
本发明的有益效果：
[0020]
本发明提供了一种检测bcr-abl融合基因的era引物和探针及试剂盒，能够快速(15-30分钟)、灵敏、特异的检测出三种类型的bcr-abl融合基因，检测覆盖度高，并且操作简单，不需要复杂仪器，检测成本低。
附图说明
[0021]
图1为针对bcr-abl1型bcr-abl融合基因的灵敏度和特异性检测结果，
[0022]
图2为针对bcr-abl2型bcr-abl融合基因的灵敏度和特异性检测结果。
具体实施方式
[0023]
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0024]
实施例1
[0025]
引物和探针的设计与合成：
[0026]
利用bcr-abl1(核苷酸序列如seq id no:5所示)和bcr-abl2(核苷酸序列如seq id no:6所示)融合位点附近特异序列，设计检测bcr-abl融合基因的era引物和探针，包括检测bcr-abl1基因的era引物和探针以及检测bcr-abl2基因的era引物和探针，共设计了3条era引物和一条特异性荧光探针，核苷酸序列见表1：
[0027]
表1引物和探针序列
[0028][0029]
引物和探针序列送至金斯瑞有限公司合成，合成后稀释为10um备用。其中，检测bcr-abl1基因的era引物和探针包括bcr-abl1-f1引物、bcr-abl12-r反向引物和bcr-abl12-pb探针，检测bcr-abl2基因的era引物和探针包括bcr-abl2-f78引物、bcr-abl12-r反向引物和bcr-abl12-pb探针。
[0030]
实施例2
[0031]
一种检测bcr-abl融合基因的方法：以待测样本dna为模板，采用实施例1的检测bcr-abl1基因的era引物和探针以及检测bcr-abl2基因的era引物和探针进行酶促重组等温扩增，所述酶促重组等温扩增的反应条件为：37℃下恒温反应20min；得到扩增产物。对扩增产物进行检测，由于本发明中设计有特异性较强的寡核苷酸链—taqman探针，探针与靶序列互补配对，在扩增产物进行延伸反应时，聚合酶的5’核酸外切酶活性将探针切断，使得探针上的5’端荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团分离，发射荧光，荧光信号与产物的量相匹配，因而可根据荧光信号的强弱来判断产物扩增量的结果。
[0032]
检测bcr-abl1基因亚型的反应体系见表2：
[0033]
表2
[0034][0035]
检测bcr-abl2基因亚型的反应体系见表3：
[0036]
表3
[0037][0038]
上述反应体系中，溶解剂及配套反应缓冲液均为先达基因生物科技有限公司产品。
[0039]
实施例3
[0040]
以构建于puc57载体的bcr-abl融合基因bcr-abl1和bcr-abl2序列质粒(由江苏金斯瑞生物公司合成构建)作为实验材料，对检测bcr-abl融合基因的era引物和探针进行灵敏度及特异性实验，步骤如下：
[0041]
1)灵敏度实验设灵敏度阴性对照组(模板由ddh2o代替)和bcr-abl灵敏度实验组(模板为10copies、102copies、103copies、104copies和105copies的bcr-abl融合基因质粒)，特异性实验设阴性对照组(模板由ddh2o代替)和bcr-abl特异性实验组(模板为104copies的bcr-abl融合基因质粒)，按照表2-3的反应体系中自上而下的顺序往灭菌pcr管中进行加样；
[0042]
2)轻轻用手指弹试管底部20次，使其充分混合，放入瞬时离心机离心数秒，使反应液沉到底部；
[0043]
3)将配置好的反应试管置于荧光定量pcr仪中，37℃下恒温反应20分钟，30秒收集一次荧光信号。
[0044]
测试结果见图1和图2，图1为针对bcr-abl1型bcr-abl融合基因的灵敏度和特异性检测结果，其中，图1a为灵敏度检测结果，图1b为特异性检测结果；图2为针对bcr-abl2型
bcr-abl融合基因的灵敏度和特异性检测结果，其中，图2a为灵敏度检测结果，图2b为特异性检测结果。由图1a和图2a可以看出，本发明每反应中最低可检测出10copies的bcr-abl1和bcr-abl2融合基因，且随每反应中bcr-abl融合基因拷贝数量的增加，检测结果中荧光值越高，表明灵敏度良好；由图1b和2b可以看出，采用本发明的特异性探针及引物进行扩增后，仅能扩增出引物和探针对应的bcr-abl融合基因型，并未出现非特异性扩增，表明该扩增反应特异性良好。
[0045]
采用本发明的特异性探针及引物检测基因bcr-abl1融合基因，为e14a2型融合，编码p210蛋白，突变频率为52.64％；检测基因bcr-abl2融合基因，为e14a2型融合，编码p210融合蛋白，突变频率为32.68％。bcr-abl1和bcr-abl2在编码p210融合蛋白的融合基因的突变比率中占99.4％。说明检测覆盖度比较高。
[0046]
序列表：
[0047]
seq id no:1
[0048]
bcr-abl1-f1
[0049]
ctctatgggtttctgaatgtcatcgtcca
[0050]
seq id no:2
[0051]
bcr-abl2-f78
[0052]
tgtgaaactccagactgtccacagcattcc
[0053]
seq id no:3
[0054]
bcr-abl12-r
[0055]
ttccttagagttccaacgagcggcttcact
[0056]
seq id no:4
[0057]
bcr-abl12-pb
[0058]
agcccttcagcggcctgtagcatctgact(thf)tgtgcctcagggtct
[0059]
seq id no:5
[0060]
bcr-abl1基因
[0061]
atggagtctgaggaggggaaggaggcaaggttggctcggagctccccggagcagcccaggcccagcacctccaaggcagtctcaccaccccacctggatggaccgcctagccccaggagccccgtcataggaagtgaggtcttcctgcccaacagcaaccacgtggccagtggcgccggggaggcagccattgagacccagagcagcagttctgaagagatagtgcccagccctccctcgccaccccctctaccccgcatctacaagccttgctttgtctgtcaggacaagtcctcaggctaccactatggggtcagcgcctgtgagggctgcaagggcttc
[0062]
seq id no:6
[0063]
bcr-abl2基因
[0064]
tatggctgtggtacagtcagtgcccggggcacaccccgtgccagtgtacgccttctccatcaaaggcccttcctatggagaggatgtctccaatacaacgacagcccagaagaggaagtgcagccagacccagtgccccaggaaggtcatcaagatggagtctgaggaggggaaggaggcaagccattgagacccagagcagcagttctgaagagatagtgcccagccctccctcgccaccccctctaccccgcatctacaagccttgctttgtctgtcaggacaagtcctcaggctaccactatggggtcagcgcctgtgagggctgcaagggct