含哌啶骨架亚磷酰胺单体及寡聚核苷酸的合成和应用

1.本发明属于寡聚核苷酸的化学合成及功能化寡核苷酸领域，涉及含哌啶骨架亚磷酰胺单体及寡聚核苷酸的合成和应用，具体涉及以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的功能染料修饰的亚磷酰胺单体以及寡聚核苷酸的合成与应用。


背景技术：

2.伴随着核酸化学合成技术的发展，核酸及其修饰类似物在化学，生物学和医学中得到了广泛应用。通过dna固相合成法和亚磷酰胺化学，可以实现寡聚核苷酸的全方位化学修饰或局部替代。化学修饰的寡聚核苷酸不仅能够用作仿生药物，而且可以广泛用于制备纳米探针材料。寡聚核苷酸的化学修饰包括对糖环的、碱基部位的修饰、磷酸二酯骨架的修饰以及非天然单体对核苷的替换等。
3.近年来，化学家们设计合成了一系列功能染料修饰的寡聚核苷酸探针，用于基因检测、靶向诊疗等领域，受到学术界和产业界的关注。这些寡聚核苷酸探针中除了末端修饰的以外，已报道的中间修饰寡聚核苷酸大多数是由碱基或糖环部位功能染料修饰的亚磷酰胺单体制得，用替换糖环或核苷的非天然骨架对寡聚核苷酸进行定点功能染料修饰的研究，除了苏氨醇，2,3-二羟丙基氨基甲酸酯等骨架分子以外，报道极少。设计开发承载功能染料的新骨架分子，并定点导入到寡聚核苷酸中，能够使功能染料的物理化学性质随着其所处的核酸微小分子环境的改变而变化，为新型寡聚核苷酸探针的开发提供新的思路和分子素材。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一是提供一种以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的亚磷酰胺单体，该亚磷酰胺单体合成经济简易，用其制备的寡聚核苷酸具有通用性。
5.本发明的目的之二是提供所述以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的亚磷酰胺单体的制备方法。
6.本发明的目的之三是将所述以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的亚磷酰胺单体应用于制备功能化寡聚核苷酸。
7.为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
8.本发明提供了一种以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的亚磷酰胺单体，其为式i所示结构的化合物和其对映异构体：
[0009][0010]
其中：
[0011]
r1为功能染料基团，优选为丹磺酰基、硝基苯并呋咱基、芘甲酰基或苯偶氮苯甲酰基及其他功能分子基团；
[0012]
r2选自c1-c4烷基；
[0013]
r3选自c1-c4烷基；
[0014]
dmtr为4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基。
[0015]
本发明优选如下的化合物和其对映异构体：
[0016]
其中，
[0017]
r1为丹磺酰基、硝基苯并呋咱基、芘甲酰基或苯偶氮苯甲酰基；
[0018]
r2选自甲基，乙基或异丙基。
[0019]
r3选自甲基，乙基或异丙基。
[0020]
dmtr为4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基。
[0021]
本发明优选如下的以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的丹磺酰基修饰的亚磷酰胺单体，其为式ⅱ所示结构的化合物及其对映异构体：
[0022]
[0023]
本发明还提供了式i化合物的制备方法：包括以下步骤：
[0024]
(1)反-4-羟甲基哌啶-3-醇与功能染料基团发生反应；
[0025]
(2)步骤(1)得到的产物在无水无氧、惰性气体保护下，在4-二甲氨基吡啶催化下与4,4'-二甲氧基三苯基氯反应；
[0026]
(3)步骤(2)得到的产物在无水、无氧环境和惰性气体保护条件下，经亚磷酰胺化反应得到式i化合物和其对映异构体。
[0027]
步骤(1)中，反-4-羟甲基哌啶-3-醇与功能染料基团发生反应不限于磺胺化反应，还包括酰胺化反应、亲核取代反应、亲核加成反应或碳氮偶联反应；
[0028]
步骤(2)中所述催化剂为4-二甲氨基吡啶或三乙胺；所述反应在溶剂中进行，反应溶剂为二氯甲烷或吡啶；所述惰性气体为氮气或/和氩气；反应温度为10～50℃；反应时间为2～12h。
[0029]
步骤(3)中所述催化剂为三乙胺或n,n-二异丙基乙胺；采用亚磷酰胺化试剂为2-氰乙基n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺；反应温度为-10～25℃；反应时间为1～6h。
[0030]
具体地，本发明提供了式ii化合物和其对映异构体的制备方法，包括如下步骤：
[0031]
(1)反-4-羟甲基哌啶-3-醇与丹磺酰氯发生磺胺化反应得到反-n-丹磺酰基-4-羟甲基哌啶-3-醇；
[0032]
(2)反-n-丹磺酰基-4-羟甲基哌啶-3-醇在无水无氧、惰性气体保护下，在4-二甲氨基吡啶催化下与4,4'-二甲氧基三苯基氯反应得到dmtr保护的反-n-丹磺酰基-4-羟甲基哌啶-3-醇；
[0033]
(3)dmtr保护的反-n-丹磺酰基-4-羟甲基哌啶-3-醇在无水、无氧环境和惰性气体保护条件下，经亚磷酰胺化反应得到式ⅱ化合物或其对映异构体。
[0034]
本发明所述的以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的亚磷酰胺单体能够用于制备功能化寡聚核苷酸。
[0035]
所述的功能化寡聚核苷酸为功能染料定点修饰的寡聚核苷酸。
[0036]
即，通过dna合成仪，用上述亚磷酰胺单体将本发明所述功能染料偶联反-4-羟甲基哌啶-3-醇骨架定点插入到寡聚核苷酸的一个或多个位置，制得功能化寡聚核苷酸。
[0037]
所述的功能染料偶联反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架可插入到寡聚核苷酸链的任意位置。
[0038]
本发明以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架设计合成了功能染料修饰的含哌啶骨架亚磷酰胺单体，并将该骨架定点导入至寡聚核苷酸中，用于靶标dna的荧光检测。本发明提供的含哌啶骨架亚磷酰胺单体，便于我们利用哌啶骨架将各种不同的功能染料分子定点导入到寡聚核苷酸的任意位置，具有一定的通用性，为寡聚核苷酸的定点化学修饰和功能化提供了新的思路和分子工具，制备的功能化寡聚核苷酸可用于分子识别和调控，在生物医药技术领域有着广泛的应用前景。
附图说明
[0039]
图1以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的丹磺酰基修饰的亚磷酰胺单体的合成路线；
[0040]
图2以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的丹磺酰基修饰的亚磷酰胺单体的质谱；
[0041]
图3以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的丹磺酰基修饰的亚磷酰胺单体的核磁氢谱；
[0042]
图4丹磺酰基修饰的寡聚核苷酸质谱；
[0043]
图5丹磺酰基修饰的寡聚核苷酸(ds-p)及其与靶标互补链(c-t)结合后的荧光谱图。
具体实施方式
[0044]
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。本发明合成了反-4-羟甲基哌啶-3-醇中间体，并以此为骨架，经n1位与丹磺酰氯偶合，dmtr(4,4'-双甲氧基三苯甲基)保护反应，及亚磷酰胺化反应得到目标产物，以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的亚磷酰胺单体化合物。上述合成路线如图1所示。
[0045]
实施例1：
[0046]
丹磺酰基修饰的以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架亚磷酰胺单体化合物的合成
[0047]
1.1-苄基-4-羟甲基吡啶氮鎓氯化物(1)的合成
[0048]
取3.5g 4-吡啶甲醇于茄形烧瓶(100ml)中，加20ml乙腈溶解，滴加15ml氯化苄，于75℃水浴中回流反应3小时。静置恢复至室温，减压蒸馏处乙腈，加10ml乙醚洗涤两次，除去过量的氯化苄，得橙黄色油状液体7.5g，即化合物1。产率：99.2％。1h nmr(dmso-d6,360mhz)δ:9.20(d,j＝6.7hz,2h),8.06(d,j＝6.7hz,2h),7.62
–
7.53(m,2h),7.43～7.35(m,3h),5.91(s,2h),4.81(s,2h)；lc-ms(esi)m/z:200.1{[m]

}。
[0049]
2.1-苄基-4-羟甲基-1,2,3,6-四氢吡啶(2)的合成
[0050]
取7.5g化合物1于茄形烧瓶(250ml)中，加50ml甲醇溶解，氩气氛围下冷却至-20℃。分批加入2.5g硼氢化钠，搅拌反应30分钟。恢复至室温继续搅拌30分钟，滴加5ml水终止反应。减压蒸馏除去甲醇，加入50ml水，用10ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用20ml饱和nacl溶液萃取1次。有机相加入5g无水硫酸钠干燥，抽滤，得红色溶液。硅胶柱层析，展开剂为丙酮:正己烷:＝1:2，得黄色油状液体5.5g，即化合物2。产率：85.1％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.35
–
7.27(m,4h),7.27
–
7.20(m,1h),5.53(tq,j＝3.3,1.6hz,1h),4.65(t,j＝5.6hz,1h),3.80(dd,j＝5.2,2.1hz,2h),3.52(s,2h),2.86(h,j＝2.4hz,2h),2.49(t,j＝5.7hz,2h),2.01(tq,j＝7.2,2.2hz,2h)；lc-ms(esi)m/z:204.1{[m h]

}。
[0051]
3.反-1-苄基-4-羟甲基哌啶-3-醇(3)的合成
[0052]
取5.5g化合物2于三颈烧瓶(500ml)中，加入50ml无水四氢呋喃溶解，氩气氛围下冷却至-30℃。缓慢滴加1m硼烷四氢呋喃溶液50ml，搅拌反应4小时，转移至室温继续搅拌反应18小时。冷却至-10℃，缓慢滴加5ml水淬灭硼烷，滴加10ml 3m氢氧化钠水溶液和10ml 30％过氧化氢水溶液，搅拌反应5分钟，滴加10ml 50％氢氧化钠水溶液，转移至70℃水浴中回流反应4小时。静置恢复室温，减压蒸馏除去四氢呋喃，用20ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用50ml饱和nacl溶液萃取1次。有机相减压蒸馏除去溶剂，加入2ml丙酮和10ml石油醚，震荡，析出白色固体，抽滤，收集滤饼，烘干，得白色粉末状固体3.5g，即化合物3。产率：
58.4％。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.33
–
7.15(m,5h),3.72
–
3.57(m,3h),3.55
–
3.43(m,1h),2.96(ddd,j＝10.6,4.5,1.7hz,1h),2.78(ddt,j＝12.6,4.5,1.7hz,1h),1.95(td,j＝11.7,2.7hz,1h),1.84(t,j＝10.2hz,1h),1.50(dddd,j＝13.4,11.5,6.7,3.7hz,2h),1.28
–
1.21(m,1h)；lc-ms(esi)m/z:222.3{[m h]

}。
[0053]
4.反-4-羟甲基哌啶-3-醇(4)的合成
[0054]
取1g化合物3于茄形烧瓶(100ml)中，加入1.4g甲酸铵，加入15ml甲醇溶解，加入0.1g湿钯碳，于70℃水浴中回流反应3h。静置恢复至室温，减压蒸馏除去甲醇和过量甲酸铵，得无色油状液体0.52g，即化合物4。产率：87.8％。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ3.72(dd,j＝10.6,4.1hz,1h),3.68
–
3.64(m,1h),3.57
–
3.50(m,1h),3.15(ddd,j＝11.6,4.6,1.1hz,1h),3.03
–
2.93(m,1h),2.61
–
2.50(m,1h),2.43(dd,j＝11.7,10.1hz,1h),1.61(tdt,j＝8.2,6.0,3.9hz,2h),1.15
–
1.09(m,1h)；lc-ms(esi)m/z:132.07{[m h]

}。
[0055]
5.反-1-(((5-(二甲基氨基)萘-1-基)磺酰基)-4-(羟甲基)哌啶-3-醇(5)的合成
[0056]
取0.5g化合物4于双颈烧瓶(50ml)中，加入5ml无水dmf溶解，加入1ml无水三乙胺，氩气保护。将1.1g丹磺酰氯用无水二氯甲烷溶解后，滴加入双颈烧瓶中，室温搅拌反应1小时。减压蒸馏除去溶剂，加入10ml二氯甲烷，用10ml 1％盐酸水溶液萃取2次，饱和nacl溶液萃取1次，收集有机相，硅胶柱层析纯化，展开剂＝丙酮：石油醚＝1：1，得黄绿色油状液体1.3g，即化合物5。产率：93.6％。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.47(dt,j＝8.6,1.1hz,1h),8.24(dt,j＝8.7,1.0hz,1h),8.11(dd,j＝7.4,1.3hz,1h),7.49
–
7.39(m,2h),7.09(dd,j＝7.6,1.0hz,1h),3.86(ddd,j＝11.8,4.9,1.9hz,1h),3.75(ddt,j＝12.3,4.5,2.3hz,1h),3.65(d,j＝3.0hz,1h),3.56(dtd,j＝18.7,11.0,4.6hz,2h),2.80(s,6h),2.47(td,j＝12.4,2.7hz,1h),2.31(dd,j＝11.8,10.1hz,1h),1.55
–
1.37(m,2h),1.29
–
1.14(m,1h)；lc-ms(esi)m/z:365.24{[m h]

}。
[0057]
6.反-4-(((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-1-((5-(二甲氨基)萘-1-基)磺酰基)
[0058]
哌啶-3-醇(6)的合成
[0059]
取1.3g化合物5于双颈烧瓶(50ml)中，加入20mg dmap，加入15ml无水二氯甲烷和2ml无水三乙胺溶解，氩气保护。将1.5g dmtr-cl用5ml无水二氯甲烷溶解，滴加入双颈烧瓶中。室温搅拌反应4小时。用10ml 1％盐酸水溶液萃取2次，饱和nacl溶液萃取1次，收集有机相。硅胶柱层析纯化，展开剂为二氯甲烷，得黄绿色油状液体2.1g，即化合物6。产率：88.3％。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.45(dt,j＝8.5,1.1hz,1h),8.27(d,j＝8.7hz,1h),8.10(dd,j＝7.3,1.3hz,1h),7.41(ddd,j＝8.5,7.4,5.5hz,2h),7.29
–
7.23(m,2h),7.20
–
7.13(m,6h),7.12
–
7.05(m,2h),6.74
–
6.68(m,4h),3.90
–
3.81(m,1h),3.71(ddd,j＝12.4,4.5,2.2hz,1h),3.66(s,6h),3.60(d,j＝2.2hz,1h),3.47(dtd,j＝11.8,6.3,5.7,3.3hz,1h),3.18(dd,j＝9.3,4.1hz,1h),2.99(dd,j＝9.4,7.8hz,1h),2.77(s,6h),2.42(td,j＝12.3,2.4hz,1h),2.26(dd,j＝11.8,10.1hz,1h),1.49(ddt,j＝17.0,14.6,3.8hz,2h)；lc-ms(esi)m/z:689.3{[m na]

}。
[0060]
7.反-4-(2,2-双(4-甲氧基苯基)-2-苯基乙氧基)-1-((5-(二甲氨基)萘-1-基)磺酰基)
[0061]
哌啶-3-基(2-氰乙基)二异丙基磷酰胺(7)的合成
[0062]
取2.1g化合物5于双颈烧瓶(50ml)中，加入10ml无水二氯甲烷和1.5ml无水三乙胺溶解，氩气保护，冷却至0℃。缓慢滴加2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺0.85ml，搅拌反应30分钟。转移至室温继续反应3小时。用饱和nahco3溶液萃取一次，饱和nacl溶液萃取一次，无水硫酸钠搅拌干燥0.5h，抽滤。快速硅胶柱层析纯化，展开剂为二氯甲烷：石油醚：三乙胺＝20：80：3，得绿色油状液体2.0g，即化合物7。产率：73.3％。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.48(ddt,j＝8.5,2.5,1.1hz,1h),8.27(dd,j＝8.7,5.9hz,1h),8.12(ddd,j＝7.4,4.2,1.3hz,1h),7.45(dddd,j＝13.4,8.6,7.5,3.8hz,2h),7.28(dq,j＝6.3,1.4hz,2h),7.17(dd,j＝9.0,1.8hz,6h),7.14
–
7.09(m,2h),6.77
–
6.65(m,4h),3.94
–
3.84(m,1h),3.70(dd,j＝5.1,0.9hz,6h),3.83
–
3.62(m,1h),3.59
–
3.49(m,1h),3.47
–
3.25(m,1h),3.35(ddq,j＝10.4,6.9,3.7hz,2h),3.21(dd,j＝6.7,2.4hz,1h),2.93
–
2.70(m,1h),2.81(d,j＝1.3hz,6h),2.57(td,j＝12.1,2.5hz,1h),2.51
–
2.41(m,2h),2.33(dd,j＝11.6,10.1hz,1h),2.20(td,j＝6.4,2.9hz,1h),2.13
–
2.00(m,1h),1.70
–
1.61(m,1h),1.52(td,j＝13.1,12.6,4.2hz,1h),1.08
–
0.93(m,12h)；lc-ms(tof)m/z:889.3765{[m na]

}。
[0063]
实施例2以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的丹磺酰基修饰寡聚核苷酸合成
[0064]
本发明使用上述以反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架的丹磺酰基修饰的亚磷酰胺单体化合物，将丹磺酰基定点修饰在下述寡聚核苷酸(ds-p)序列的x位置，通过dna合成仪合成并经高效液相色谱仪纯化得到丹磺酰基修饰的寡聚核苷酸。产物经质谱确认，如图4所示。
[0065]
本发明进一步考察了用丹磺酰基修饰的寡聚核苷酸(ds-p)与其互补链(c-t)通过碱基互补配对杂交后的荧光变化情况。
[0066]
ds-p：5'-aggcacaaaxacgcacctc-3'
[0067]
c-t：5'-gaggtgcgtctttgtgcct-3'
[0068]
其中，x表示丹磺酰基修饰的反-4-羟甲基哌啶-3-醇为骨架。
[0069]
将上述两条寡聚核苷酸(0.2μm)溶解于pbs缓冲液中，混匀后升温至90℃退火，自然降温至室温。使用荧光分光度计在室温下分别测量ds-p单链寡聚核苷和ds-p/c-t双链寡聚核苷酸的荧光光谱。
[0070]
从图5可以看出，单链的寡聚核苷酸ds-p在最大荧光发射波长550nm处的荧光强度很弱；当与互补链的序列c-t一起孵育后，荧光强度显著增强，最大荧光发射波长蓝移至545nm。相比于单链寡聚核苷酸ds-p，在其与互补链孵育后，ds-p/c-t双链寡聚核苷酸在545nm处的荧光强度增强了4.7倍，表明用本发明设计合成的丹磺酰基修饰的亚磷酰胺单体合成的功能化寡聚核苷酸具有识别和检测与其序列互补的靶标dna的能力，有望应用于核酸检测等领域。