脱亚硫酸杆菌PGC-3-9及其在镰刀菌毒素脱毒中的应用的制作方法

脱亚硫酸杆菌pgc-3-9及其在镰刀菌毒素脱毒中的应用
技术领域
1.本发明属于真菌毒素脱毒领域，具体涉及一株脱亚硫酸杆菌 (desulfitobacterium sp.)pgc-3-9，该菌株被证实具有快速降解镰刀菌毒素的能力。


背景技术：

2.镰刀菌毒素是一种广泛分布的真菌毒素，主要由镰刀菌属真菌产生。这些产毒真菌在田间侵染小麦、大麦、玉米等禾谷类作物的小花组织，并定植在发育的籽粒上，因此，这些真菌产生的毒素会直接积累在成熟的谷物中，从而进入下游产品，比如面粉、牛奶、啤酒及动物饲料等(bai,g.,and shaner,g.management and resistance in wheat and barley to fusarium head blight.2004.annu rev phytopathol 42:135-161.)。单端孢霉烯族毒素是污染范围最广的一类镰刀菌毒素，包括超过 200多种的毒素(mccormick,s.p.；stanley,a.m.；stover,n.a.；alexander,n.j., trichothecenes:from simple to complex mycotoxins.toxins 2011,3,802-14.)。根据其结构不同，可将其分为a、b、c、d四大类型，其中a类和b类是最为常见的单端孢霉烯族毒素；a类单端孢霉烯毒素的分子结构中缺少c8位酮基，主要包括t2毒素、ht2毒素及新茄病镰刀菌烯醇(neosolaniol,neo)毒素；b类单端孢霉烯毒素的分子结构中含有c8位酮基，主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (don)毒素、雪腐镰刀菌烯醇(niv)毒素、15-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (15adon)毒素，3-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyl-deoxynivalenol， 3adon)毒素(mccormick,s.p.；stanley,a.m.；stover,n.a.；alexander,n.j., trichothecenes:from simple to complex mycotoxins.toxins 2011,3,802-14.)。镰刀菌毒素在小麦，玉米，水稻，大麦等谷类作物中积累，造成粮食品质下降。此外， don毒素耐高温，加热不易降解，在谷物磨粉、加工及加热处理过程中很难被破坏，因此能够很容易进入食物链，严重危害人畜健康(pestka,j.j.deoxynivalenol: mechanisms of action,human exposure,and toxicological relevance.2010.arch toxicol 84:663-679.)。由于我国农业生态环境及耕作制度引起的镰刀菌毒素污染面大，已发生多起人误食受镰刀菌毒素污染面粉而中毒的事件。
3.单端孢霉烯毒素属于15碳倍半萜类化合物，其共同含有碳12,13环氧基团，是决定毒性的关键结构。利用微生物靶向改变碳12,13环氧基团这个毒性基团的生物脱毒方法，是最好的脱毒方式之一，其可将毒素环氧基团打开，将其转化成低毒的脱环氧代谢产物，从而减少毒素对人畜健康的危害(eriksen,g.s.； pettersson,h.；lindberg,j.e.,comparative cytotoxicity of deoxynivalenol,nivalenol, their acetylated derivatives and de-epoxy metabolites.food chem.toxicol.2004,42, 619-624；swanson,s.p.；rood,h.d.；behrens,j.c.；sanders,p.e.,preparation andcharacterization of the deepoxy trichothecenes:deepoxy ht-2,deepoxy t-2triol, deepoxy t-2tetraol,deepoxy 15-monoacetoxyscirpenol,and deepoxy scirpentriol. appl.environ.microbiol.1987,53,2821-2826.)。这种方法相对于物理脱毒及化学脱毒方法，具有特异性强、环境安全、脱毒效率高等特点；同时，自然界微生物资源丰富，因此，利用
微生物资源来进行镰刀菌毒素的生物脱毒，具有开发应用前景。目前，针对于单端孢霉烯族毒素碳12,13环氧基团的脱毒微生物全部分离自动物肠道中，需要严格厌氧的条件才能完成脱环氧反应，严重限制了这些菌株的应用，因为谷物的生长和储存均是在有氧条件下完成的(karlovsky,p., biological detoxification of the mycotoxin deoxynivalenol and its use in geneticallyengineered crops and feed additives.appl.microbiol.biot.2011,91,491-504；ito,m.； sato,i.；koitabashi,m.；yoshida,s.；imai,m.；tsushima,s.,a novel actinomycetederived from wheat heads degrades deoxynivalenol in the grain of wheat and barleyaffected by fusarium head blight.appl.microbiol.biot.2012,96(4),1059-70.)。因此，有氧条件下具有脱环氧活性的细菌微生物具有更加广泛的应用前景，然而，目前还没有菌株被报道可以在有氧条件下对镰刀菌毒素进行脱环氧。
4.脱亚硫酸杆菌属(desulfitobacterium sp.)，属于厚壁菌门(firmicutes)，梭菌纲(clostridia)，梭菌目(clostridiales)，蛋白胨链球菌科(peptococcaceae)。该属细菌菌体为轻微弯曲的杆状，长度为2-7μm，具有鞭毛。最早分离自卤化有机化合物污染的水体、土壤等多种环境中，是一类具有多种功能的微生物，能够对各种卤化有机化合物进行降解。脱亚硫酸杆菌被认为是开发生物修复工艺净化卤化有机化合物和金属污染的最佳选择(villemur,r.；lanthier,m.；beaudet,r.； lepine,f.,the desulfitobacterium genus.fems microbiol.rev.2006,30, 706-733.)。然而，目前还没有关于脱亚硫酸杆菌具有镰刀菌菌毒素脱毒活性的相关报道。


技术实现要素：

5.针对小麦等禾谷类作物中镰刀菌毒素防治困难，污染和经济损失严重的难题，本发明提供了一株高效降解镰刀菌毒素的脱亚硫酸杆菌(desulfitobacteriumsp.)pgc-3-9，该菌株可将镰刀菌毒素的毒性基团环氧结构打开，形成各自对应的脱环氧形式，在有氧和无氧条件下均能快速去除农产品或饲料中的镰刀菌毒素。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
7.通过微生物学方法，本发明从中国武汉华中农业大学小麦田土壤中分离得到 一株对镰刀菌毒素具有高效脱毒作用的脱亚硫酸菌(desulfitobacterium sp.) pgc-3-9，该菌株已于2020年5月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏(保 藏地址：中国武汉)，保藏编号为cctcc no:m 2020135。
8.本发明研究了该菌株对多种镰刀菌毒素的脱毒作用，鉴定了镰刀菌毒素被菌株降解后形成的代谢产物，证明该菌株可以将镰刀菌毒素ht2、don、niv、15adon的毒性基团环氧结构打开，分别形成对应的脱环氧形式de-ht2、 de-don、de-niv、de-15adon。
9.本发明还研究了该菌株对小麦面粉中镰刀菌毒素的降解效果，证明该菌株可以用于小麦面粉等农产品中的镰刀菌毒素(尤其是don毒素)的脱毒。
10.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
11.(1)本发明分离的脱亚硫酸杆菌pgc-3-9，是从赤霉病频发的小麦田土壤中分离得到的一种具有高效脱毒镰刀菌毒素的微生物，能够对多种镰刀菌毒素在有氧和无氧条件下进行脱环氧。此为首次发现能够在有氧条件下进行脱环氧的微生物菌株。
12.(2)本发明分离到的脱亚硫酸杆菌pgc-3-9能够将镰刀菌毒素降解产生对应的脱环氧代谢物。据文献报到，镰刀菌毒素的环氧基团是其主要毒性基团，脱环氧能够显著性降低毒性55-400倍。因此，脱亚硫酸杆菌pgc-3-9具有明显脱毒能力。
13.(3)本发明得到的脱亚硫酸杆菌pgc-3-9能够在有氧和无氧条件下快速去除小麦面粉等农产品中的镰刀菌毒素。因此，该菌株在毒素脱毒领域具有更加广泛的应用前景。
14.(4)菌株pgc-3-9具有培养简单，使用方便，脱毒效率高等优势，应用前景广泛。
附图说明
15.图1：脱亚硫酸杆菌pgc-3-9形态学观察。
16.图2：脱亚硫酸杆菌菌株pgc-3-9与其他近缘种菌株基于16s rdna序列的系统发育树。
17.图3：脱亚硫酸杆菌pgc-3-9对多种镰刀菌毒素(ht2、don、niv、 15adon)进行脱环氧。
18.图4：脱亚硫酸杆菌pgc-3-9降解小麦面粉中的镰刀菌毒素，an表示无氧条件，a表示有氧条件。
具体实施方式
19.实施例1：pgc-3-9的分离和菌学鉴定
20.(1)候选菌株pgc-3-9的分离
21.我们通过微生物学方法，从中国湖北省武汉市华中农业大学小麦田中采集土壤，称取0.5g土样于5ml离心管中，加入2ml的含50μg/ml don的 mmypf液体培养基(7.8g/l磷酸氢二钾,1.2g/l磷酸二氢钾,0.5g/l柠檬酸钠, 0.1g/l硫酸镁,2.0g/l酵母提取物,0.69g/l富马酸钠,5.5g/l丙酮酸钠，1.0 mg/l刃天青，调ph至7.2)，37℃，培养7d；取0.1ml上清，加入等体积的甲醇，利用hplc检测don含量；将能够降解毒素的样品0.1ml转接至0.9ml 新鲜的液体培养基中(含50μg/ml don)，相同条件培养7d之后检测don含量；重复上述步骤3-4次之后，对依然保持降解活性的混合菌群进行单菌株分离，通过稀释涂平板法，挑取不同形态的单克隆并检测其降解活性，最终从中分离得到一株对镰刀菌毒素具有高效降解作用的脱亚硫酸杆菌，我们将该候选菌株编号为pgc-3-9。
22.(2)pgc-3-9菌株的形态特征鉴定
23.pgc-3-9菌株于mmypf培养基(7.8g/l磷酸氢二钾,1.2g/l磷酸二氢钾, 0.5g/l柠檬酸钠,0.1g/l硫酸镁,2.0g/l酵母提取物,0.69g/l富马酸钠,5.5 g/l丙酮酸钠，1.0mg/l刃天青，15g/l琼脂，调ph至7.2)中，于厌氧条件下培养72h后，收集细菌细胞进行革兰氏染色，结果表明，菌株pgc-3-9为革兰氏阴性(图1a)。菌体细胞用磷钼酸固定后用投射电子显微镜观察细胞形态，结果显示，菌株pgc-3-9为轻微弯曲的杆状；菌体长度为3-4μm，宽度为 0.5-0.6μm；侧生鞭毛(图1b)。
24.(3)pgc-3-9的分子生物学鉴定
25.将pgc-3-9菌株于mmypf培养液(7.8g/l磷酸氢二钾,1.2g/l磷酸二氢钾,0.5g/l柠檬酸钠,0.1g/l硫酸镁,2.0g/l酵母提取物,0.69g/l富马酸钠, 5.5g/l丙酮酸钠，1.0mg/l刃天青，调ph至7.2)中，于厌氧条件下培养72h 后收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提
取基因组dna(axygen)。利用特异性引物扩增16s rdna并送武汉天一公司进行测序，测序序列长度为1622bp。
26.测序引物的dna序列：
27.16s rdna(正向引物)：agagtttgatcctggctcag
28.16s rdna(反向引物)：taccttgttacgactt
29.在genbank数据库中，将pgc-3-9菌株的16s rdna序列进行blast检索，发现其与脱亚硫酸杆菌属内不同种的细菌菌株相似度较高，为进一步确定该菌株的遗传特性，选取比对结果中同源性较高的菌株序列构建系统发育树。
30.根据其形态和生化特征，以及16s rdna基因序列系统发育分析(图2)，经鉴定本发明所分离的菌株是一株脱亚硫酸杆菌(desulfitobacterium sp.)，申请人将该菌株命名为脱亚硫酸杆菌(desulfitobacterium sp.)pgc-3-9，已于2020年5 月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctcc m 2020135。
31.实施例2：脱亚硫酸杆菌pgc-3-9对多种镰刀菌毒素的降解作用
32.接种脱亚硫酸杆菌pgc-3-9至液体mmypf培养基中，于厌氧条件下培养 72h后，5000r/min，离心5min，收集菌体；用灭菌水清洗菌体2次，用mmypf 培养液重悬菌体，调整重悬液的浓度为od
600nm
＝2，添加镰刀菌毒素(ht2、don、 niv、15adon)至终浓度100μg/ml，37℃培养24h；提取培养液中的毒素及代谢物，用三甲基硅咪唑(tmsi)和三甲基氯硅烷(tmcs)衍化剂(100:1，v:v) 衍化之后，利用气相色谱质谱联用仪(gc-ms)检测溶液中的镰刀菌毒素及代谢物，gc-ms分析系统组成：气相色谱(agilent 7890a)，质谱检测器(agilent 5975c，选择离子检测器)，色谱柱(j&w scientific db-5ms,30m
×
0.25mm id, 0.25μm film thickness)。气相条件：进样量1μl；进样口温度300℃，柱温采用程序升温，初始温度80℃，保持1min后，以25℃/min速度升至280℃，保持 6min；运行时间15min，后运行时间3min。载气为氦气(99.999％)流速1ml/min。
33.质谱条件：选择电子电离模式，电离能为70ev，全扫描模式，扫描范围m/z100-800。结果表明：菌株pgc-3-9能够完全降解培养基中的镰刀菌毒素，并将镰刀菌毒素ht2、don、niv、15adon进行脱环氧，分别形成de-ht2、de-don、 de-niv、de-15adon(图3)。
34.实施例3：脱亚硫酸杆菌pgc-3-9降解小麦面粉中的镰刀菌毒素的活性分析
35.从华中农业大学小麦试验田中收集赤霉病感染的小麦麦粒，将其磨成粉末之后，利用孔径大小为40目的筛网过滤以除去大颗粒。过滤之后的面粉121℃灭菌15min，然后按照每份0.5g分装至5ml离心管中，每份面粉中添加2ml mmypf培养基，添加pgc-3-9菌液至终浓度od595＝2.0，对照组不添加菌体，分别在有氧和无氧条件下37℃培养48h，分别于接种后12h、24h、36h、48h 取样，利用gc-ms检测面粉中的镰刀菌毒素的含量。结果表明：赤霉病感染的小麦面粉中don毒素含量高达11.2mg/kg，超过国家限量标准(1mg/kg)10 倍之多。利用菌株pgc-3-9处理毒素污染的面粉，有氧和无氧条件下均能够快速降解面粉中的毒素，在处理后48h均可去除面粉中92％以上的毒素(图4)。