一种TiO2缺陷调控的DNA甲基化光电检测方法

一种tio2缺陷调控的dna甲基化光电检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种tio2缺陷调控的dna甲基化光电检测方法，属于dna甲基化检测技术领域。


背景技术：

2.dna甲基化是哺乳动物生长和发育过程中不可缺少的表观遗传修饰之一，其参与多种生理过程，包括基因印记、基因沉默、x染色体失活、疾病的发生等。在哺乳动物中，dna的甲基化反应主要是指dna的两个核苷酸cg中的胞嘧啶在dna甲基转移酶的催化作用下被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶(5mc)。众多研究表明，细胞dna甲基化的异常状态与肿瘤的发生、发展密切相关。
3.近些年来，随着dna甲基化研究的不断深入，出现了各种各样的dna甲基化检测方法。然而由于5-甲基胞嘧啶上甲基基团很小，dna甲基化检测的研究难度较大，早期开发的检测方法都存在着一定的缺陷。因此，研究工作者研发出各种各样的新型检测方法，如pcr法、荧光法、单分子实时测序法、质谱法、电化学方法等。
4.光电化学检测方法是近几年建立起来的一种利用物质的光电转换特性进行检测的新型分析方法，它具有设备简单、灵敏度高、易于微型化等特点，可以应用于dna甲基化检测。光电化学检测方法应用于dna甲基化检测时，由于dna甲基修饰本身很难产生独特的光电化学信号，需借助通过嵌入或标记的形式引入可提供光电响应的信号源，例如嵌入剂、半导体纳米粒子等，更多的方法需要同时辅助甲基转移酶的作用实现检测dna甲基化的检测。其操作繁琐，不够简单和快速。
5.因此，开发简单、快速、灵敏的dna甲基化检测方法仍是目前亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种tio2缺陷调控的dna甲基化光电检测方法，可以有效解决上述问题。
7.本发明是这样实现的：
8.一种tio2缺陷调控的dna甲基化光电检测方法，包括以下步骤：
9.s1，以zno纳米棒阵列电极为模板，在同时含锌和钛的前驱体溶液中多次液相沉积得到锌掺杂的表面氧空位浓度可控的tio
2-x
纳米管阵列电极；
10.s2，以edac(碳二亚胺)为偶联剂，苯并三氮唑(bt)为反应中间体，使二羟基苯甲酸(pca)和一端修饰氨基的捕获探针ssdna发生反应形成酰胺键得ssdna-pca分子；
11.s3，将tio
2-x
纳米管阵列电极浸入已经制备好的ssdna-pca分子的溶液中，室温下进行组装反应，形成ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极；
12.s4，将dna甲基化样品变性，加入亚硫酸氢钠对dna甲基化样品进行前处理；
13.s5，将组装好的ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极浸入经过亚硫酸氢钠前处理后的dna甲基化样品溶液中，在室温下杂交，得到满单层组装的5mc-dna-pca/tio
2-x
纳米管阵
列电极；以5mc-dna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极为工作电极，进行暂态光电流测试。
14.作为进一步改进的，在步骤s1中，所述zno纳米棒阵列电极采用恒电流阴极还原法制备。
15.作为进一步改进的，在步骤s1中，所述tio
2-x
纳米管阵列电极的制备具体为：在室温条件下将制备好的zno纳米棒阵列电极浸入含有氟钛酸铵和硼酸的溶液中，同时加入硝酸锌溶液调控其缺陷浓度，液相共沉积得到tio2纳米管阵列前驱体电极；将得到的tio2纳米管阵列前驱体电极在氮气或氩气氛中热处理；如此反复操作多次后得到锌掺杂的表面氧空位浓度可控的tio
2-x
纳米管阵列电极。
16.作为进一步改进的，步骤s2具体为：将二羟基苯甲酸(pca)溶解于乙腈溶液中，充分溶解后加入1,2,3-苯并三氮唑(bt)和碳二亚胺(edac)，在常温下避光搅拌反应，分离纯化得到淡黄色的pca-bt固体；将pca-bt固体溶解于乙腈溶液中，加入一端修饰氨基的捕获探针ssdna溶液，在常温下反应；分离纯化得到末端修饰pca的捕获探针ssdna组装分子，即ssdna-pca分子。
17.作为进一步改进的，在步骤s3中，所述组装反应后，电极还在pca溶液中再次进行组装反应。
18.作为进一步改进的，步骤s4具体为：取dna甲基化样品，加入naoh溶液，混匀后水浴反应，使dna完全变性；在水浴反应完成后，往dna混合液中加入对苯二酚，待溶液变成黄色后往dna混合液中继续加入亚硫酸氢钠溶液，混合均匀后避光；离心后取沉淀进行水浴反应；将样品纯化后，加入超纯水保存备用。
19.作为进一步改进的，在步骤s5中，杂交后的电极还需清洗后在经过亚硫酸氢钠处理的没有甲基化的与捕获探针ssdna互补的dna样品中继续杂交以扣除信号背景。
20.作为进一步改进的，步骤s5中，所述暂态光电流测试的对电极为铂丝，参比电极为饱和甘汞电极，电解质溶液为磷酸缓冲液，激发光波长为360nm，外加电压为0.2v(vs.sce)。
21.一种ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极的制备方法，包括以下步骤：
22.s1，以zno纳米棒阵列电极为模板，在同时含锌和钛的前驱体溶液中多次液相沉积得到锌掺杂的表面氧空位浓度可控的tio
2-x
纳米管阵列电极；
23.s2，以edac(碳二亚胺)为偶联剂，苯并三氮唑(bt)为反应中间体，使二羟基苯甲酸(pca)和一端修饰氨基的捕获探针ssdna发生反应形成酰胺键得ssdna-pca分子；
24.s3，将tio
2-x
纳米管阵列电极浸入已经制备好的ssdna-pca分子的溶液中，室温下进行组装反应，形成ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极。
25.一种上述的方法制备的ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极。
26.本发明的有益效果是：
27.本发明的tio2缺陷调控的dna甲基化光电检测方法中，在tio2合成过程中利用锌掺杂形成tio2氧空位缺陷调控tio2表面能级，同时结合亚硫酸盐对dna中5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶的特异性转化反应，构建dna/tio
2-x
的光电测试体系，适用于dna甲基化检测。该检测方法无需电化学标记，操作简单快捷。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用
的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
29.图1是本发明实施例提供的dna及甲基化光电传感器设计原理图。
30.图2是本发明实施例提供的利用亚硫酸氢钠转化法辅助dna甲基化检测的示意图。
31.图3是本发明实施例提供的tio
2-x
纳米管的形貌及结构表征。a：tem图；b：hrtem图；c：sead图；d：eds图。
32.图4是本发明实施例提供的对照样品dna-pca/tio2光电体系的暂态光电流响应。激发光波长360nm，暂态光电流应用电压0.2v(vs.sce)。
33.图5是本发明实施例提供的dna-pca/tio
2-x
光电体系的暂态光电流响应。激发光波长360nm，暂态光电流应用电压0.2v(vs.sce)。
34.图6是本发明实施例提供的对照样品dna-pca/tio2光电体系用于dna甲基化检测的暂态光电流响应。激发光波长360nm，暂态光电流应用电压0.2v(vs.sce)。
35.图7是本发明实施例提供的dna-pca/tio
2-x
光电体系用于dna甲基化检测的暂态光电流响应。激发光波长360nm，暂态光电流应用电压0.2v(vs.sce)。
36.图8是本发明实施例提供的dna-pca/tio
2-x
光电体系用于dna甲基化检测的标准曲线。
具体实施方式
37.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
38.在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
39.本发明实施例提供一种tio2缺陷调控的dna甲基化光电检测方法，包括以下步骤：
40.s1，以zno纳米棒阵列电极为模板，在同时含锌和钛的前驱体溶液中多次液相沉积得到锌掺杂的表面氧空位浓度可控的tio
2-x
纳米管阵列电极。其中，所述zno纳米棒阵列电极采用恒电流阴极还原法制备。所述tio
2-x
纳米管阵列电极的制备具体为：在室温条件下将制备好的zno纳米棒阵列电极浸入含有氟钛酸铵和硼酸的溶液中，同时加入硝酸锌溶液调控其缺陷浓度，液相共沉积得到tio2纳米管阵列前驱体电极；将得到的tio2纳米管阵列前驱体电极在氮气或氩气氛中热处理；如此反复操作多次后得到锌掺杂的表面氧空位浓度可控的tio
2-x
纳米管阵列电极。
41.s2，以edac(碳二亚胺)为偶联剂，苯并三氮唑(bt)为反应中间体，使二羟基苯甲酸(pca)和一端修饰氨基的捕获探针ssdna发生反应形成酰胺键得ssdna-pca分子。具体为：将二羟基苯甲酸(pca)溶解于乙腈溶液中，充分溶解后加入1,2,3-苯并三氮唑(bt)和碳二亚胺(edac)，在常温下避光搅拌反应，分离纯化得到淡黄色的pca-bt固体；将pca-bt固体溶解于乙腈溶液中，加入一端修饰氨基的捕获探针ssdna溶液，在常温下反应；分离纯化得到末端修饰pca的捕获探针ssdna组装分子，即ssdna-pca分子。
42.s3，将tio
2-x
纳米管阵列电极浸入已经制备好的ssdna-pca分子的溶液中，室温下进行组装反应，形成ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极。所述组装反应后，电极还在pca溶液中再次进行组装反应。由于tio
2-x
纳米管阵列电极表面的缺陷、dna在其上的特异性吸附及空间位阻，ssdna-pca在tio
2-x
纳米管阵列电极表面的组装层存在一定程度的缺陷。为此选用pca进行再次组装，填充ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极表面组装层的缺陷位点。本发明实施例利用3,4-二羟基苯甲酸(pca)临近的两个羟基基团与tio
2-x
表面的ti原子形成二齿螯合物，将与pca形成酰胺键的dna共价固定到tio
2-x
表面。
43.s4，将dna甲基化样品变性，加入亚硫酸氢钠对dna甲基化样品进行前处理。具体为：取dna甲基化样品，加入naoh溶液，混匀后水浴反应，使dna完全变性；在水浴反应完成后，往dna混合液中加入对苯二酚，待溶液变成黄色后往dna混合液中继续加入亚硫酸氢钠溶液，混合均匀后避光；离心后取沉淀进行水浴反应；将样品纯化后，加入超纯水保存备用。通过亚硫酸氢钠对待测甲基化dna样品进行前处理，由于非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶造成了非甲基化dna杂交双链中碱基堆积的混乱，从而影响了电极界面电子传递过程并表现为光电响应信号的差异，由此建立dna甲基化检测的光电检测方法。
44.s5，将组装好的ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极浸入经过亚硫酸氢钠前处理后的dna甲基化样品溶液中，在室温下杂交，得到满单层组装的5mc-dna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极。杂交后的电极还需清洗后在经过亚硫酸氢钠处理的没有甲基化的与捕获探针ssdna互补的dna样品中继续杂交以扣除信号背景。由于杂交引起的dna构象及空间取向上的变化使得杂交后电极表面的组装层容易出现缺陷。因此将杂交后得到的电极用缓冲液洗净后置于pca溶液中再次进行组装。以5mc-dna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极为工作电极，进行暂态光电流测试。其中，所述暂态光电流测试的对电极为铂丝，参比电极为饱和甘汞电极，电解质溶液为磷酸缓冲液，激发光波长为360nm，外加电压为0.2v(vs.sce)。
45.在dna-pca/tio
2-x
的光电体系中，由于存在较高浓度的表面缺陷导致tio2能级变化，使得体系对不同序列及匹配情况的dna分子具有不同的光电化学响应。本发明直接利用dna链中碱基对的电子传递性能的差异作为区别信号构建dna光电检测体系。该方法无需电化学标记，实现了对dna甲基化的简单、灵敏、快速的检测。
46.本发明实施例还提供一种ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极的制备方法，包括以下步骤：
47.s1，以zno纳米棒阵列电极为模板，在同时含锌和钛的前驱体溶液中多次液相沉积得到锌掺杂的表面氧空位浓度可控的tio
2-x
纳米管阵列电极；其中，所述zno纳米棒阵列电极采用恒电流阴极还原法制备。
48.s2，以edac(碳二亚胺)为偶联剂，苯并三氮唑(bt)为反应中间体，使二羟基苯甲酸(pca)和一端修饰氨基的捕获探针ssdna发生反应形成酰胺键得ssdna-pca分子。
49.s3，将tio
2-x
纳米管阵列电极浸入已经制备好的ssdna-pca分子的溶液中，室温下进行组装反应，形成ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极。所述组装反应后，电极还在pca溶液中再次进行组装反应，以填充ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极表面组装层的缺陷位点。
50.本发明是实施例还提供一种上述的方法制备的ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极。应用该ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极可以实现对dna甲基化的简单、灵敏、快速的检测。
51.实施例
52.(1)氧空位缺陷tio2纳米管阵列电极的制备(tio
2-x
)
53.采用恒电流阴极还原法制备zno纳米棒阵列电极，即采用两电极体系，以导电玻璃为工作电极，铂片为对电极，0.25ma/mm2的阴极工作电流电沉积制备zno纳米棒阵列。电解液均为等摩尔浓度(5mm)的硝酸锌(zn(no3)2)和六次甲基四胺(c6h
12
n4)水溶液。沉积温度控制在90℃，沉积时间30min。制备得到的zno纳米棒阵列电极用纯水淋洗除去表面残留的盐后，在氧气氛中400℃条件下热处理3h。
54.利用锌掺杂制备表面氧空位浓度可控的tio2纳米管阵列电极(tio
2-x
)是以上述热处理后zno纳米棒阵列电极为模板，多次液相沉积制备得到，即室温条件下将制备好的zno纳米棒阵列电极浸入50mm氟钛酸铵，150mm硼酸溶液中，同时加入10mm硝酸锌溶液调控其缺陷浓度，液相共沉积40min得到tio2纳米管阵列前驱体电极；将得到的纳米管阵列电极在氮气或氩气氛中于400℃下热处理3h；再次将电极浸入50mm氟钛酸铵，150mm硼酸，10mm硝酸锌溶液中液相沉积40min，在氮气或氩气氛中于400℃下热处理3h。如此反复液相沉积3次后得到锌掺杂的表面氧空位浓度可控的tio2纳米管阵列电极(tio
2-x
)。
55.(2)对照样tio2纳米管阵列电极的制备
56.采用恒电流阴极还原法制备zno纳米棒阵列电极，制备方法同上。
57.将制备好的zno纳米棒阵列电极浸入50mm氟钛酸铵，150mm硼酸溶液中，液相共沉积120min得到tio2纳米管阵列前驱体电极，将得到的纳米管阵列电极在1m hcl中浸泡4h，用纯水洗净后，在氧气氛中于400℃下热处理3h得到tio2纳米管阵列电极。
58.该方法制备得到的tio2纳米管通过eds表征可得ti:o＝1:2，样品中不含有zn。通过xrd表征，样品为纯锐钛矿晶型。
59.(3)dna-pca/tio
2-x
光电化学分析体系的构建
60.(a)dna-pca分子的制备：
61.以edac(碳二亚胺)为偶联剂，苯并三氮唑(bt)为反应中间体，使二羟基苯甲酸(pca)分子上的羧基和dna一端修饰的氨基发生反应形成酰胺键得到用于电极组装的dna-pca分子。具体反应过程如下：将5mm二羟基苯甲酸(pca)溶解于50ml乙腈溶液中，充分溶解后加入5mm的1,2,3-苯并三氮唑(bt)，5mm碳二亚胺(edac)，该反应混合物在常温下避光搅拌反应2天。反应完成后，将150ml二氯甲烷溶液加入反应的混合溶液中，混合完全后静置分层。取下层二氯甲烷溶液依次用饱和nahco3溶液，饱和nacl溶液进行萃取纯化后，经旋转蒸发得到淡黄色的pca-bt固体。将25mm的pca-bt溶解于1ml乙腈溶液中，加入500μl 25μm一端修饰氨基的捕获探针ssdna溶液(5
’‑
nh
2-aaaagagagag agagaggg-3’)，置于25℃摇床中反应2天。反应后的溶液加入二氯甲烷萃取未反应完全的pca-bt酯，再加入乙酸乙酯萃取水溶液中溶解的乙腈，最后得到末端修饰pca的捕获探针ssdna组装分子。制备得到的ssdna-pca
组装分子用tris缓冲液(10mm tris-hcl，10mm nacl，ph 7.0)稀释至5μm，于-20℃条件下保存待用。
62.(b)dna-pca/tio
2-x
、pca/tio
2-x
纳米管阵列电极的组装：
63.pca/tio
2-x
纳米管阵列电极的组装：将10mm的pca溶解在tris缓冲液(10mm tris-hcl，10mm nacl，ph 7.0)中，随后将已经制备好的tio
2-x
纳米管阵列电极浸入新制备好的pca溶液中，室温下组装24h得到pca/tio
2-x
纳米管阵列电极。制备得到的pca/tio
2-x
纳米管阵列电极置于tris缓冲液(10mm tris-hcl，10mm nacl，ph 7.0)中保存待测。
64.ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极的组装：将tio
2-x
纳米管阵列电极浸入已经制备好的ssdna-pca溶液中，室温下组装24h。由于tio
2-x
纳米管阵列电极表面的缺陷、dna在其上的特异性吸附及空间位阻，ssdna-pca在tio
2-x
纳米管阵列电极表面的组装层存在一定程度的缺陷。为此选用pca填充ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极表面组装层的缺陷位点，即将组装后的电极在新制备的10mm的pca溶液中再次组装24h，以形成tio
2-x
纳米管阵列电极表面满单层组装。
65.dsdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极的制备：将组装好ssdna-pca(5
’‑
pca-aaaagagagag agagaggg-3’)的tio
2-x
纳米管阵列电极浸入500μl 5μm与捕获探针ssdna匹配的dna靶标分子(3
’‑
ttttctctctctc tctccc-5’)溶液中，在25℃下杂交2h。由于杂交引起的dna构象及空间取向上的变化使得杂交后电极表面的组装层容易出现缺陷。因此，将杂交后得到的电极用缓冲液洗净后置于新制备的10mm的pca溶液中再次组装24h，得到满单层组装的dsdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极。制备好的电极用超纯水洗净后置于缓冲液(10mm tris-hcl，10mm nacl，ph 7.0)中保存。
66.(c)dna-pca/tio
2-x
光电分析体系测试方法的建立：
67.为了构建无标记的、简单、灵敏、快速的dna检测光电传感体系，本发明直接利用dna链中碱基对的电子传递性能的差异作为区别信号构建dna光电检测体系。其测试原理如图1所示。在dna-pca/tio
2-x
的光电体系中，由于存在较高浓度的表面缺陷导致tio2能级变化，使得体系对不同序列及匹配情况的dna分子具有不同的光电化学响应。实验方法为：采用三电极体系，以dna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，0.1m磷酸缓冲液(ph 7.0)为电解质溶液，激发光波长为360nm，外加电压为0.2v(vs.sce),测试暂态光电流。
68.(d)dna-pca/tio2光电化学分析体系的构建，除电极材料采用tio2纳米管电极外，其余同dna-pca/tio
2-x
光电分析体系测试方法的建立。
69.(4)dna甲基化光电检测方法的建立
70.本发明在构建无标记dna-pca/tio
2-x
的光电测试体系的基础上，结合亚硫酸盐对dna中5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶的特异性转化反应(原理如图2所示)，构建适用于dna甲基化检测的光电检测方法。通过亚硫酸氢钠对待测甲基化dna样品进行前处理，由于非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶造成了非甲基化dna杂交双链中碱基堆积的混乱，从而影响了电极界面电子传递过程并表现为光电响应信号的差异，由此建立dna甲基化检测的光电检测方法。
71.(a)亚硫酸氢钠处理dna甲基化样品的具体实验方法：取5μl 10μm的dna样品稀释至50μl，加入5.5μl新配置的naoh溶液，震荡混匀后放置于42℃的水浴锅中反应30min，使dna完全变性；在水浴反应完成后，往dna混合液中加入30μl 10mm的对苯二酚(蒽醌)，待溶
液变成黄色后往dna混合液中继续加入新配置的520μl 3.6m的亚硫酸氢钠，混合均匀后以锡箔纸包裹避光；离心后置于50℃水浴中16h；将样品除盐后离心浓缩，加入20μl超纯水保存。
72.(b)dna甲基化光电检测方法：
73.tio
2-x
纳米管阵列电极制备以及ssdna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极的组装，同上所述。
74.将组装好ssdna-pca的tio
2-x
纳米管阵列电极浸入500μl经过亚硫酸氢钠处理后的dna甲基化样品溶液中(3
’‑
tttt(5mct)6ccc-5’)，在25℃下杂交2h。杂交后的测试电极清洗后须继续在经过亚硫酸氢钠处理的没有甲基化的与捕获探针ssdna互补的dna的样品中继续杂交2个小时以扣除信号背景。由于杂交引起的dna构象及空间取向上的变化使得杂交后电极表面的组装层容易出现缺陷。因此将杂交后得到的电极用缓冲液洗净后置于新制备的10mm的pca溶液中再次组装24h，得到满单层组装的5mc-dna-pca/tio
2-x
纳米管阵列电极。制备好的电极用超纯水洗净后置于缓冲液(10mm tris-hcl，10mm nacl，ph 7.0)中保存。对捕获了经过亚硫酸氢钠处理后甲基化的靶标dna样品复合体系进行暂态光电流测试(测试方法如上所述)。由于暂态光电流法测试复合体系可在几秒的时间内完成，利用该特点可建立适用于dna甲基化无标记的快速光电检测方法。
75.dna-pca/tio2光电体系dna甲基化光电检测方法，除电极材料采用tio2纳米管电极外，其余同dna-pca/tio
2-x
光电体系。
76.实验结果：
77.(1)tio
2-x
纳米管阵列的形貌及结构表征
78.图3为tio
2-x
纳米管的形貌及结构表征。从图3a的tem表征可以看出，制备得到的tio
2-x
为中空的纳米管状；通过数据统计可以得到其内径为86.2
±
19.7nm，管壁厚度为81.0
±
19.8nm。从hrtem图(图3b)可以看出，制备得到的tio
2-x
纳米管是由许多10nm左右的tio
2-x
纳米粒子堆积而成。通过选区电子衍射sead表征(图3c)发现，该方法制备得到的tio
2-x
为多晶结构。采用eds对制备得到的tio
2-x
纳米管进行了表征分析可知，制备得到的tio
2-x
纳米管中ti:o明显低于1:2，氧空位较多，掺杂的zn与ti原子的比例约为ti:zn＝13:1。此外，对tio
2-x
纳米管进行xrd表征，检测结果可判断该方法制备得到的tio
2-x
纳米管为锐钛矿型，并未观察到其他物种或晶型的衍射峰，可见该方法制备得到的tio
2-x
晶型纯度较高。
79.(2)dna-pca/tio2光电分析检测
80.图4为对照样品dna-pca/tio2光电体系的暂态光电流响应，其中激发光波长360nm，暂态光电流应用电压0.2v(vs.sce)。从图中可以看出，该合成方法制备得到的tio2纳米管具有较好的光电响应性能。当组装上pca、dna-pca分子后，组装分子在tio2纳米管表面形成了较为紧密的分子层，使得tio2纳米管的光电响应显著降低。其中，pca分子作为tio2纳米管与dna分子之间的连接分子，对tio2纳米管的光电响应起了重要的影响作用。当组装pca分子后，tio2纳米管的光电响应出现明显降低，说明pca分子在tio2纳米管表面电子传递过程中主要起电子递体的作用；其不同于敏化染料分子，对tio2电子传递过程并不起敏化作用。当pca分子一段连接dna分子后，由于dna分子组装层对对tio2电子传递过程阻挡作用，使得对tio2电子传递必须经过dna分子而出现了不同程度的减小。dsdna-pca/tio2纳米体系的光电响应信号低于ssdna-pca/tio2纳米体系，其主要原因在于：(1)由于ssdna链上
的碱基全部暴露在溶液中，而dsdna链上的碱基则包埋于dna双螺旋中，这使得ssdna比dsdna更容易被氧化；(2)对满单层组装，由于dsdna分子的刚性结构使得dsdna分子所形成的组装层厚度大于具有较好柔韧性的ssdna形成的组装层，这使得dsdna-pca/tio2纳米体系中pca分子的电子传递过程较ssdna-pca/tio2纳米体系困难。然而，尽管在dna-pca/tio2光电体系中，ssdna和dsdna表现出信号上的差异，但对于分析测试方法的建立来说，其灵敏度过低。
81.(3)锌掺杂的氧空位tio
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体系对dna的光电响应
82.图5为dna-pca/tio
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光电体系的暂态光电流响应，其中激发光波长360nm，暂态光电流应用电压0.2v(vs.sce)。从图中可以看出，由于具有较高浓度的锌掺杂和氧空位，tio
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光电响应信号明显降低。组装pca分子后，tio
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光电响应信号同tio2体系出现明显降低。然而组装ssdna后体系的光电响应信号没有出现明显变化，说明体系中tio
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表面能级发生了变化，使得ssdna中易氧化的碱基在tio
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光电传输过程中起到了有效协助光生电子空穴分离或传输的作用。当组装dsdna分子后，由于dsdna分子明显较厚的组装层阻碍了tio
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光电传输过程，使得体系的光电响应信号出现明显下降。该变化使得dna-pca/tio
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光电体系对dna序列和碱基堆积的变化具有更高的灵敏度，有望用于dna的检测中。
83.(4)dna-pca/tio2光电体系检测dna甲基化
84.图6为对照样品dna-pca/tio2光电体系用于dna甲基化检测的暂态光电流响应，其中激发光波长360nm，暂态光电流应用电压0.2v(vs.sce)。从图中可以看出，dna-pca/tio2光电体系用于dna甲基化检测时，虽然甲基化的dna和非甲基化dna在一定程度上的存在光电响应信号的差异，但是其有效检出区间较小。由此说明，dna-pca/tio2光电体系的电子传输过程与dna双链的碱基堆积情况相关性较小，该体系难以用于dna甲基化的有效检测。
85.(5)锌掺杂的氧空位tio
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光电分析检测dna甲基化
86.图7为dna-pca/tio
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光电体系用于dna甲基化检测的暂态光电流响应，其中激发光波长360nm，暂态光电流应用电压0.2v(vs.sce)。从图中可以看出，dna-pca/tio
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光电体系用于dna甲基化检测时存在较大的有效的检出区间，5mc-dna的光电响应信号与c-dna存在较大差异。这是由于在该dsdna-pca/tio
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光电体系中，5mc-dsdna虽然起到阻碍tio
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光电传输过程的作用，但是tio
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表面缺陷诱导的表面能级变化使得在亚硫酸氢钠处理后仍具有匹配双链的5mc-dsdna在电子传输过程中仍同时起到积极的协助tio
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光生电子空穴分离和传输的作用。而没有甲基化的靶标dna分子在经过亚硫酸氢钠处理，c转变为u，使得靶标dna在杂交过程中出现碱基堆积混乱，难以协助tio
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光生电子空穴分离和传输，在tio
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光电传输过程中主要起阻碍作用。由此，具有完整的匹配的甲基化的靶标dna分子使dsdna-pca/tio
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光电体系具有更好的响应性能；而没有甲基化的靶标dna在亚硫酸氢钠处理后由于双链碱基堆积混乱使得电荷传输性能较差，光电响应明显减弱。因此在该体系中，甲基化与非甲基化的靶标dna信号能够有效区分并具有较宽的检出信号区间，可用于dna甲基化的有效检出。
87.(6)锌掺杂的氧空位tio
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光电分析检测dna甲基化的标准曲线
88.图8为dna-pca/tio
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光电体系用于dna甲基化检测的标准曲线。从图中可以看出，本发明提供的dna甲基化的光电检测方法具有较宽的线性检出范围10-11-10-7
m，检出限为10pm。在该测试浓度区间，体系的光电流响应信号与甲基化的靶标dna的浓度之间呈现线性
关系，其线性曲线为y＝1.702x 21.098，相关系数为r2＝0.9909。
89.以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。