含环状四糖的糖组合物及其用途以及制造方法与流程

1.本发明涉及一种新的糖组合物，详细而言，涉及一种新的糖组合物及其用途以及制造方法，所述新的糖组合物含有由环{
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6)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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3)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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6)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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3)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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}表示的环状四糖。


背景技术：

2.含有由环{
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6)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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3)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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6)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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3)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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}表示的结构的环状四糖(以下，简称为“环状四糖”)是在1994年由cote发现的包含4分子葡萄糖的环状糖质(非专利文献1)，在2000年代，本技术的同一申请人确立了使用来自土壤微生物的酶的制造方法(专利文献1和2)。由于其结构，环状四糖不具有还原力，稳定性高，有望实现工业化应用，以上述制造方法的确立为契机，随后其应用研究得到了广泛而有力的推动。其结果，作为环状四糖的代表性的作用，目前例如已知具有以下作用：低着色性(专利文献1、2)、低热量性(专利文献1、2)、膳食纤维性(专利文献1、2)等、自由基生成抑制作用(专利文献3)、脂质调节作用(专利文献4)、矿物质吸收促进作用(专利文献5)等。基于这些见解，如果环状四糖或含环状四糖的糖组合物例如能够以糖稀形态作为食品材料等广泛普及，则认为可以响应对安心、安全、健康的意愿提高的现代社会的需求。
3.通常，糖稀是将淀粉通过用酶或酸进行水解、脱色、脱盐而精制、浓缩得到的物质，因此能够以较低的成本制，另外，在与其他材料混合等而完成最终产品为止的工序中，不需要使固体糖质溶解于水中，因此适宜广泛地用作食品制品的材料。作为该糖稀一般所要求的性质，例如可举出：(a)粘度不过高、(b)水分活性低。(a)的性质是从不妨碍最终产品的制造中的与其他材料的混合等工序中的操作性的观点考虑要求的，(b)的性质是从避免保存中的微生物污染的观点考虑要求的。另外，在考虑利用含环状四糖的糖稀的情况下，除了这些(a)和(b)的性质以外，利用环状四糖本来的特征，还要求(c)充分的低着色性和(d)低热量。进而，当然，在制成(e)高浓度的水溶液(固体成分浓度为70质量％等)的情况下，还要求在保存中不会析出糖结晶。在专利文献2等中，公开了各种含环状四糖的糖稀，但据本技术人所知，这些现有的糖稀的上述(a)至(e)的项目还达不到食品领域所要求的水平，所以没有达到实用化，没有提出能够提供满足这种水平的糖稀的技术。现有技术文献
4.专利文献专利文献1：国际公开第wo2002/010361号小册子专利文献2：国际公开第wo2001/903338号小册子专利文献3：国际公开第wo2004/020552号小册子专利文献4：国际公开第wo2004/899964号小册子专利文献5：国际公开第wo2005/007171号小册子
5.非专利文献
非专利文献1：european journal of biochemistry，第226卷，641-648页(1994年)非专利文献2：journal of bioscience and bioengineering，第94卷，第4号，336-342页(2002年)非专利文献3：luminacoids research，第22卷，第1号，29-33页(2018年)


技术实现要素：

发明要解决的课题
6.鉴于这样的情况，本发明的课题在于提供一种糖组合物及其用途以及制造方法，该糖组合物适用于含环状四糖的糖稀，所述环状四糖具有如下性质：即使在制成浓度较高的糖质水溶液(糖稀)的情况下，粘度和水分活性也充分低，具有充分的低着色性和低热量，而且在保存中不易析出糖结晶。解决课题的手段
7.在上述专利文献1等中记载的使α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶作用于淀粉部分分解产物的含环状四糖的糖组合物的制造方法中，通常与环状四糖一起生成了具有1分子或2分子以上的葡萄糖与环状四糖键合而成的支链结构的环状四糖(以下，称为“支链环状四糖”)。因此，本发明人等在研究本发明要解决的课题的解决对策时，首先，通过将由酶促反应得到的糖组合物中的环状四糖和支链环状四糖的总量设为糖组成中的最大以确保作为环状四糖本来特征之一的低热量性，在将其作为最低限度的必要条件的基础上，深入研究了其他的课题解决对策。为了满足该必要条件，认为最优选采用专利文献1等中记载的制造方法，即，使α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶组合作用于淀粉部分分解产物而生成环状四糖的方法。但是，即使利用申请人在环状四糖及其他糖质的制造方面多年积累的知识和经验，也无法得到保持低热量性且兼具良好的操作性和低着色性的糖组合物。因此，本发明人等排除了以往的技术常识，进一步反复进行了深入研究。
8.即，在本技术的申请日之前，在使α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶组合作用于淀粉部分分解产物的环状四糖的制造中，当通过异淀粉酶等进行底物糖质的脱枝反应时，环状四糖的生成率降低，在利用该酶的环状四糖的生成中，优选在底物中存在经由α-1,6糖苷键的支链结构(非专利文献2)，这成为本领域中的技术常识。在该情况下，包括并用淀粉脱支酶，通过各种酶的组合来制备含环状四糖的糖组合物，并对其物性进行了广泛的比较和研究。
9.其结果判明，具有下述(1)至(3)的特征的含环状四糖的糖组合物全部具有对上述揭示的糖稀所要求的性质。(1)除了上述环状四糖以外，还含有在上述环状四糖上键合有1分子或2分子以上葡萄糖的支链环状四糖，在使葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶作用于上述糖组合物时，相对于所得糖组合物的全部固体成分，上述环状四糖的含量按无水物换算，为38质量％以上；(2)在甲基化分析中，相对于构成该糖组合物的全部葡萄糖残基，α-1,4键合的葡萄糖所占的比例大于9％且为15％以下；以及(3)在甲基化分析中，相对于构成该糖组合物的全部葡萄糖残基，α-1,4,6键合的
葡萄糖所占的比例小于6％。
10.如后面详述的实验和实施例所示判明，通过具有上述(1)的特征，可以制成热量充分低的糖组合物，另外，通过具有上述(2)和(3)的特征，可以兼具良好的操作性和低着色性，而且，满足这些(1)～(3)的必要条件的糖组合物是在制成水溶液时显示充分低的水分活性、且在制成高浓度的水溶液时在保存中也不易析出结晶的划时代的糖组合物。
11.含有具有上述特征的环状四糖和支链环状四糖的糖组合物是通过在使用α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶的环状四糖的生成反应中并用淀粉脱支酶而首次得到的，可以说是由以往的技术常识根本无法获得的全新的糖组合物。
12.此外，本发明人等证实了，上述糖组合物不仅可用作食品或食品材料用的糖稀，还可用于化妆品、准药品(医药部外品)等各种用途。
13.即，本发明的课题是通过提供具有下述(1)至(3)的特征的含环状四糖的糖组合物而解决的：(1)除了上述环状四糖以外，还含有在上述环状四糖上键合有1分子或2分子以上葡萄糖的支链环状四糖，在使葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶作用于上述糖组合物时，相对于所得糖组合物的全部固体成分，上述环状四糖的含量按无水物换算，为38质量％以上；(2)在甲基化分析中，相对于构成该糖组合物的全部葡萄糖残基，α-1,4键合的葡萄糖所占的比例大于9％且为15％以下；以及(3)在甲基化分析中，相对于构成该糖组合物的全部葡萄糖残基，α-1,4,6键合的葡萄糖所占的比例小于6％。
14.此外，本发明的课题是通过提供含有具有上述特征的糖组合物的组合物而解决的。
15.如上所述，含有具有上述(1)至(3)的特征的环状四糖和支链环状四糖的糖组合物是通过在使用α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶的环状四糖的生成反应中并用淀粉脱支酶而首次得到的。因此，本发明的课题是通过提供一种本发明的糖组合物的制造方法而解决的，本发明的糖组合物的制造方法的特征在于，包括以下工序：使α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶作用于淀粉部分分解产物，生成所述环状四糖的工序(工序1)；以及精制和收集生成的含所述环状四糖的酶促反应产物的工序(工序2)，在工序1中还使淀粉脱支酶作用于淀粉部分分解产物。发明效果
16.根据本发明，获得如下优点：例如，即使在制成固体成分浓度为70质量％左右以上的较高浓度的糖质水溶液(糖稀)的情况下，也能够提供操作性好、可避免微生物污染，热量充分低、着色性低、结晶不易析出的含环状四糖的糖组合物。另外，根据本发明的制造方法，获得如下优点：能够容易且廉价地制造本发明的糖组合物。如此得到的本发明的糖组合物如上所述具备一般在糖稀产品中要求的各种特性，因此具有可在食品等各种用途中广泛利用的优点。
具体实施方式
17.1.术语的定义本说明书中，以下所示的术语分别具有如下所示的含义。
18.1.1环状四糖本说明书中，简称为“环状四糖”的情况是指4分子葡萄糖通过α-1,6键和α-1,3键交替键合而成的环状的葡萄糖四糖，即，由环{
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6)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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3)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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6)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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3)-α-d-吡喃葡糖苷基-(1
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}表示的环状四糖。
19.1.2支链环状四糖本说明书中，简称为“支链环状四糖”的情况只要没有特别说明，是指具有1或2分子以上的葡萄糖通过糖苷键与环状四糖键合而成的支链结构的糖质。作为支链环状四糖的具体例，可举出：1个葡萄糖通过α-1,4糖苷键与环状四糖键合而成的糖质、1个异麦芽糖通过α-1,3糖苷键与环状四糖键合而成的糖质等。
20.1.3总环状四糖含量本说明书中，称为“总环状四糖含量”的情况是指相对于使葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶作用于含有环状四糖和支链环状四糖的糖组合物时得到的糖组合物的全部固体成分的、按无水物换算的环状四糖的含量(质量％)。总环状四糖含量反映了含有环状四糖和支链环状四糖的糖组合物在生物体内被消化而生成的环状四糖的多少，因此能够作为该糖组合物的热量值的高低的指标。
21.1.4共存糖质本说明书中，简称为“共存糖质”的情况是指一糖组合物中所含的环状四糖和支链环状四糖以外的全部糖质。作为共存糖质，例如可举出：葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、其他键合方式的葡萄糖二糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、潘糖、其他键合方式的葡萄糖三糖、环状四糖和支链环状四糖以外的各种键合方式的聚合度为4以上的低聚葡萄糖或葡聚糖。
22.1.5α-1,4键合的葡萄糖、α-1,4,6键合的葡萄糖等、以及它们的比率本说明书中所说的“α-1,4键合的葡萄糖”是指通过用于确定构成葡聚糖的各个葡萄糖残基的键合方式而一般使用的甲基化分析法检测出的、其1位和4位的羟基分别通过α-糖苷键与其他葡萄糖残基键合的葡萄糖残基。同样地，在1位、4位和6位的羟基分别通过α-糖苷键与其他葡萄糖残基连接的情况下，将该葡萄糖残基称为“α-1,4,6键合的葡萄糖”。另外，在一葡萄糖残基通过与上述不同部位的羟基与其他葡萄糖残基连接的情况下，类似地以表示该键合参与的羟基位置的编号来称呼该葡萄糖残基(本说明书中有时将键合参与的羟基的位置及其组合称为“键合方式”)。相对于构成糖组合物的全部葡萄糖残基的各键合方式的葡萄糖残基(α-1,4键合的葡萄糖、α-1,4,6键合的葡萄糖等)所占的比率(以下，有时称为各键合方式的葡萄糖残基的“含量”)可通过上述的甲基化分析来求出。予以说明，仅1位羟基与其他葡萄糖残基键合的葡萄糖残基、即非还原末端的葡萄糖残基在本发明中不称为“α-1键合的葡萄糖”，而简称为“非还原末端葡萄糖”。予以说明，甲基化分析的原理和方法在ciucanu等人著的carbohydrate research，第131卷,第2号，209-217页(1984)中详述。
23.1.6α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶本说明书中所说的“α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶”是指由具有α-1,4糖苷键作为非还原末端的键合方式的葡萄糖聚合度为2以上的糖质在基本上不增加还原力的情况下进行α-葡糖基转移，从而生成具有作为非还原末端的键合方式的α-1,6糖苷键和作为非还原末端以外的键合形式的α-1,4糖苷键的葡萄糖聚合度为3以上的糖质的酶。α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶的酶活性通过以麦芽三糖为底物进行反应，对通过将非还原末端的葡萄糖从
麦芽三糖转移到其他糖的反应所生成的麦芽糖进行定量来测定。1个酶活性单位定义为每分钟从麦芽三糖生成1μmol麦芽糖所用的酶量。
24.1.7α-异麦芽糖基转移酶本说明书中所说的“α-异麦芽糖基转移酶”是指由具有作为非还原末端的键合方式的α-1,6糖苷键和作为非还原末端以外的键合形式的α-1,4糖苷键的葡萄糖聚合度为3以上的糖质通过包括α-异麦芽糖基转移的反应生成环状四糖的酶。α-异麦芽糖基转移酶的酶活性通过以潘糖为底物进行反应，对通过将异麦芽糖从潘糖转移到其他糖的反应所生成的葡萄糖进行定量来测定。1个酶活性单位定义为每分钟从潘糖生成1μmol的葡萄糖所用的酶量。
25.1.8环状四糖生成酶及其酶活性单位本说明书中，简称为“环状四糖生成酶”的情况是指包含α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶且基本上不含其他酶的酶组合物。本说明书中，环状四糖生成酶的1个酶活性单位定义为每分钟从可溶性糊精生成按环状四糖换算合计为1μmol的环状四糖和支链环状四糖所用的酶量。
26.1.9异淀粉酶的酶活性单位本说明书中，异淀粉酶的酶活性按如下方式定义。即，向含有0.83％(w/v)lintner可溶性蜡质玉米淀粉、0.1m醋酸缓冲液(ph3.5)的底物水溶液3ml中加入适当稀释的酶液0.5ml，将底物溶液保持在40℃，在反应30秒后和30分钟30秒后，各取样0.5ml底物溶液，立即加入0.02n硫酸溶液各15ml，使反应停止，分别作为对照液和反应液。向得到的对照液和反应液中分别加入0.5ml的0.01n碘溶液，在25℃下显色15分钟，然后通过吸光光度计分别测定610nm波长处的吸光度，通过下述式[1]计算为淀粉分解活性。异淀粉酶的1个活性单位定义为在该测定条件下使610nm波长的吸光度增加0.004所用的酶的量。
[0027]
式[1]：[数1]
[0028]
1.10支链淀粉酶的酶活性单位本说明书中，支链淀粉酶的酶活性按如下方式定义。即，将1.25％(w/v)支链淀粉(株式会社林原制，支链淀粉酶活性测定用)水溶液作为底物溶液。在试管中称取该底物溶液4ml和0.1m醋酸缓冲液(ph5.0)0.5ml，预热至30℃。使用0.01m醋酸缓冲液(ph6.0)，加入适当稀释的酶液0.5ml，将底物溶液保持在30℃，在反应30秒后和30分钟30秒后，各取样0.5ml底物溶液，立即倒入到somogyi铜液2ml中，使反应停止，分别作为“对照液”和“反应液”。将得到的对照液和反应液供给用于somogyi-nelson法，通过吸光光度计分别测定520nm波长处的吸光度，由此测定生成的还原糖量，通过下述式[2]计算为支链淀粉分解活性。支链淀粉酶的1个活性单位定义为在该测定条件下每分钟使相当于1μmol麦芽三糖的还原糖游离所用的酶的量。
[0029]
式[2]：[数2]
标准液使用d-葡萄糖(100μg/ml)
[0030]
1.11环麦芽糊精葡糖基转移酶的酶活性本说明书中，环麦芽糊精葡糖基转移酶(以下称为“cgtase”)的酶活性按如下方式定义。即，向含有0.3％(w/v)可溶性淀粉、20mm醋酸缓冲液(ph5.5)、1mm氯化钙的底物水溶液5ml中加入适当稀释的酶液0.2ml，将底物溶液保持在40℃，在反应0分钟后和反应10分钟后，各取样0.5ml底物溶液，立即加入0.02n硫酸溶液各15ml，使反应停止，然后向各硫酸溶液中分别加入0.2ml的0.1n碘溶液而使之显色，20分钟后，通过吸光光度计分别测定660nm波长处的吸光度，通过下述式[3]计算为淀粉分解活性。cgtase的1个活性单位定义为在该测定条件下使溶液中的淀粉15mg的碘显色完全消失所用的酶量。
[0031]
式[3]：[数3]
[0032]
1.12还原力本说明书中所说的“还原力”是指使用d-葡萄糖作为标准物质，通过本领域通用的somogyi-nelson法和蒽酮硫酸法，将糖组合物的还原糖量和全糖量(总糖量)分别按d-葡萄糖换算而求出，可使用下述式[4]求出的糖组合物中的还原糖量相对于总糖量的百分比(％)。
[0033]
式[4]：[数4]
[0034]
以下，具体说明本发明的糖组合物、其用途和制造方法。
[0035]
2.本发明的糖组合物本发明的糖组合物具有下述(1)至(3)的特征：(1)除了上述环状四糖以外，还含有在上述环状四糖上键合有1分子或2分子以上葡萄糖的支链环状四糖，在使葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶作用于上述糖组合物时，相对于所得糖组合物的全部固体成分，上述环状四糖的含量按无水物换算，为38质量％以上；(2)在甲基化分析中，相对于构成该糖组合物的全部葡萄糖残基，α-1,4键合的葡萄糖所占的比例大于9％且为15％以下；以及(3)在甲基化分析中，相对于构成该糖组合物的全部葡萄糖残基，α-1,4,6键合的葡萄糖所占的比例小于6％。
[0036]
本发明的糖组合物是含有环状四糖和支链环状四糖以及其他共存糖质的糖组合物。如专利文献2所示，环状四糖和支链环状四糖本身是非还原性的，没有着色的可能，且不易成为热量源，另一方面，由于其他共存糖质通常具有还原力，因此成为着色的原因，而且可能成为热量源。因此，上述(1)的特征与使糖组成中具有环状四糖结构的糖质的总量最大化直接相关，是确保该糖组合物的低热量性的必要条件。当总环状四糖含量低于38质量％
时，必然能够成为着色原因和热量源的共存糖质的比率变高，难以实现低热量且低着色性的本发明的糖组合物的特征。
[0037]
上述(2)和(3)的特征通过构成本发明糖组合物的葡萄糖残基的键合方式来表征本发明的糖组合物。在甲基化分析中，在全部葡萄糖残基中，α-1,4键合的葡萄糖残基所占的比例的下限大于9％，优选为9.2％以上，更优选为9.5％以上，进一步优选为10％以上，上限为15％以下，优选为14.5％以下，更优选为14％以下的范围，当α-1,4,6键合的葡萄糖所占的比例小于6％时，即使在制成高浓度水溶液的情况下，也能够兼顾充分的低粘度和低着色性。此外，具有以上特征的本发明糖组合物在与通常的糖稀同样的固体成分浓度的水溶液中显示出足够低的水分活性。
[0038]
作为本发明糖组合物的更优选的具体例之一，可举出一种糖组合物，其除了包括上述(1)至(3)的特征以外，还包括特征：(4)相对于固体成分，按无水物换算的环状四糖的含量为25质量％以上。上述(4)的特征规定了用于计算食物热量值的系数即热量换算系数为0kcal/g的环状四糖(如后述的参考试验所示)的含量的下限值，由此，能够提供作为整体低热量的本发明的糖组合物，进而，相对于全部固体成分，按无水物换算的环状四糖的含量更优选为30质量％以上。
[0039]
作为本发明糖组合物的更优选的另一具体例，可举出一种糖组合物，其还包括特征：(5)相对于全部固体成分，按无水物换算，含有合计16质量％以下的聚合度为1和2的糖质；(6)相对于全部固体成分，按无水物换算，含有合计大于37质量％的除了环状四糖与1分子或2分子葡萄糖键合而成的支链环状四糖以外的聚合度为4～13的糖质。上述(5)的特征规定了可成为热量源且对着色性产生不良影响的聚合度为1和2的糖类的含量的上限值，由此，能够提供作为整体着色性没有问题且更低热量的本发明的糖组合物，更优选将该含量设定为15质量％以下。上述(6)的特征是本发明人独自发现的与更显著地发挥低热量性和低着色性相关的指标，据本技术人所知，它是从未通过制造含环状四糖的糖稀的现有技术的简单组合而实现的特征。予以说明，在上述(6)的特征中，在上述环状四糖上键合有3分子以上葡萄糖而得到的支链环状四糖未从聚合度4～13的糖质中排除的原因是：在上述环状四糖上键合有3分子以上葡萄糖的支链环状四糖一般难以与相同聚合度的其他糖质分离，难以仅将其取出而定量，并且在本发明的制造方法中，虽然生成了在上述环状四糖上键合有3分子以上葡萄糖的支链环状四糖，但其生成量极少。
[0040]
在将具有如上所述特征的本发明糖组合物制成固体成分浓度为73质量％的水溶液时，在15℃的环境下，通常粘度显示为35pa
·
s以下，优选为30pa
·
s以下，更优选为27pa
·
s以下。该粘度对于以往的含环状四糖的糖组合物的水溶液来说是不能兼顾低着色性的低水平，是在维持低着色性的同时，确保在较低温的作业环境下从容器中取出与其它材料混合直到获得最终制品为止的操作性良好的特性。另外，当将本发明的糖组合物制成相同浓度的水溶液时，水分活性通常低于0.88，优选低于0.87，更优选低于0.86，这充分达到了在食品制造中抑制杂菌污染所通常要求的水平。
[0041]
进而，作为本发明糖组合物的有用的特征，可举出：显示膳食纤维性。在本发明的
糖组合物中，通过高效液相色谱法(酶-hplc法)求出的水溶性膳食纤维含量通常为40质量％以上，优选为50质量％以上，更优选为60质量％以上。另外，本发明的糖组合物也可以通过还原力来表征，其还原力通常为7.5％以上且17％以下，优选为8.0％以上且15％以下。
[0042]
以上说明的本发明的糖组合物可以通过按照常规方法进行氢化而作为该糖组合物的还原物提供。
[0043]
3.含有本发明糖组合物的组合物如上所述，本发明的糖组合物及其还原物的粘度和水分活性充分低，为充分低着色性且低热量，制成水溶液时不易析出结晶，因此调制成高浓度的水溶液而作为含环状四糖的糖稀使用，也可以直接作为食品，另外例如可以用作化妆品、准药品(医药部外品)、药品、饲料、饵料、肥料等用途中使用的粉末化基材、粘合剂、赋形剂等，进而可以与适当的其他材料组合，例如有利地用于饮食品、饮食品材料、化妆品材料、准药品(医药部外品)材料、药品材料、饲料材料、饵料材料、肥料材料等。本发明还提供含有这样的本发明的糖组合物及其他材料的组合物。
[0044]
在将本发明的糖组合物或其还原物制成水溶液、用作含环状四糖的糖稀或含环状四糖的糖组合物的还原糖稀的情况下，其固体成分浓度通常为70质量％以上，优选为71质量％以上，更优选为73质量％以上。作为可配合或添加含环状四糖的糖稀或含环状四糖的糖组合物的还原糖稀形式的组合物(以下，称为“本发明的含环状四糖的糖稀”)的饮食品的具体例，可举出：合成酒、酿造酒、清酒、果酒、发泡酒、啤酒、白酒等酒类；碳酸饮料、乳饮料、奶昔、蔬菜汁、果冻饮料、运动饮料、醋饮料、豆乳饮料、含铁饮料、乳酸菌饮料、绿茶、红茶、可可饮料、咖啡、无醇饮料等饮料；米饭、粥、饼、年糕、面包等主食类；乌冬面、荞麦面、素面、冷麦、拉面等面类；意大利面、烤宽面条、通心面、通心粉等意大利面；春卷皮、饺子皮等小麦粉加工品；味噌汤、冬阴功汤、蛤蜊浓汤、牛骨汤等汤类；酸奶、奶酪、奶粉等乳制品；香肠、火腿等畜肉制品；鱼糕、竹轮、鱼肉山芋丸子、鱼肉香肠等鱼肉制品；海鲜罐头、干海鲜、盐渍食品、松前酱菜等海产品加工品；天妇罗、油炸食品、汉堡包、日式章鱼烧、烧麦、炸肉饼、护理食物、流食等熟食以及将它们冷冻的冷冻食品；软糖、硬糖、橡皮糖、果冻、曲奇、软曲奇、煎饼、细粒食品、日式甜点、糊化米、皮糖点心、饼类、蕨菜饼、馒头、米粉糕、馅类、羊羹、水羊羹、锦玉羹、果冻、果胶冻、慕斯、巴伐露斯、长崎蛋糕、饼干、薄脆饼干、派、布丁、奶油、奶油冻、鲜奶油、奶油泡芙、华夫饼、海绵蛋糕、热蛋糕、松饼、甜甜圈、巧克力、掼奶油、谷物棒、口香糖、黄油奶糖、牛轧糖、面酱、花生酱、果糊、果酱、柑橘酱、棉花糖、蛋白棒、谷物棒、能量棒等糕点；冰淇淋、果子露、意式冰淇淋等冷冻甜食；以及，酱油、酱油粉、味噌、味噌粉、醪、酱、拌饭素、蛋黄酱、调味汁、醋、三杯醋、寿司醋粉末、中国酱、天妇罗汁、面酱汁、调味汁、番茄汁、番茄酱、烤肉酱、烤鸡酱、烤鳗鱼酱、油炸粉、天妇罗粉、面糊粉、烤章鱼粉、日式烧饼粉、面包粉、咖喱酱、红烧汁、汤汁、汤底汁、煮物汤汁、水煮鱼调料、鱼蛋调料、干海味调料、复合调料、料酒、新料酒等各种调味料和烹饪加工品。予以说明，关于通过发酵制作的饮食品，本发明的环状四糖的糖稀不仅可以在发酵后添加，也可以在发酵前添加而以本发明的环状四糖的糖稀作为发酵材料。
[0045]
环状四糖其自身为稳定的物质，还具有保湿、防止脱水、防止蛋白质变性、防止脂质劣化等效果，因此本发明的含环状四糖的糖稀也能够有利地实施配合在化妆品中使用。在该化妆品中，本发明的含环状四糖的糖稀通常配合在允许应用于皮肤的其他成分的1种
或2种以上中，例如配合在允许外用于皮肤的适当选自以下成分的1种或2种以上中：油脂类、蜡类、烃类、脂肪酸类、酯类、醇类、表面活性剂、色素、香料、激素类、维生素类、植物提取物、动物提取物、微生物提取物、盐类、紫外线吸收剂、感光色素、抗氧化剂、防腐/杀菌剂、止汗/除臭剂、清凉剂、螯合剂、美白剂、消炎剂、酶、糖质、氨基酸类、增粘剂等。作为配合有本发明的含环状四糖的糖稀的化妆品，例如可举出：出：洗剂、霜、乳液、凝胶、粉末、膏、块等形态，肥皂、化妆皂、洗面奶、泡沫洗面乳、洗脸液、沐浴露、沐浴液、洗发水、护发素、洗发粉等清洁用化妆品，定型液、吹法液、头油、发乳、发胶、发露、生发油、生发水、生发药、染发剂、头皮护理剂、润发油、头发光泽赋予剂、发油、梳发油等头发化妆品，化妆水、雪花膏、润肤霜、润肤露、面膜用化妆品(凝胶状剥离型、凝胶状擦拭型、糊状冲洗型、粉末状等)、洁面膏、冷霜、护手霜、护手液、乳液、保湿液、须后水、剃须水、须前水、须后膏、须后泡沫、须前膏、化妆用油、婴儿油等基础化妆品，粉底(液状、膏状等)、爽身粉、婴儿爽身粉、体粉末、香体粉、香水粉、粉底基底、扑面粉(膏状、糊状、液状、粉末等)、眼影、眼霜、睫毛膏、眉笔、睫毛化妆品、腮红、脸颊化妆水等彩妆化妆品，香水、膏状香水、粉状香水、古龙水、古龙香水、浅香水等芳香化妆品、防晒霜、防晒露、防晒油、防晒膏、防晒液、防晒油等防晒化妆品，美甲、修脚、彩色指甲油、指甲油、卸甲油、指甲霜、指甲化妆品等指甲化妆品，眼线笔化妆品、口红、唇膏、胭脂、唇彩等口唇化妆品，牙膏、漱口水等口腔化妆品，浴盐、浴油、浴用化妆品等沐浴用化妆品等。
[0046]
本发明的含环状四糖的糖稀本身的热量低，而且具有使组合配合的其他成分稳定化的效果，因此可有利地用作药品的添加剂、赋形剂等。作为可配合本发明含环状四糖的糖稀的药品，例如可举出：青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素、硫酸卡那霉素等抗生素制剂；硫胺素、核黄素、l-抗坏血酸、肝油、类胡萝卜素、麦角甾醇、生育酚等维生素制剂；脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白酶、β-淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等酶制剂；药用人参提取物、鳖提取物、小球藻提取物、芦荟提取物、蜂胶提取物等提取物制剂；巨型细胞迁移抑制因子、菌落刺激因子、胰岛素、生长激素、催乳素、促红细胞生成素、卵泡刺激激素等含激素液体；bcg疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、脊髓灰质炎活疫苗、天花疫苗、破伤风疫苗、毒蛇抗毒素、人免疫球蛋白等生物制剂等，这些药品可以以液态、糊状、半固态、片状等剂型提供。
[0047]
本发明的糖组合物可以根据最终用途等目的，以与其他材料组合的组合物的形态提供为中间制品、预混料等。作为可用于饮食品、经口摄取的医药部外品、药品用途的其他材料，只要是可允许用作经口摄取材料的物质，就没有特别限制，例如可举出：山梨糖醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、麦芽三糖醇、赤藓糖醇、木糖醇、乳糖醇、panitol、海藻糖、糖基海藻糖、卷柏糖(selaginose)、褐藻寡糖(selaginooligosaccharide)、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等含有糖醇类的非还原性糖类；异麦芽糊精、难消化性葡聚糖、聚葡萄糖、葡聚糖、菊粉、低聚果糖等水溶性膳食纤维；阿拉伯胶、瓜尔豆胶、刺槐豆胶、角叉菜胶、果胶、半纤维素、支链淀粉等水溶性多糖类；二氢查耳酮、蛇菊苷、α-糖基蛇菊苷、甜叶菊甙、甘草甜素、l-天门冬酰-l-苯丙氨酸甲酯、乙酰舒泛钾、祝马丁、应乐果甜蛋白等高甜度甜味料；甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酸盐、大豆肽等氨基酸和蛋白质；肌苷酸、肌苷酸盐、鸟苷酸、鸟苷酸盐等核酸；甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、卵磷脂、皂苷、酪蛋白钠等乳化剂；维生素c及其糖衍生物、烟酸、泛酸、叶酸、生物素、橙皮苷及其糖衍生物、柚皮苷及其糖衍生物等维生素类；绿茶、乌龙茶、路易波士茶、茉莉花茶、咖啡、果汁等
茶叶、果实以及其他植物的提取物或榨汁等。作为可用于化妆品、皮肤外用的准药品(医药部外品)、药品的用途的其他材料，只要是作为供用于皮肤外用材料所允许的材料，就没有特别限制，除了作为饮食品用途而例示的上述其他材料以外，例如还可以举出以下材料：榅桲籽、海藻酸钠、阳离子化纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基淀粉、海藻酸丙二醇酯、胶原蛋白、角蛋白、酪蛋白、白蛋白、明胶、羟丙基三甲基氯化铵醚、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸钠、聚乙烯基甲基醚、羧乙烯基聚合物等水溶性高分子；抗坏血酸2-葡糖苷、曲酸、乳酸、邻氨基苯甲酸、香豆素、苯并三唑、咪唑啉、嘧啶、二烷、呋喃、吡喃酮、烟酸、熊果苷、黄芩苷、黄芩素等美白剂；没食子酸丙酯、没食子酸丁酯、没食子酸辛酯、没食子酸十二烷基酯、去甲二氢愈创木酸、丁基羟基苯甲醚、二丁羟基甲苯、4-羟甲基-2,6-二叔丁基苯酚等抗氧化剂；阴离子系表面活性剂、阳离子系表面活性剂、两性离子系表面活性剂、非离子系表面活性剂等表面活性剂等。
[0048]
含有具有以上特征的本发明糖组合物的组合物以及含环状四糖的糖稀作为在用于家畜，家禽，宠物，其他蜜蜂，蚕，鱼贝类，虾、蟹等甲壳类，海胆、海参等棘皮动物，昆虫的幼虫、幼体、成体等的饲料、饵料中配合的材料、以及作为在发芽植物、幼苗、移植菌等给幼体的肥料中配合的材料等，可有利地利用。
[0049]
4.本发明的糖组合物的制造方法以下，说明本发明糖组合物的制造方法。本发明糖组合物的制造方法的特征在于，包括以下工序：使α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶作用于淀粉部分分解产物，生成含有环状四糖的糖组合物的工序(工序1)；以及，精制和收集由工序1生成的糖组合物的工序(工序2)，其中，在工序1中还使淀粉脱支酶作用于淀粉部分分解产物。
[0050]
本发明的制造方法中使用的α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶只要是能生成本发明的糖组合物，其供给源不限。作为供给源，具体可举出专利文献2等中公开的芽孢杆菌属和节杆菌属的微生物，作为该两种酶的供给源，特别优选为：圆孢芽孢杆菌(bacillus globisporus)c9株(ferm bp-7143)、圆孢芽孢杆菌(bacillus globisporus)c11株(ferm bp-7144)、圆孢芽孢杆菌(bacillus globisporus)n75株(ferm bp-7951)或它们的突变株、球形节杆菌(arthrobacter globformis)n75株(ferm bp-7591)或它们的突变株。该两种酶既可以为分别经分离纯化的纯化酶，也可为包含该两种酶的粗纯化酶，还可以为供给源微生物等的提取物或培养物等。上述例示的微生物菌株或它们的突变株通过常规方法培养时，通常在培养基中也产生该两种酶，因此从该培养物中过滤菌体而得到的滤液的浓缩液可以用作包含该两种酶的环状四糖生成酶剂，这种酶剂是特别适合的，因为制造其所需的成本和劳动力低。另外，当然也可以使用将编码该两种酶的基因分离并通过基因重组而得到的酶。
[0051]
作为通过上述2种酶生成环状四糖的材料，使用淀粉部分分解产物。淀粉的种类没有特别限制，可以是来源于玉米、小麦、米等地上淀粉，也可以是马铃薯、红薯、木薯等地下淀粉。该淀粉的部分水解产物可以通过利用常规方法用酸或α-淀粉酶等处理淀粉而得到。水解程度越低，环状四糖的生成率越高而优选，如果用作为表示水解程度的指标已知的de(葡萄糖当量)表示，适宜的是，通常为20以下，优选为12以下，更优选为7以下。
[0052]
本发明糖组合物的制造方法是在使α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖
基转移酶作用于上述那样的淀粉部分分解产物而生成环状四糖的工序1中，最大的特征之一是还使淀粉脱支酶作用于淀粉部分分解产物。作为本发明使用的淀粉脱枝酶，只要能够生成本发明的糖组合物，其种类和供给源就没有特别限制，例如可举出：异淀粉酶(ec 3.2.1.68)、支链淀粉酶(ec 3.2.1.41)、低聚-1,6-葡糖苷酶(ec 3.2.1.10)、淀粉-1,6-葡糖苷酶(ec 3.2.1.33)等，其中，由淀粉皮假单胞菌(pseudomonas amyloderamosa)产生的异淀粉酶、由芽孢杆菌属(bacillus sp.)微生物产生的支链淀粉酶在不妨碍环状四糖的生成反应的情况下，降低结果得到的糖组合物的粘度的效果高，因此特别优选。
[0053]
在通过上述酶作用而生成环状四糖的工序1中，当同时作用cgtase(ec 2.4.1.19)时，可进一步提高环状四糖的生成率，因此除了上述酶以外，还可以并用cgtase。cgtase的供给源没有特别限制，例如，作为其供给源，可举出：嗜热脂肪地芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus)、依利诺斯类芽孢杆菌(paenibacillusillinoisensis)、饲料类芽孢杆菌(paenibacillus pabuli)、解淀粉类芽孢杆菌(paenibacillus amylolyticus)等，其中，由嗜热脂肪地芽孢杆菌产生的cgtase提高环状四糖生成率的效果高，尤其有用。
[0054]
在本发明的糖组合物的制造方法中，通过其全部工序，在不使用外切型淀粉酶的情况下，通过将该糖组合物用作糖稀，可以制成低粘度且更低着色性的物质，因而更优选。在生成环状四糖的工序中或其工序后，当作用该外切型淀粉酶时，还原性的单糖和二糖等的含量提高，结果，难以实现低的着色性，难以达到本发明的目的。作为推荐在本发明糖组合物的制造方法中不使用的外切型淀粉酶，可举出：葡糖淀粉酶(ec 3.2.1.20)、α-葡糖苷酶(ec 3.2.1.20)、β-淀粉酶(ec3.2.1.2)等具有生成单糖或二糖的作用的淀粉酶。予以说明，在利用酶的一般的糖稀的制造中，在酶促反应的最终阶段，作为精加工，有时使α-淀粉酶等内切型淀粉酶作用。目的在于，在生成糖稀形式的糖组合物的酶促反应结束时，将少量残存的高分子葡聚糖低分子化，提高其后的精制工序的效率。通常，在该操作中，糖组成基本上不变化。在本发明糖组合物的制造方法中，作为精加工，可以使内切型淀粉酶作用，作为这样的内切型淀粉酶，更优选为液化型淀粉酶。另外，根据需要，可以并用难以生成单糖或二糖的、具有生成聚合度为3以上的麦芽低聚糖的作用的外切型淀粉酶、更优选具有生成聚合度为4以上的麦芽低聚糖的作用的外切型淀粉酶。
[0055]
生成环状四糖的工序1中的酶作用的条件，例如材料的浓度、反应时间、反应温度、反应ph等可以根据所要得到的总环状四糖的含量值、所使用的酶的种类、起源等目的和情况而适当选择，反应温度通常设为40℃至60℃，优选设为45℃至55℃，反应ph通常设为大于4.5且小于7.0，优选设为5.0至6.7，更优选设为5.5至6.3。在假设48小时结束酶促反应的情况下，作为原料的淀粉部分分解产物的浓度按固体成分浓度计，下限通常优选为1质量％以上，上限通常为40％以下，优选为35质量％以下，更优选为33质量％以下。在使用α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶作为环状四糖生成酶的情况下，酶的作用量相对于固体成分的原料1g，通常为0.2单位至5单位，优选为0.7单位至4单位，更优选为1单位至3单位，进一步优选为1.2单位至2.5单位的范围，当使用异淀粉酶作为淀粉脱支酶时，相对于原料固体成分1g，通常为100单位至2000单位，优选为200单位至1000单位，更优选为400单位至600单位的范围，当使用支链淀粉酶时，相对于原料固体成分1g，通常为0.5单位至10单位，优选为1单位至8单位，更优选为2单位至6单位的范围，当使用cgtase时，相对于原料固体成分1g，通常为0.1单位至5单位，优选为0.2单位至3单位，更优选为0.4单位至2单
位的范围。在将总反应时间设定为48小时以外时，根据时间的长短，酶作用量可适当增减。添加酶的时机没有特别限制，既可以将所使用的酶全部同时添加，也可以逐次添加。虽然取决于原料的进料浓度和其他条件，但为了在不提高所得糖组合物的着色性的情况下提高总环状四糖的含量，优选依次添加，此时，优选按照环状四糖生成酶、接着cgtase、最后淀粉脱支酶的顺序添加，添加淀粉脱支酶的时机通常在经过总反应时间的1/2的时间点以前，优选在经过总反应时间的1/5的时间点以前。虽然取决于原料的固体成分浓度为30质量％以上的情况等诸条件，但当在环状四糖的生成达到稳定后添加淀粉脱枝酶时，得到的糖组合物的粘度有时没有充分降低，因此根据其他诸条件，是不推荐的。作为环状四糖生成反应的精加工，在使用内切型淀粉酶时，作为其作用量，在假设2小时左右的反应时间时，相对于原料固体成分1g，通常优选设为1单位至40单位，优选设为2单位至25单位，更优选设为4单位至15单位。
[0056]
将按如上所述完成了环状四糖生成反应的反应液转移到下一工序2，进行精制、收集。精制可按照本领域的常规方法进行，作为常规方法，例如可举出：硅藻土过滤、利用活性炭的脱色、利用h型、oh型的离子交换树脂的脱盐等。精制后，可以在适当调整浓度后，通过喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥等，作为固体形式收集，也可以在精制后浓缩，调整至期望浓度，作为糖稀收集。如此可制造本发明的糖组合物。另外，在本发明的糖组合物的制造方法中，可以在利用酶的环状四糖的生成反应之后、收集之前，根据常规方法进行氢化，得到该糖组合物的还原物。予以说明，以上说明的本发明糖组合物的制造方法只是用于得到本发明糖组合物的优选例，只要能够得到具有上述(1)～(3)的特征的本发明的糖组合物，例如也可以在高纯度的环状四糖中适当配合另外制备的支链环状四糖和共存糖质来制造。
[0057]
以下，基于实验和实施例说明本发明，但它们只不过是具体例，本发明并不限定于此。
[0058]
《实验1：各种含环状四糖的糖稀的制备和物性的评价》《实验1-1：各种含环状四糖的糖稀的制备》在利用α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶的环状四糖的生成反应中，基于判明总环状四糖含量与其他糖质相比显示出充分高的值的现有技术的反应体系(后述的受试样品1的反应体系)，对所使用的酶或其添加时机进行各种变更，制备共计7种含环状四糖的糖组合物(糖稀)作为受试样品。
[0059]
《实验1-1-1：材料》
·
环状四糖生成反应的原料作为环状四糖生成反应的原料，使用通过常规方法利用高温液化酶将玉米淀粉部分水解而得到的液化液。通过常规方法求出固体成分浓度和de，结果分别为30质量％、de5。
[0060]
酶作为含有α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶的环状四糖生成酶，按照专利文献1的实验3的方法，培养圆孢芽孢杆菌(bacillus globisporus)c9株(ferm bp-7143)，按照常规方法，用uf膜对通过sf膜将该培养物除菌而得到的滤液进行浓缩而得到的物质。酶活性测定按如下所述进行。即，将适当稀释了该环状四糖生成酶的液体500μl和含有2％(w/v)可溶性糊精(商品名“pine-dex#100”，松谷化学工业株式会社制)的50mm醋酸缓冲液(ph6.0)500μl混合，在40℃下保持1小时使之反应后，煮沸10分钟使反应停止，然
后，供给于总环状四糖含量分析(后述)，对上述反应生成的总环状四糖进行定量，求出酶活性。得到的环状四糖生成酶的活性为492单位/ml。
[0061]
作为α-葡糖苷酶，使用天野酶株式会社制的该酶(商品名“转葡糖苷酶l“amano
””
，13,000单位/ml)。作为葡糖淀粉酶，使用长濑chemtex株式会社制的该酶(商品名“denazyme gsa/r”，3,800单位/g)。作为异淀粉酶，使用株式会社林原制的该酶(来自淀粉皮假单胞菌(pseudomonas amyloderamosa)，553,500单位/g)。作为支链淀粉酶，使用天野酶株式会社制的该酶(商品名“支链淀粉酶“amano”3”、3,000单位/g)。作为cgtase，使用株式会社林原制的该酶(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus)，1,634单位/g)。作为α-淀粉酶，使用长濑chemtex株式会社制的该酶(商品名“neo-spitase pk-6/r”，37,500单位/g)。
[0062]
《实验1-1-2：各种含环形四糖的糖稀的制备》
·
受试样品1按照专利文献1的实施例a-9中记载的方法，向原料(玉米淀粉液化液，de5，固体成分浓度30质量％)中加入相对于1g该固体成分为2单位的环状四糖生成酶和相对于1g该固体成分为1单位的cgtase，在ph6.0、50℃下保持48小时，进行环状四糖生成反应。然后，将反应液在95℃下保持30分钟，使反应停止，冷却至常温后，按照常规方法，供于过滤、利用h型和oh型离子交换树脂的脱盐，再用活性炭脱色，用蒸发器浓缩，制成固体成分浓度为73质量％，得到受试样品1。
·
受试样品2在环状四糖生成反应开始后经过5小时的时间点，添加相对于原料固体成分1g为500单位的异淀粉酶，除此以外，进行与受试样品1同样的操作，得到受试样品2。
·
受试样品3在环状四糖生成反应开始后经过5小时的时间点，添加相对于原料固体成分1g为5单位的支链淀粉酶，除此以外，进行与受试样品1同样的操作，得到受试样品3。
·
受试样品4在完成环状四糖生成反应后，添加相对于原料固体成分1g为5单位的α-淀粉酶，在ph6.0、50℃下保持20小时，然后在95℃下保持30分钟，使反应停止，除了上述操作以外，进行与受试样品1同样的操作，得到受试样品4。
·
受试样品5在完成环状四糖生成反应后，添加相对于原料固体成分1g为500单位的异淀粉酶，在ph6.0、50℃下保持20小时，然后在95℃下保持30分钟，使反应停止，除了上述操作以外，进行与受试样品1同样的操作，得到受试样品5。
·
受试样品6在完成环状四糖生成反应后，添加相对于原料固体成分1g为5单位的α-淀粉酶、相对于原料固体成分1g为1单位的葡糖淀粉酶和相对于原料固体成分1g为500单位的异淀粉酶，在ph6.0、50℃下保持20小时，然后在95℃下保持30分钟，使反应停止，除了上述操作以外，进行与受试样品1同样的操作，得到受试样品6。
·
受试样品7在完成环状四糖生成反应后，添加相对于原料固体成分1g为5单位的α-淀粉酶、相
对于原料固体成分1g为1单位的葡糖淀粉酶和相对于原料固体成分1g为5单位的支链淀粉酶，在ph6.0、50℃下保持20小时，然后在95℃下保持30分钟，使反应停止，除了上述操作以外，进行与受试样品1同样的操作，得到受试样品7。
·
受试样品8在环状四糖生成反应时，添加相对于原料固体成分1g为2.5单位的环状四糖生成酶和相对于原料固体成分1g为0.5单位的cgtase，在环状四糖生成反应开始后经过5小时的时间点，添加相对于原料固体成分1g为400单位的异淀粉酶，在环状四糖生成反应开始后保持56小时，以及在完成环状四糖生成反应后，添加相对于原料固体成分1g为5单位的α-淀粉酶，在80℃下反应2小时，除此以外，进行与受试样品1同样的操作，得到受试样品8。
[0063]
《实验1-2：分析》
·
糖组成分析得到的受试样品中所含的环状四糖等糖质的相对于全部固体成分的含量(质量％)通过基于将其供给于在以下条件下使用市售高效液相色谱系统(商品名“prominence”，株式会社岛津制作所制)的高效液相色谱(以下，称为“hplc”)而得到的色谱按百分比法计算而求出。在该分析中，对于环状四糖和键合有1分子或2分子葡萄糖的支链环状四糖的合计、作为聚合度为1或2的糖质的葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖的合计、以及其他全部糖质的合计即“其他”，求出各自的含量。
[0064]
《hplc条件》色谱柱：将2根“mci gel ck04 ss”(三菱化学株式会社制)串联连接样品浓度：按固体成分浓度计1质量％样品进样量：20μl洗脱液：超纯水流速：0.4ml/分钟温度：80℃检测：差示折射率
[0065]
·
总环状四糖含量分析得到的受试样品中的总环状四糖含量通过如下方法求出：是将调整为固体成分浓度2质量％的溶液0.5ml与含有400单位/ml的α-葡糖苷酶和10单位/ml的葡糖淀粉酶的50mm醋酸缓冲液(ph5.0)0.5ml混合，在50℃下保持24小时，完全消化环状四糖以外的葡萄糖彼此间的键，煮沸10分钟而停止消化反应，通过常规方法供于脱盐、用滤膜的过滤后，供给于下述条件下的hplc，基于得到的色谱，通过面积百分比法求得。予以说明，通过该条件下的酶促反应，像受试样品那样的含有环状四糖、支链环状四糖和共存糖质的糖组合物的环状四糖以外的糖链部分被完全水解成葡萄糖，其结果，反应后成为基本上仅由环状四糖和葡萄糖构成的糖组合物。
[0066]
《hplc条件》色谱柱：“shodex sugar ks-801(na型)”(昭和电工株式会社制)流速：0.5ml/分钟温度：60℃予以说明，此处未示出的装置和条件与上述糖组成分析(低聚合度侧)的情况相
同。
[0067]
·
粘度测定各受试样品的粘度使用流变仪(商品名“mcr102”，安东帕日本公司制)，在样品温度和环境温度为15℃的条件下测定而求出。
[0068]
·
水分活性测定各受试样品的水分活性使用水分活性测定系统(商品名“aqualab series 4tdl”，ainx公司社制)测定。
[0069]
《实验1-3：结果和考察》将实验1-1中得到的受试样品1～8按照实验1-2所示的方法进行糖组成分析、总环状四糖含量分析、粘度测定、水分活性分析，结果示于表1。予以说明，表1中一并示出了在制备受试样品1至8时使用的酶的种类和添加的时间点，表中的“ ”表示添加了该酶，
“‑”
表示未添加酶。
[0071]
如表1所示，在表1记载的酶中，在除了环状四糖生成酶和cgtase以外还使其他酶产生作用的情况下(受试样品2～8)，总环状四糖含量显示出与通过现有方法得到的受试样品1同等水平的值。当考虑关于用于计算食物热量值的系数即热量换算系数，相对于葡萄糖为4kcal/g，环状四糖为0kcal/g(如后述的参考试验所示)、以及后述的实验4、实施例1和比
较例1中的热量值的估算结果时，认为若总环状四糖含量为38质量％以上，可期待作为糖质材料的热量足够低。另外，关于水分活性，均显示为避免食品中的微生物污染所需的0.88以下的值，在这一点上也是令人满意的。从粘度来看，作为现有技术的受试样品1为45.6pa
·
s，与此相比，在生成环状四糖的反应中使作为淀粉脱枝酶的异淀粉酶或支链淀粉酶发生作用的受试样品2、3和8的粘度分别为26.4pa
·
s、18.1pa
·
s和32.4pa
·
s，与通过现有方法得到的受试样品1相比显著降低。
[0072]
另一方面，没有淀粉脱支酶的作用、在生成环状四糖的反应后使作为内切型淀粉酶的α-淀粉酶作用的受试样品4和并非在反应中而是在反应后使作为淀粉脱枝酶的异淀粉酶作用的受试样品5与受试样品1相比，没有观察到粘度的显著降低(粘度分别为36.1pa
·
s和38.3pa
·
s)。另外，在生成环状四糖的反应后使作为具有生成单糖的活性的外切型淀粉酶的葡糖淀粉酶和作为内切型淀粉酶的α-淀粉酶与作为淀粉脱枝酶的异淀粉酶或支链淀粉酶一起作用的受试样品6和7中，粘度与作为基本的受试样品1相比显著降低(分别为18.7pa
·
s和13.4pa
·
s)。另一方面，在生成环状四糖的反应中使作为淀粉脱枝酶的异淀粉酶作用、并且在反应后仅使作为内切型淀粉酶的α-淀粉酶作用的受试样品8中，粘度为32.4pa
·
s，与受试样品1相比降低至实用上容许的水平即35pa
·
s以下。
[0073]
仅从粘度测定值来看，可期待受试样品2、3、6、7和8能够解决本发明提出的课题，但目前尚不清楚该粘度测定值反映了何种程度的实际操作性，另外，关于着色性，仅由以上结果无法判断。
[0074]
《实验2：各种含环状四糖的糖稀的操作性、着色性的评价》接受实验1的结果，在实验2中，为了明确以下内容而进行了评价。(i)实验1中获得的各受试样品的粘度的差异是否影响实际操作性。(ii)实验1中获得的各受试样品的着色性是否存在差异。
[0075]
《实验2-1：方法》
·
操作性的评价方法在使环境温度和所使用的材料的温度全部为15℃的条件下，在1l容量的玻璃制烧杯中称取实验1中制备的各受试样品500g，向其中轻轻加入去离子水200g，用金属刮勺混合至整体均匀。作为对照，将预先调整至固体成分浓度为73质量％的市售的含麦芽四糖的糖稀(商品名“tetrup”，株式会社林原制，麦芽四糖含量为50质量％以上)在相同条件下进行同样处理，用金属刮勺混合至整体均匀。将混合受试样品至整体均匀所需的时间和力与将对照样品混合至整体均匀所需的时间和力进行比较，按以下3个等级进行评价。
“○”
(操作性“优”)：与对照同等
“△”
(操作性“良”)：与对照相比，需要较多的时间和力，但操作上没有障碍
“×”
(操作性“不良”)：与对照相比，需要大量的时间和力，操作上有障碍
[0076]
·
着色性的评价方法将含有按固体成分计为10质量％的受试样品1～8、含1质量％甘氨酸的50mm醋酸缓冲液(ph6.0)封入密闭容器中，将其在沸水浴中保持1小时。作为对照，对上述市售的含麦芽四糖的糖稀进行同样操作。在沸水浴中保持1小时后，进行骤冷，通过常规方法测定460nm处的吸光度，并通过目测相互比较着色度。对照样品的吸光度为0.100。将各受试样品的结果与对照样品进行比较，按以下3个等级评价着色性。
“○”
(着色性“低”)：吸光度为对照的1.3倍以下，与对照相比，目测观察到着色度几乎没有差异。
“△”
(着色性“中”)：吸光度大于对照的1.3倍且为对照的1.6倍以下，与对照相比，目测观察到有若干着色，判断为在通常的食品制造中可允许的范围。
“×”
(着色性“高”)：吸光度大于对照的1.6倍，与对照相比，目测观察到明显较强的着色，判断为在通常的食品制造中是不允许的。
[0077]
《2-2：结果和考察》结果示于表2。
[0078]
[表2]受试样品no.12345678操作性
×○○××○○○
着色性
○○△○○××△
[0079]
如表2所示，受试样品2、3和8在认为与粘度相关的操作上被评价为
“○”
(优)，操作性没有问题，在着色性的方面也被评价为
“○”
(低)或
“△”
(中)，没有问题。另一方面，同样为低粘度的受试样品6和7虽然在操作性方面均评价为
“○”
(优)，但在着色性方面不能令人满意。着色性被评价为
“×”
(高)的受试样品6、7含有超过16质量％的聚合度为1或2的糖质，认为为了使着色性没有问题，可以使聚合度为1或2的糖质的含量为16质量％以下。另外，受试样品4、5的着色性被评价为
“○”
(优)，但操作性被评价为
“×”
(不良)。一并考虑实验1中观察到的低热量性和低水分活性，认为受试样品2、3、8能够解决本发明的课题。
[0080]
接着，受试样品2、3和8与其他受试样品相比，尽管总环状四糖含量没有显著差异，但显示出低粘度和良好的操作性，为了探究与这些特性相关的结构上的特征，进行了下述所示的实验3。
[0081]
《实验3：与含环状四糖的糖稀的操作性相关的结构的探求》为了明确影响各受试样品的操作性的差异的结构上的差异，着眼于各受试样品中的各键合方式的葡萄糖残基的含量和中等程度聚合度的糖质的含量，进行下述分析。
[0082]
《实验3-1：方法》
·
甲基化分析根据ciucanu等人著的carbohydrate research，第131卷，第2号、209-217页(1984)中记载的方法，对实验1中得到的各受试样品，首先将游离的羟基进行甲基化，完全水解而得到甲基化葡萄糖，将其还原成甲基化葡糖醇，最后将得到的甲基化葡糖醇的羟基进行乙酰化而得到甲基化葡萄糖乙酸酯。这样，将从各受试样品得到的甲基化葡萄糖乙酸酯在下述所示的条件下供于使用市售的气相色谱系统(商品名“gc-2010plus”，株式会社岛津制作所制)的气相色谱(以下，称为“gc”)，求出各受试样品中的键合方式不同的葡萄糖残基的含量(％)。
[0083]
《gc条件》色谱柱：inertcap5毛细管柱(内径0.25mm
×
长度30m
×
膜厚0.25μm，gl science公司制)
·
气体：氦气柱温：在130℃下保持3分钟后，以5℃/分钟升温至250℃，在250℃下保持10分钟
流速：1.0ml/分钟检测：fid进样量：1μl(分流1/50)分析时间：46分钟
[0084]
·
中等程度的聚合后的糖质的含量的测定在与实验1中为分析糖组成而进行的hplc相同的条件下，分析聚合度明确的麦芽低聚糖的混合物，将结果得到的色谱图与实验1中对各受试样品得到的色谱图进行对比，通过面积百分比法测定——实验1中未详细评价和研究的中等程度的聚合后的糖质，即判断聚合度相当于4～13的糖质(其中不包括根据上述条件下的hplc的特性的环状四糖和在环状四糖上键合有1分子或2分子葡萄糖的支链环状四糖)的含量。
[0085]
·
还原力的测定关于还原力，使用d-葡萄糖作为标准物质，通过以下记载的somogyi-nelson法测定还原糖量，通过蒽酮硫酸法测定总糖量，将它们代入上述式[4]，进行计算，由此求出还原力。
[0086]
·
通过somogyi-nelson法的测定将somogyi铜试剂2ml和稀释至校准曲线范围内的样品1ml混合后，煮沸10分钟，用流水冷却。然后，在冷却的液体中迅速加入nelson试剂2ml进行混合。静置至加入nelson试剂后的黄绿色变化为蓝色，然后加入水5ml进行搅拌，在波长520nm下测定吸光度。根据测得的吸光度和校准曲线求出还原糖量。校准曲线使用d-葡萄糖标准溶液制作。
[0087]
·
利用蒽酮硫酸法的测定向在冰水中预冷的0.2％蒽酮试剂5ml中轻轻地倒入校准曲线的样品0.5ml，充分混合，煮沸10分钟，然后用流水冷却，在波长620nm下测定吸光度。根据测得的吸光度和校准曲线求出总糖量(全糖量)。校准曲线使用d-葡萄糖标准溶液制作。
[0088]
《实验3-2：结果和考察》表3中示出了通过对各受试样品进行甲基化分析而求得的各键合方式的葡萄糖残基的含量。另外，通过测定中等程度的聚合度的糖质的含量，确认各受试样品所示的粘度与相当于聚合度4～13的糖质的含量之间存在一定的关系，因此，在表3中一并示出了相当于该聚合度的糖质的含量。操作性和着色性的结果是从表2中转记的。
[0090]
·
关于键合方式与粘度和着色性的关系由表3所示的结果可知，观察操作性和着色性与通过甲基化分析得到的各键合方
式的葡萄糖残基的含量之间的相关性时，认为α-1,4键合的葡萄糖和α-1,4,6键合的葡萄糖的含量与操作性和着色性具有特征性相关性。即，操作性被评价为“不良”的受试样品1、4、5的α-1,4键合的葡萄糖的含量较高(分别为15.4％、15.3％、15.6％)，另一方面，操作性被评价为“优”但着色性被评价为“高”、即在着色性方面有问题的受试样品6、7被观察到α-1,4键合的葡萄糖的含量较低的倾向(分别为8.2％、6.3％)。另外，当观察α-1,4,6键合的葡萄糖含量时，观察到受试样品1、4、5的α-1,4,6键合的葡萄糖的含量较高，受试样品6、7的α-1,4,6键合的葡萄糖的含量较低的倾向。由以上可知，操作性差的在着色性方面没有问题，因为它们的α-1,4键合的葡萄糖的含量高，相反，操作性良好但着色性上有问题，因为它们的α-1,4键合的葡萄糖和α-1,4,6键合的葡萄糖的含量均倾向于较低。
[0091]
综合地观察后面详述的实施例1和比较例1时，认为：在通过使α-异麦芽糖基葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶作用于淀粉部分分解产物而进行的环状四糖生成反应所得到的糖组合物中，除了像受试样品2、3和8那样在进行环状四糖生成反应的同时还使淀粉脱枝酶发生作用的情况以外，一般而言，当α-1,4键合的葡萄糖的含量大于15％或者α-1,4,6键合的葡萄糖的含量为6％以上时，倾向于得到在操作性上产生问题、但在着色性上没有问题的糖组合物。相反，认为：当α-1,4键合的葡萄糖的含量为9％以下时，α-1,4,6键合的葡萄糖的含量成为低于6％的值，倾向于得到在操作性上没有问题、但在着色性上有问题的糖组合物。
[0092]
与此相比，在进行环状四糖生成反应的同时还使淀粉脱枝酶发生作用的受试样品2、3和8中，α-1,4键合的葡萄糖大于9％且为15％以下，α-1,4,6键合的葡萄糖低于6％。而且，与该情况联动，受试样品2、3和8没有操作性的问题，在着色性方面也没有问题。综上，连同后述的实施例1和比较例1的结果一并可知，通过使α-1,4键合的葡萄糖的含量大于9％且为15％以下、并且使α-1,4,6键合的葡萄糖的含量低于6％，能够得到既没有操作性问题也没有着色性方面的问题的含环状四糖的糖稀。予以说明，受试样品2、3和8的粘度如上述表1所示，分别为26.4pa
·
s、18.1pa
·
s和32.4pa
·
s，与通过以往的制造方法制造的受试样品1的45.6pa
·
s相比，为显著低的值。此外，从粘度分别为36.1pa
·
s和38.3pa
·
s的受试样品4、5的操作性被评价为“不良”(
×
)的结果来看，本发明糖组合物的粘度优选为35.0pa
·
s以下，更优选为33.0pa
·
s以下。
[0093]
通过在使用α-异麦芽糖葡糖基糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶的环状四糖的生成反应中并用淀粉脱枝酶而得到的上述见解，可以说是本发明人等独自发现的全新的划时代的见解。
[0094]
·
关于操作性和着色性与制造方法的关联从与制造方法的相关性来看：由表1、2和4所示的结果明确可知，操作性良好且显示低着色性的α-1,4键合的葡萄糖的含量大于9％且15％以下且α-1,4,6键合的葡萄糖的含量小于6％的含环状四糖的糖稀——是通过在环状四糖生成反应的进行中使淀粉脱枝酶发挥作用而有效得到的。另一方面，不作用(使用)淀粉脱枝酶而使作为内切型淀粉酶的α-淀粉酶作用的情况(受试样品4)、使淀粉脱枝酶在环状四糖的生成反应后作用的情况(受试样品5)、使作为外切型淀粉酶的葡糖淀粉酶与淀粉脱枝酶一起作用的情况(受试样品6、7)——得不到α-1,4键合的葡萄糖和α-1,4,6键合的葡萄糖的含量落入上述范围内的含环状四糖的糖组合物(糖稀)，认为：不作用(使用)淀粉脱支酶而仅使内切型淀粉酶作用的情
况、虽然使淀粉脱支酶作用但却是在环状四糖的生成反应完成后作用的情况，使外切型淀粉酶与淀粉脱枝酶一起作用的情况——均难以达到本发明的目的。
[0095]
·
关于聚合度为中等程度的糖质的含量与操作性和着色性的关系观察表3所示的聚合度为中等程度(聚合度4～13)的糖质的含量的结果，在操作性和着色性方面没有问题的受试样品2、3和8中，聚合度为4～13的糖质(不包括环状四糖和在环状四糖上键合有1分子或2分子葡萄糖的支链环状四糖)的含量比其他情况显著高，大于37质量％。由此认为，聚合度4～13的糖质的含量是与良好的操作性和低着色性不相容的特性，认为：除了上述特定键合方式的葡萄糖残基以外，聚合度为4～13的糖质的含量也可以用于含环状四糖的糖组合物是否兼具良好的操作性和低着色性的指标。
[0096]
《实验4：其他的分析、评价》通过上述所示的实验1、2和3可确认，受试样品2、3和8在良好的操作性和低着色性方面，解决了本发明揭示的课题。在实验4中，对作为其他课题的保存中糖质没有析出以及低热量性进行了评价试验，同时进行了膳食纤维性的评价。
[0097]
《实验4-1：材料》以实验1-1-2中制备的受试样品2、3和8为评价对象。
[0098]
《实验4-2：方法》
·
保存中的结晶析出性的评价将受试样品2、3、8、以及作为对照的与实验2中使用的相同的含麦芽四糖的糖稀各自等量地取入玻璃制烧杯中，在4℃下保持1周后，目测评价有无析出物。
[0099]
·
热量值的计算如后述的参考试验所示，求得环状四糖的热量换算系数为0kcal/g。另一方面，假设如实验1中制备的那样的含环状四糖的糖稀在生物体内被消化，共存糖质和支链环状四糖中的支链结构部分全部变成葡萄糖，成为热量源。基于以上假设，将从100质量％减去受试样品2、3和8的总环状四糖含量(质量％)得到的值乘以葡萄糖的热量换算系数4kcal/g，求出各受试样品的热量值。
[0100]
·
膳食纤维含量的测定精密称取受试样品2、3和8的固体成分各100mg，基于营养表示标准(平成8年5月厚生省告示第146号)中的营养成分等的分析方法等(营养表示基准的附表1第3栏所示的方法)、8.膳食纤维、(2)高效液相色谱法(酶-hplc法)记载的方法，使用市售的总膳食纤维测定试剂盒(商品名“dietary fiber total assay control kit”，sigma公司制)，将其供于α-淀粉酶消化、蛋白酶消化和淀粉葡糖苷酶消化，接着，按照常规方法进行脱盐、浓缩后，定容至25ml。将该处理后的溶液供于以下条件下的hplc，求出其他成分(即，膳食纤维)相对于该处理中的葡萄糖的峰面积比。
[0101]
《hplc条件》色谱柱：将2根tgkgel g2500pwxl(内径7.8mm
×
长度300mm，株式会社东曹制)串联连接洗脱液：超纯水样品糖浓度：0.8质量％柱温：80℃
流速：0.5ml/分钟检测：差示折射率进样量：20μl分析时间：50分钟另外，此处未示出的装置和条件与实验1-2所示的糖组成分析的情况相同。
[0102]
接着，通过通常的葡萄糖氧化酶法对上述得到的各处理液中所含的葡萄糖量(mg)进行定量，将该定量值乘以上述求得的相对于上述处理液中葡萄糖的其他成分(即，膳食纤维)的峰面积比，计算上述处理液中所含的膳食纤维量(mg)，根据该结果和各受试样品的初始的固体成分量(100mg)，求出各受试样品中的膳食纤维含量(质量％)。
[0103]
《实验4-3：结果和考察》将结果示于表4。
[0104]
[表4]受试样品no.238结晶析出性
*1
○○○
热量值(kcal/g-无水固体成分)222膳食纤维含量(质量％)737474*1)
“○”
表示与对照相同，没有观察到结晶析出。
[0105]
如表4所示，受试样品2、3和8与作为对照的含麦芽四糖的糖稀同样地，在上述条件下完全没有晶体析出。予以说明，环状四糖的结晶性高，例如，如专利文献1的实验30所示，在将纯度98质量％的环状四糖制成固体成分浓度为50质量％的水溶液时，容易析出结晶。根据该情况，可以说受试样品2、3和8充分具备糖稀所要求的、即使在制成高浓度水溶液的情况下也不易析出结晶的必要条件。关于热量值，受试样品2、3和8的热量值为2kcal/g、考虑到完全被消化吸收的糖质的热量值为4kcal/g，可以说是充分的低热量(低卡路里)。关于膳食纤维含量，也达到了所期待那样的较高的水平。由以上所述可以确认：受试样品2、3和8是解决了本发明提出的所有课题的含环状四糖的糖组合物。
[0106]
《参考试验：环状四糖的热量换算系数的计算》1.背景和目的由初步评价表明，人体口服摄取的环状四糖未被消化吸收而直达大肠，但之后是否被肠道细菌发酵尚不清楚。这样，未被消化吸收而完全到达大肠的糖质的热量换算系数判明未被消化吸收而被肠道细菌完全发酵，并且，有必要通过与热量换算系数确定的低聚果糖(热量换算系数为2kcal/g)这样的材料相比来定量计算求出发酵性的程度(非专利文献3)。已知当口服摄取被肠内细菌发酵的糖质时，呼气中的氢气有随该摄入量的增加而增加的倾向，因此，例如通过比较通过摄取低聚果糖而在呼气中产生的氢气总量与通过摄取评价对象的糖质而在呼气中产生的氢气总量，求出评价对象的糖质相对于低聚果糖的发酵性程度的百分比，因此通过将低聚果糖的热量换算系数2kcal/g乘以求得的百分比，即可计算出评价对象的热量换算系数。基于以上背景，使用下述材料和方法，计算出环状四糖的热量换算系数。
[0107]
2.材料作为受试物质，使用按照专利文献1记载的方法制备的环状四糖的结晶标准品，作
为对照物质，使用低聚果糖(商品名“meioligo”，株式会社明治制)。
[0108]
3.方法和结果
·
受试者将健康的成年男女共计13名作为受试者。
·
进食、受试物质、对照物质的摄取以及呼气的采集直到试验前一天的晚上9点，所有受试者都吃相同菜单的食物，但不包含膳食纤维和发酵性材料。试验当天早上7点，在确认没有身体不良后，使用下述的呼气采集器具采集自己的最终呼气，然后，在2分钟内摄取将按固体成分换算为5g的受试物质溶解于100ml水而得到的液体。在摄取后经过14小时为止，每隔1小时以同样方式采取最终的呼气。在此期间，每隔3小时提供一次不含膳食纤维和发酵性材料的相同菜单的食物，但摄取与否和摄取量是自由的。至于饮料，始终提供不含膳食纤维和发酵性材料的特定饮品，摄取的时机和摄取量也是自由的，糖的添加也是自由的。在摄取受试物质的试验经过1个月后，使用对照物质代替受试物质，对受试者同样实施摄取和呼气的采集。
[0109]
·
呼气中的氢气浓度的测定呼气的采集使用市售的呼气采集器具(商品名“终末呼气(肺泡气)采取系统”，株式会社呼气生化学营养代谢研究所制)。采集的呼气中的氢气浓度通过市售的呼气气体分析装置(商品名“呼气氢气-甲烷分析装置bga-1000d”，株式会社呼气生化学营养代谢研究所制)测量。
[0110]
·
基于呼气中的氢气浓度测定结果的环状四糖的热量换算系数的估算各受试者的呼气中排出的氢气量通过如下方式评价：在以呼气的采集时刻为横轴、氢气浓度为纵轴的图中，测定对在试验中的各时间点测量的呼气中的气体浓度进行绘制而绘制出的曲线的曲线下面积(area under curve(auc))，由此来评价。求出各受试者中的受试物质的auc相对于对照物质的auc的百分比，并计算其平均值。将该百分比的平均值乘以低聚果糖的热量换算系数2kcal/g，根据将热量换算系数的小数点后第1位四舍五入表示的本领域标准(非专利文献3)来评价该计算值，结果，环状四糖的热量换算系数为0kcal/g。实施例1
[0111]
《含环状四糖的糖稀》
·
实施例1-1作为材料，使用de5、固体成分浓度为20质量％的马铃薯淀粉液化液，加入相对于原料固体成分1g为2.5单位的环状四糖生成酶(来自圆孢芽孢杆菌(bacillus globisporus)(ferm bp-7143)，株式会社林原制)和相对于原料固体成分1g为1.2单位的cgtase(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus)，株式会社林原制)和相对于原料固体成分1g为300单位的异淀粉酶(来自淀粉皮假单胞菌(pseudomonas amyloderamosa)，株式会社林原制)，在ph6.0、50℃下保持48小时，进行环状四糖生成反应。然后，将反应液在95℃下保持30分钟，使反应停止，冷却至常温后，按照常规方法，供于过滤、利用h型和oh型离子交换树脂的脱盐，再用活性炭脱色，用蒸发器浓缩至固体成分浓度为73质量％，得到本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-1)。
[0112]
·
实施例1-2在上述条件下进行环状四糖生成反应，使反应停止后，作为精加工，添加相对于原料固体成分1g为5单位的α-淀粉酶(商品名“neo-spitase pk-6/r”，长濑chemtex株式会社制)，在80℃下反应2小时，然后将反应液在95℃下保持30分钟，使反应停止，除此以外，与上述实施例1-1的含环状四糖的糖稀的制备同样操作，得到本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-2)。
[0113]
·
实施例1-3在环状四糖生成反应中，将环状四糖生成酶的添加量设定为相对于原料固体成分1g为1单位、cgtase的添加量设定为相对于原料固体成分1g为0.5单位、异淀粉酶的添加量设定为相对于原料固体成分1g为250单位，进行环状四糖生成反应，反应停止后，与实施例1-2同样地添加α-淀粉酶，除此以外，与上述实施例1-1的含环状四糖的糖稀的制备同样操作，得到本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-3)。比较例1
[0114]
·
比较例1-1在实施例1-1的含环状四糖的糖稀的制备条件中，省略添加异淀粉酶，取而代之，添加相对于原料固体成分1g为10单位的用于实施例1-2的含环状四糖的糖稀的制备的α-淀粉酶，除此以外，与实施例1-1的情况同样操作，得到本发明范围外的含环状四糖的糖稀(比较例1-1)。
·
比较例1-2在实施例1-1的含环状四糖的糖稀的制备条件中，将异淀粉酶的添加量变更为相对于原料固体成分1g为200单位，在添加环状四糖生成酶时，添加相对于原料固体成分1g为2单位的实施例1-2中使用的α-淀粉酶、以及相对于原料固体成分1g为0.2单位的实验1中使用的葡糖淀粉酶，除此以外，与实施例1-1的情况同样操作，得到本发明范围外的含环状四糖的糖稀(比较例1-2)。
[0115]
对上述实施例1(实施例1-1、1-2和1-3)和比较例1(比较例1-1和1-2)中得到的含环状四糖的糖稀，按照实验1-2中所示的总环状四糖含量分析、糖组成分析、水分活性测定、实验2-2中所示的粘度引起的操作性评价、着色性评价、实验3-1中所示的甲基化分析、中等程度的聚合度的糖质的含量测定、实验4-2中所示的热量值的估算，进行这些分析和评价。将分析和评价的结果与各自的含环状四糖的糖稀的制备方法的概要一起汇总于下述的表5中。
[0116]
[表5]
*1)除了各酵素名称以外，还记载了该酵素的添加时期，其含义如下所述：“从一开始就添加”＝在添加环状四糖生成酶的同时添加“反应完成后添加”＝通过加热反应液而终止环状四糖生成酶的反应后添加数值是指相对于原料的无水固体成分1g的酶添加量(单位)。*2)“dp1 dp2”表示葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖的含量之和“dp4～13”表示除了环状四糖和键合有1分子或2分子葡萄糖的支链环状四糖以外的聚合度为4～13的糖质的含量之和。*3)通过甲基化分析求得的各键合方式的葡萄糖残基的含量中的α-1,4键合的葡萄糖(表中记为“α-1,4”)和α-1,4,6键合的葡萄糖(表中记为“α-1,4,6”)的测定结果
[0117]
得到的实施例1-1至1-3的含环状四糖的糖稀的操作性、着色性均良好。它们具有如下的本发明的糖组合物的特征：总环状四糖含量为38质量％以上，甲基化分析中的α-1,4键合的葡萄糖的含量大于9％且为15％以下，且α-1,4,6键合的葡萄糖的含量小于6％。进而，水分活性和粘度充分低。基于这些特征，得到的实施例1-1至1-3的含环状四糖的糖稀是低着色性且操作性良好的高品质的含环状四糖的糖稀，可以在食品、化妆品、准药品(医药部外品)、药品、饲料、饵料、肥料等用途中广泛利用。予以说明，按照实验4-2中所示的膳食纤维含量的测定，测定实施例1-1至1-3的含环状四糖的糖稀的膳食纤维含量，结果全部为60％以上，这些含环状四糖的糖稀具有膳食纤维性。
[0118]
另一方面，得到的比较例1-1的含环状四糖的糖稀的粘度高达40pa
·
s，操作性差。观察糖组成等构成时，由甲基化分析得到的α-1,4,6键合的葡萄糖的含量为7％，显示出高于本发明的值，这与粘度大和操作性差相对应。另外，比较例1-2的含环状四糖的糖稀虽然在粘度和操作性方面没有问题，但由于含有较多的18质量％的糖组成中的聚合度为1或2的糖质(dp1 dp2)，因此着色性高，达不到本发明的目的。实施例2
[0119]
《含环状四糖的糖组合物》将实施例1得到的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-1)按照常规方法进行喷雾干燥，得到粉末状的本发明的含环状四糖的糖组合物。本品可有利地用作可直接补充膳食纤维的低热量食品。另外，本品可适当地与其他糖质、高甜未度甜味料、脂质、蛋白质、核酸、氨基酸、维生素、表面活性剂、乳化剂、润滑剂、收敛剂、香料、色素等混合，有利地用作食品材料、化妆品材料、准药品(医药部外品)材料、药品材料、饲料材料、饵料材料、肥料材料等。实施例3
[0120]
《含环状四糖的糖组合物的还原物》将实施例1得到的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-2)按照常规方法在镍催化剂的存在下进行加氢反应，反应停止后，按照常规方法精制，调整浓度，得到水溶液形态的本发明的含环状四糖的糖组合物的还原物。本品由于将作为原料的含环状四糖的糖稀中含有的共存糖质转换为糖醇，因此作为更低热量且低着色性的食品材料、准药品(医药部外品)材料、药品材料等是有用的。另外，利用更低的着色性，作为化妆品、皮肤外用的准药品(医药部外品)用的材料尤其有用。实施例4
[0121]
《戚风蛋糕》按照常规方法，混合蛋黄150质量份、砂糖60质量份、牛奶54质量份、色拉油54质量份、低筋面粉126质量份，制备蛋黄面团。另外，按照常规方法将蛋清260质量份、砂糖68质量份和实施例1制备的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-1)56质量份(按固体成分换算为41质量份)混合，制备蛋白酥皮。以尽可能少的搅拌次数将所制备的蛋黄面团和蛋白酥皮混合至均匀，倒入戚风蛋糕用模具中，烘烤至面团出现裂纹且呈浅褐色，得到戚风蛋糕。予以说明，该配方相当于将一般的戚风蛋糕配方中的砂糖量的20％置换为含环状四糖的糖稀的固体成分。
[0122]
得到的戚风蛋糕的口感湿润，甜味温和，风味良好。本品与通常的配方相比，不仅热量低，能够安心地食用，而且由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，因此是可期待维持和增进健康的效果的优质的戚风蛋糕。予以说明，即使将通常配方中的砂糖置换比例提高到40％，口感、味道和风味也均良好。实施例5
[0123]
《乌冬面》按照常规方法，混合水31质量份、食盐4质量份和实施例1制备的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-1)15质量份，使食盐完全溶解。向其中添加中筋面粉100质量份，用20分钟以上充分捏合，制备乌冬面面团。在该状态下放置1小时后，用擀面杖将面团扩展折叠
成(擀成)约3mm厚，然后切成约4mm宽，得到乌冬面。
[0124]
将得到的乌冬面在沸水中煮约15分钟，过冷水后，倒上加热的汤汁，食用时，是一种口感柔软和入喉舒适的优质的乌冬面，风味也良好。本品作为安心、安全的优质的膳食纤维增强用乌冬面是有用的。予以说明，在上述配方中，即使将含环状四糖的糖稀的添加量变更为20质量份，也同样能够得到优质的乌冬面。实施例6
[0125]
《豆沙馅》将水700质量份和砂糖560质量份放入锅中，用明火加热使其完全溶解，然后，一边温和地搅拌将小豆煮沸后充分磨碎得到的生豆沙馅1000质量份一边分3次将它们投入到上述锅中，再用小火继续加热，充分煮干。向其中加入实施例1得到的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-1)320质量份，再继续加热，煮干至brix(按蔗糖换算的固体成分浓度)达到58％，得到豆沙馅。予以说明，该配方相当于将一般豆沙馅的配方中的砂糖量的30％置换为含环状四糖的糖稀的固体成分。
[0126]
得到的豆沙馅呈现丰富的光泽和优雅的甜味。另外，完全未发现在生豆沙馅中减少砂糖使用量时通常观察到的保形性的降低。另外，本品在制造过程中粘度没有明显增加，制造时的操作性也良好。本品的热量比通常的配方低，而且由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，因此不仅能够安心地食用，而且是可期待维持和增进健康的效果的优质的生豆沙馅。进而，也可以通过使用琼脂等使得到的豆沙馅固化而制成羊羹。予以说明，即使将通常配方中的砂糖置换比例提高到70％，口感、味道和风味也均良好。实施例7
[0127]
《橡皮糖》将砂糖100质量份、麦芽糖糖稀(商品名“maltrup”，株式会社林原制)60质量份、实施例1得到的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-1)87质量份、明胶18质量份、水36质量份、50质量％柠檬酸水溶液7.5质量份、香料0.6质量份、适量的着色剂按照常规方法一边混合一边加热，煮干至总量为300质量份、brix为80％，成型，得到橡皮糖。予以说明，该配方是将一般橡皮糖配方中的麦芽糖糖稀的量的60％置换为含环状四糖的糖稀。
[0128]
得到的橡皮糖是色泽完全不逊于没有被含环状四糖的糖稀置换的一般的橡皮糖，而且与一般的橡皮糖相比咀嚼时的回弹力更强、口感更良好、表面不发粘的高品质的橡皮糖。另外，本品在制造过程中粘度没有明显增加，制造时的操作性也良好。本品的热量比通常的配方低，而且由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，因此不仅能够安心地食用，而且是可期待维持和增进健康的效果的高品质的橡皮糖。实施例8
[0129]
《硬糖》通过常规方法，混合砂糖6质量份、麦芽糖糖稀(商品名“maltrup”，株式会社林原制)2质量份、实施例1得到的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-2)2质量份、水10重量份和适量的香料，在155℃下加热而充分煮干、成型，得到硬糖。作为比较对照，代替本发明的含环状四糖的糖稀，使用在酸存在下焙烧淀粉、进行酶消化并除去生成的葡萄糖等而制备的难消化性葡聚糖，进行同样的操作，得到硬糖。
[0130]
上述得到的含有本发明的含环状四糖的糖稀的硬糖呈琥珀色，与此相比，比较对
象的硬糖为深褐色。由该结果可以确认，本发明的含环状四糖的糖稀为低着色性，不会对与其他材料配合并加热而制备的产品的色调产生不良影响。
[0131]
本品的热量比一般的硬糖低，而且由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，因此不仅能够安心地食用，而且是可期待维持和增进健康的效果的高品质的硬糖。实施例9
[0132]
《冰淇淋》按照常规方法，将35％鲜奶油150质量份、脱脂奶粉45质量份、椰子油50质量份、实施例1得到的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-3)266质量份、刺槐豆胶2质量份、蔗糖脂肪酸酯1质量份用小火加热的同时混合至均匀，接着，在常温下剧烈搅拌混合后，在容器中，特别是在-20℃下冷冻，得到冰淇淋。予以说明，该配方是将标准的冰淇淋配方中的果糖/葡萄糖的液体糖全部置换为含环状四糖的糖稀。
[0133]
得到的冰激凌即使经过冷冻3天也不会引起与容器之间形成间隙的所谓的收缩现象，另外，当在冷冻经过7天的时间点从容器中取出观察时，表面极其光滑的方面，在这方面可以说是优质的冰淇淋。另外，本品在制造过程中粘度没有明显增加，制造时的操作性也良好。味道是舒畅而清爽的甜味，口感、风味也良好。本品的热量比通常的配方低，而且由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，因此不仅能够安心地食用，而且是可期待维持和增进健康的效果的优质的冰激凌。实施例10
[0134]
《铜锣烧皮子》在鸡蛋65质量份、砂糖50质量份、实施例1制备的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-1)20质量份(按固体成分计15质量份)、蜂蜜5质量份、料酒2质量份中加入20质量份水，充分混合，向其中加入溶解于2质量份水的小苏打0.6质量份、过筛的小麦粉63质量份，制成面团。将面团静置大约1小时后，在铁板上烘烤，得到铜锣烧皮子(铜锣烧皮)。
[0135]
得到的铜锣烧皮子是喧腾腾的，具有优质的甜味。本品的热量比通常的配方低，而且由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，因此不仅能够安心地食用，而且是可期待维持和增进健康的效果的高品质的铜锣烧皮子。进而，通过夹入实施例6中得到的豆沙馅，可以制成在皮和馅两者均含有膳食纤维的高品质的铜锣烧。实施例11
[0136]
《红糖馒头》将鸡蛋60质量份、红糖180质量份、实施例1制备的含环状四糖的糖稀(实施例1-2)140质量份(按固体成分计102质量份)、水160质量份混合，制成混合物，在水浴中加热至30℃左右。向加热后的上述混合物中混合低筋面粉200质量份和过筛的isupata(发酵粉)5质量份，再加入太白芝麻油30质量份，充分混合。将得到的面团倒入模具中，蒸20分钟，得到红糖馒头。
[0137]
得到的红糖馒头是喧腾腾的、蓬松的、具有优质甜味、且具有良好的口感和味道的红糖馒头。本红糖馒头由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，因此还可期待增进健康的效果。实施例12
[0138]
《橘子果冻》
将砂糖200质量份、κ-角叉菜胶2.5质量份、刺槐豆胶2.5质量份、柠檬酸钠2.5质量份、氯化钾1质量份、乙酰舒泛钾0.2质量份充分混合，以不结块的方式添加到装有650质量份水的锅中。向其中加入实施例1制备的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-3)140质量份(按固体成分计102质量份)后煮干，蒸发水分至800质量份。然后，冷却至70℃左右，加入200质量份橙汁和适量的橙子香精，使用50％柠檬酸水溶液调整ph至3.2～4.0的范围内。将该溶液填充入果冻杯中，在冰箱中静置直至其凝固，得到橘子果冻。
[0139]
得到的果冻由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，而且保形性高，具有顺滑的口感和舒畅的甜味。予以说明，即使将胶凝剂替换为明胶、黄原胶、琼脂、果胶等，也没有观察到水分脱离，可以制成具有良好口感的果冻。实施例13
[0140]
《曲奇》将100质量份无盐黄油在热水中融化，向其中加入过筛的砂糖40质量份和低筋面粉170质量份混合。向其中加入蛋黄20质量份和实施例1制备的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-1)50质量份，进一步混合，完成面团。将完成的面团放入冰箱中，成型后在烤箱中烘烤，得到曲奇。
[0141]
得到的曲奇具有松脆的口感，而且由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，因此是有助于健康的曲奇。进而，通过添加维生素类、矿物质类、蛋白粉等，可以制成能够补充营养的曲奇。实施例14
[0142]
《碳酸饮料》将实施例1制备的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-2)60质量份、果糖葡萄糖液态糖20质量份、乙酰舒泛钾0.1质量份、三氯蔗糖0.02质量份、柠檬酸2质量份、柠檬酸钠0.5质量份与水170质量份混合，充分搅拌至溶解。向其中加入适量的柠檬香精，充分搅拌后，加入碳酸水750质量份，得到碳酸饮料。
[0143]
得到的碳酸饮料由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，且是低热量的，并且是兼具清爽的甜味和良好的身体感觉的碳酸饮料。予以说明，在上述配方中，即使在没有果糖葡萄糖液态糖而将本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-2)增加至140质量份的配方(水为90质量份)中，也不产生异味和异臭，可制成兼具良好的甜味和良好的体感的容易饮用的碳酸饮料。相反，在上述配方中，在将本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-2)减少至20质量份而将用以补充甜味的乙酰舒泛钾增加至0.15质量份的配方中，尽管固体成分少，可以制成具有良好的身体感觉的碳酸饮料。实施例15
[0144]
《chuhai(一种烧酒)》将实施例1制备的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-3)40质量份、乙酰舒泛钾0.1质量份、三氯蔗糖0.02质量份、柠檬酸4质量份、柠檬酸钠1质量份与含有50％(v/v)醇的蜗杆(一甲威士忌蒸馏有限公司制，wilkinson vodka 50
°
)170质量份混合，充分搅拌至溶解。向其中加入适量的柠檬香精，充分搅拌后，加入碳酸水750质量份，得到chuhai(一种烧酒)。
[0145]
得到的chuhai(一种烧酒)是酒精为9％的高酒精度数的chuhai(一种烧酒)，并且
是不会感觉到酒精的刺激性气味和味道的容易饮用的chuhai(一种烧酒)。另外，尽管不含砂糖，但是是具有强的身体感觉且具有饮用感的chuhai(一种烧酒)。予以说明，即使在将本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-3)减少至10质量份的配方(用碳酸水补充减少的量)中，也可以制成不会感觉到酒精的刺激性气味且具有身体感觉的chuhai(一种烧酒)。实施例16
[0146]
《罐装咖啡》将烘焙至l值(用色差计测定的咖啡豆的亮度)为18的阿拉比卡咖啡豆100质量份粉碎，用热水提取。向调整至brix为2的咖啡豆提取液500质量份中加入鲜奶150质量份、实施例1制备的本发明的含环状四糖的糖稀(实施例1-1)150质量份、水200质量份、适量的乳化剂和香料，进行均质化处理。对得到的均质液调整ph，然后装罐，蒸煮杀菌，得到罐装咖啡。
[0147]
得到的罐装咖啡由于配合了含环状四糖的糖稀，因此含有膳食纤维，不产生异味异臭，是舒畅的容易饮用的罐装咖啡。膳食纤维量可通过调整含环状四糖的糖稀的添加量来任意调整，甜味可以用砂糖或人工甜味料来调整。产业实用性
[0148]
如上所述，本发明提供即使在制成比较高浓度的糖质水溶液(糖稀)的情况下，粘度和水分活性也充分低，且为充分低着色性且低热量，在保存中不易析出糖结晶的高品质的含环状四糖的糖稀，对以往虽然在物性和功能性方面寄予厚望但尚未成功实用化的环状四糖的实用化做出了贡献，可以说本发明的含环状四糖的糖稀是在食品、化妆品、准药品(医药部外品)、药品、饲料、饵料、肥料等用途中能够广泛利用的产业上的利用价值非常高的发明。