一种检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境DNA的方法

一种检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境dna的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境dna的方法。


背景技术：

2.霓虹脂鲤属paracheirodon，是鲤形目cypriniformes，脂鲤亚目characoidei，脂鲤科characidae下的一属，本属下仅有三种，分别是霓虹脂鲤paracheirodon innesi、阿氏霓虹脂鲤paracheirodon axelrodi和类霓虹脂鲤paracheirodon simulans。原分布于南美洲，由于躯体细小、色彩华丽、性情温顺、容易饲养、好集群游动，深受世界各地观赏鱼市场的青睐。上个世纪中后期被引入国内，现在在全国范围内是高度商业化的重要的观赏鱼类。
3.霓虹脂鲤属下鱼类可以在观赏鱼市场上随意买卖，数量也极多。故难免会存在逃逸或者被人为放生，进入野生环境的情况。虽然普遍认为，在中国的野生环境中，该属下各种生存，繁殖较困难。但考虑到很多南美鱼类如多辐翼甲鲶pterygoplichthys multiradiatus、图丽鱼astronotus ocellatus、短盖肥脂鲤piaractus brachypomus都在我国华南地区有过发现。故在我国的华南地区很有可能存在适宜该属下物种生存的水生环境。虽然暂时并没有关于霓虹脂鲤属下的鱼类入侵我国的报道，但在东南亚的一些国家，已经存在一些该属鱼类的野生种群。
4.在往常的实践中，传统的水生生物入侵监测方法，如拖网、围网、电捕鱼、钓鱼和目视等方法，具有高成本、低捕获率、耗时长、难实施、可能会破坏调查点的生态系统等缺点。不能大面积实施，也不够敏感。若使用传统的生物入侵监测方法，往往要到暴发阶段后才能发现入侵物种种群。此时再进行治理，往往效果较差。只有在物种入侵的初期就能确定其分布，才能尽早治理，有效治理。故建立快速、高效、敏感的生物入侵监测方法是刻不容缓的。
5.动物在某个环境中生活，身上的各种痕迹会携带着自身dna掉落到四周。这些在环境样品中所有被发现的不同生物的基因组dna的混合被称为环境dna(edna，environmental dna)。环境dna环境样品是一个非常宽松的概念，可以包括土壤、沉积物、排泄物、空气、水体，甚至生物个体本身。环境dna分析是最近开发的一种灵敏、高效且对生物无损伤的调查工具。目的就是获取这些环境样品中dna所属物种的分类学信息和基因功能信息，从而明确在相应环境中物种的存在。该技术不需要与被测物种直接接触，即使在被测物种密度极低时也可测出。使用这项技术，即可代替灵敏度低，成本高，难以大规模实施的传统监测方法，解决不能及时发现入侵物种的难题。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境dna的方法；本发明所要解决的另一技术问题是提供一种用于环境dna检测霓虹脂鲤属下物种存在的特异性引物对。
7.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
8.本发明基于霓虹脂鲤和阿氏霓虹脂鲤12s rrna基因序列，设计了用于环境dna检测霓虹脂鲤属下物种存在的特异性引物对，具体如下：
9.上游引物：5
′‑
ctacagcccaacttatacat-3
′
；(见seq id no.1)；
10.下游引物：5
′‑
ttcttgtattattaacatct-3
′
；(见seq id no.2)。
11.一种检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境dna的方法，包括以下步骤：
12.1)待测样品环境dna的提取；
13.2)以待测样品环境dna为模板，采用霓虹脂鲤属下物种特异性引物对进行pcr扩增；
14.3)根据电泳结果是否发生特异性的扩增判断待测样品中是否存在霓虹脂鲤属下物种。
15.进一步的，若电泳结果中出现450-500bp的条带，则表明待测样品来源的环境中存在霓虹脂鲤属下物种；若电泳结果未发生特异性的扩增，则待测样品来源的环境中不存在霓虹脂鲤属下物种。
16.进一步的，pcr反应体系为：每26μl体系中，含有taq酶12.5μl，上下游引物各1μl，dna模板1μl和ddh2o10.5μl。
17.进一步的，pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
18.含有用于环境dna检测霓虹脂鲤属下物种存在的特异性引物对的检测试剂或检测试剂盒，也在本发明的保护范围内。
19.该特异性引物对也可以应用于快速检测混合脂鲤属中是否含有霓虹脂鲤属下物种。
20.本技术对霓虹脂鲤属下的三种物种，霓虹脂鲤，阿氏霓虹脂鲤和类霓虹脂鲤进行检测，也对其他12种物种进行了测试验证，包括拉氏细脂鲤、裸顶脂鲤、爱魮脂鲤、火焰魮脂鲤、黑异纹魮脂鲤、大鳍魮脂鲤、丽鳍望脂鲤、史氏魮脂鲤、金半线脂鲤、红带半线脂鲤、玻璃锯脂鳊和克氏锯翼脂鲤。
21.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
22.1)本发明利用霓虹脂鲤属下物种残留水体中的粪便、皮肤脱落物及尸体等遗迹提取环境dna样品，结合分子生物学技术，开发出具有特异性且扩增效率高的pcr引物，建立了可针对霓虹脂鲤属下物种的快速，准确的检测鉴定方法。本发明为监测可能发生的外来物种入侵提供了新的技术手段，对于防止霓虹脂鲤属下物种的入侵具有重要意义。
23.2)本发明采用的引物是针对霓虹脂鲤属下物种线粒体12s rrna基因序列设计出的特异性引物，特异性强，结果可靠。
24.3)本发明仅需要取少许底泥和水样，过滤取滤渣，即可提取出可用的环境dna样品。少数霓虹脂鲤属下物种在待测水体中生活一段时间即可检测出，敏感度高。
附图说明
25.图1是霓虹脂鲤属pcr引物特异性试验扩增产物的电泳图，图中，m为2000bp dna ladder marker；泳道1为霓虹脂鲤paracheirodon innesi；泳道2为阿氏霓虹脂鲤paracheirodon axelrodi；泳道3为类霓虹脂鲤paracheirodon simulans；泳道4为拉氏细
脂鲤aphyocharax rathbuni；泳道5为裸顶脂鲤gymnocorymbus ternetzi；泳道6为爱魮脂鲤hyphessobrycon amandae；泳道7为火焰魮脂鲤hyphessobrycon flammeus；泳道8为黑异纹魮脂鲤hyphessobrycon herbertaxelrodi；泳道9为大鳍魮脂鲤hyphessobrycon megalopterus；泳道10为丽鳍望脂鲤hyphessobrycon pulchripinnis；泳道11为史氏魮脂鲤hyphessobrycon sweglesi；泳道12为金半线脂鲤hemigrammus armstrongi；泳道13为红带半线脂鲤hemigrammus erythrozonus；泳道14为玻璃锯脂鳊prionobrama filigera；泳道15为克氏锯翼脂鲤serrapinnus kriegi；
26.图2是霓虹脂鲤属pcr引物三份水样扩增产物的电泳图；图中，m为2000bp dna ladder marker；泳道1为环境1第一次取样；泳道2为环境1第二次取样；泳道3为环境2第一次取样；泳道4为环境2第二次取样；泳道5为环境3第一次取样；泳道6为环境3第二次取样；泳道7为阴性对照(纯净水)，泳道8为阳性对照1(霓虹脂鲤)，泳道9为阳性对照2(阿氏霓虹脂鲤)，泳道10为阳性对照3(类霓虹脂鲤)。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
28.实施例1引物灵敏度验证
29.1、材料准备
30.供试脂鲤科鱼类如下：霓虹脂鲤；阿氏霓虹脂鲤；类霓虹脂鲤；拉氏细脂鲤；裸顶脂鲤；爱魮脂鲤；火焰魮脂鲤；黑异纹魮脂鲤；大鳍魮脂鲤；丽鳍望脂鲤；史氏魮脂鲤；金半线脂鲤；红带半线脂鲤；玻璃锯脂鳊；克氏锯翼脂鲤。
31.上述供试脂鲤均于南京夫子庙花鸟鱼虫市场购买，按fishbase(https://www.worldfishcenter.org/fishbase)上获得的描述进行形态学鉴定后，从鱼鳍上剪取少量组织置于-20℃冰箱中保存备用。
32.2、pcr方法建立
33.(1)引物的设计和合成：基于霓虹脂鲤和阿氏霓虹脂鲤12s rrna基因序列，使用seqman寻找保守序列，在合适片段的两端设计上下游引物，在ncbi网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用primer blast功能检验其特异性后，交由南京擎科生物科技有限公司合成。引物如下：
34.上游引物为p-(p1)：5
′‑
ctacagcccaacttatacat-3
′
；
35.下游引物为p-(p2)：5
′‑
ttcttgtattattaacatct-3
′
。
36.扩增片段大小为450-500bp。
37.(2)dna提取：使用dnaiso reagent(基因组dna提取试剂)提取，按使用说明书操作提取dna。
38.(3)pcr反应体系总体积为26μl，其中taq 12.5μl，上下游引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o 10.5μl。
39.(4)pcr扩增反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，结束反应。
40.(5)pcr扩增产物检测于鉴定：取pcr产物10μl在1.5％琼脂糖凝脂(含溴化乙锭)。以100v电泳40min，用凝胶成像仪观察。检测结果如图1所示：m为2000bp dna ladder marker；泳道1为霓虹脂鲤；泳道2为阿氏霓虹脂鲤；泳道3为类霓虹脂鲤；泳道4为拉氏细脂鲤；泳道5为裸顶脂鲤；泳道6为爱魮脂鲤；泳道7为火焰魮脂鲤；泳道8为黑异纹魮脂鲤；泳道9为大鳍魮脂鲤；泳道10为丽鳍望脂鲤；泳道11为史氏魮脂鲤；泳道12为金半线脂鲤；泳道13为红带半线脂鲤；泳道14为玻璃锯脂鳊；泳道15为克氏锯翼脂鲤。只有霓虹脂鲤属下的霓虹脂鲤，阿氏霓虹脂鲤和类霓虹脂鲤扩增出450-500bp的条带，其他样品都没有出现450-500bp的条带。
41.结果表明：此引物具有很强的特异性。
42.实施例2使用引物进行水样检测的效果
43.由于现阶段国内并没有确定被霓虹脂鲤属下物种入侵的水体，故只能在人工模拟环境中进行实验。为了尽量模拟野外情况，营造了三种实验环境：环境1：5条霓虹脂鲤生活3天后的装有20l水的鱼缸。环境2：浸泡过1条阿氏霓虹脂鲤，1条霓虹脂鲤，1条类霓虹脂鲤共3条完整尸体1天的装有20l水的鱼缸。环境3：有多种脂鲤科鱼类混养(包括5条阿氏霓虹脂鲤)生活3天的装有50l水的野生环境模拟生态缸。水样取样的样本量按照待测鱼类的密度设计。在三个实验环境中分别采集水样，水样采集自底层，每次取样取水量为100ml，取样三份(一份备用)。取样前先用75％酒精将塑料取样瓶清洗一遍，再用超纯水冲洗三遍，最后使用取样地水源润洗三遍。每次取样必须更换一次性手套，采后的水样必须在6小时之内进行真空抽滤，或者在1～5℃冷藏于暗处进行短期保存。
44.真空抽滤采用真空泵抽滤系统，玻璃砂芯、镊子用自来水清洗后再使用超纯水润洗并经过高温高压灭菌处理。抽滤后，将垫于滤芯上的0.22μm混合纤维素滤膜用消毒过的镊子折叠装入1.5ml ep管中-20℃保存。
45.为了排除交叉污染，在过滤下一份水样前过滤5l超纯水进行洗涤。
46.为避免假阳性的发生，进行两个样品重复，若两个重复的结果不一致，再次在环境中采样，进行第二次检测。若同批次两个样品检测结果同为阳性则判断为阳性，两次检测结果同为阴性时判定为阴性。
47.过滤水样后，在超净工作台上使用dnaiso reagent提取dna。提取后使用实施例1中2.3的扩增方法扩增，设置阴性对照(纯净水)和阳性对照(从霓虹脂鲤、阿氏霓虹脂鲤和类霓虹脂鲤上提取的dna)。
48.pcr产物使用实施例1中2.5的方法进行电泳检测，若每个环境中采得的两份样品的电泳结果中均出现分子量为450-500bp的条带，则判定水样环境dna检测呈阳性。图2为检测的结果，其中：m为2000bp dna ladder marker；泳道1为环境1第一次取样；泳道2为环境1第二次取样；泳道3为环境2第一次取样；泳道4为环境2第二次取样；泳道5为环境3第一次取样；泳道6为环境3第二次取样；泳道7为阴性对照(纯净水)，泳道8为阳性对照1(霓虹脂鲤)，泳道9为阳性对照2(阿氏霓虹脂鲤)，泳道10为阳性对照3(类霓虹脂鲤)。三个环境中采得的两份样品的电泳结果中均出现450-500bp的条带。且阴性对照没有出现条带，排除假阳性，证明样品未被污染，实验结果可靠。阳性对照均扩增出450-500bp的条带，排除假阴性，证明实验体系未出现问题，实验结果可靠。
49.结果表明：本发明提供的环境dna引物能够检测出水样中霓虹脂鲤属鱼类残留
dna。
50.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。