具有降低的粘度的真菌菌株的制作方法

1.本发明涉及具有降低的粘度的真菌菌株，特别是丝状真菌菌株，其中id78713(gel3)基因已被无效。本发明还涉及该菌株的不同用途，以及能够获得根据本发明的菌株的基因修饰方法。


背景技术：

2.真菌菌株，特别是丝状真菌，诸如里氏木霉(trichoderma reesei)真菌，目前主要用于酶的产生。这些酶，例如纤维素水解酶，实际上用于将纤维素或木质纤维素生物质水解成单糖。因此，由丝状真菌产生的酶可用于第二代生物燃料或来自(木质)纤维素生物质糖的生物来源产品的产生链。
3.为了改进第二代生物燃料或生物来源产品的产生，已经构思了改进纤维素水解酶的产生。
4.例如，专利ep 448430b1描述了通过里氏木霉进行纤维素水解酶的优化工业产生。通过使用含有乳糖作为诱导纤维素水解酶产生的糖的进料溶液，以分批进料方案(无提取的供应)进行该产生。该发酵法包括两个步骤：第一步是在过量碳源存在下的真菌生长，第二步是通过向培养基中以优化流速添加诱导物来产生酶。这些步骤在液体介质中在搅拌的生物反应器中并在氧存在下进行，因为真菌是专性需氧菌。专利ep 2744899b1中描述了优化的纤维素水解酶产生方法的另一个实例。
5.除了优化纤维素水解酶产生方法之外，还构思了基因修饰真菌菌株以改变它们的产生能力。因此，专利申请ep 18197010.4描述了一种里氏木霉菌株，其高产纤维素分解酶。
6.现有技术中已经描述了可用于改进通过丝状真菌产生纤维素分解酶的发酵方法和菌株，结果是获得生物来源的产品，以及第二代生物燃料。
7.然而，工业丝状真菌的形态对发酵方法的设计和实施具有显著的后果，因为它增加了培养基的粘度。因此，粘度对氧的转移具有负面影响，并限制了在生长步骤结束时可靶向的真菌的最大浓度(因此，这限制了可产生的纤维素分解酶的量)。
8.为了减轻这个问题，首先构思了以较高速度搅拌发酵罐。但是，增加搅拌不是理想的解决方案，因为这导致能量消耗增加和对菌丝体的剪切应力增加，这也对产生纤维素分解酶具有负面影响。
9.还构思了通过修饰丝状真菌的基因组来改变其粘度。这些修饰主要由无效基因组成，这些基因产生的蛋白或酶的缺乏导致细胞功能的改变(bodie and pratt 2012；dodge,virag and ward 2012)。
10.因此，在申请pct/us2012/034379中，bodie和pratt构思了无效mpg1基因以改变真菌菌株的粘度。还构思了另外的无效(在sfb3，seb1，gas1，crz1或tps2基因中)。
11.对于他们的部分，在申请pct/us2011/049164中，dodge，virag和ward构思了无效sfb3基因。
12.已经在现有技术中描述了为与非突变菌株(即亲本菌株)相比改变其粘度而基因
修饰的真菌菌株。但是，应当注意，现有技术没有提及与亲本菌株相比粘度值的具体改进。
13.此外，总是需要新的粘性较小的菌株。另外，总是需要与亲本菌株相比能够使真菌更好生长的新的，性能更好的菌株。
14.发明简述
15.因此，本发明基于本发明人的出乎意料的结果，其证明使真菌菌株(特别属于粪壳菌纲)中的id78713(gel3)基因无效能够获得与其中所述id78713(gel3)基因未被无效的亲本菌株相比粘度显著降低的菌株。本发明人事实上已经证明了无效id78713(gel3)基因改变了所述真菌，特别是丝状真菌的粘度。因此，使用这种菌株能够降低发酵浆汁(must)在等浓度真菌下(即浆汁中相同浓度的真菌下)的粘度，从而能够降低发酵丝状真菌的方法的成本。这还能够通过获得更高的真菌浓度来提高该方法的产率。事实上，酶体积产率与真菌浓度和酶产生的比速率成比例。因此，具有较低粘性的菌株使得可以达到较高的真菌浓度并提高该方法的酶产率。
16.因此，本发明的发明人首次证明(gel3)基因可以影响真菌菌株的表型粘度。事实上，id78713(gel3)基因编码来自糖苷水解酶家族72的蛋白，特别是1,3-β-葡聚糖基转移酶。文献mouyna et al.,microbiology(1998),144,3171-3180描述了获得烟曲霉(aspergillus fumigatus)(属于散囊菌纲(eurotiomycetes)的真菌)的突变体，其中编码1,3-β-葡聚糖基转移酶bgt1的基因被无效；然而，作者推断变体菌株与亲本菌株相比不呈现不同的表型。
17.因此，本发明涉及真菌菌株，其中id78713(gel3)基因已被无效。
18.本发明还涉及基因修饰根据本发明的真菌菌株的方法，其包括无效id78713(gel3)基因的步骤。
19.本发明还涉及产生真菌生物质的方法，其包括在包含合适底物的培养基中培养根据本发明的真菌菌株的步骤。
20.本发明还涉及产生目标蛋白，特别是酶的方法，其包括在包含合适底物的培养基中培养根据本发明的真菌菌株的步骤。
21.本发明还涉及从纤维素或木质纤维素底物产生生物来源产品的方法，其包括使用根据本发明的真菌菌株产生纤维素分解酶的步骤。
22.本发明还涉及从纤维素或木质纤维素底物产生生物燃料的方法，其包括使用根据本发明的真菌菌株产生纤维素分解酶的步骤。
23.本发明还涉及根据本发明的菌株用于产生目标蛋白，用于将纤维素或木质纤维素水解成葡萄糖，用于从纤维素或木质纤维素底物产生生物来源的产品，或用于产生生物燃料的不同用途。
24.最后，本发明涉及根据本发明的真菌菌株用于改进相容菌株，特别是工业菌株的性能的用途。
25.发明详述
26.因此，在第一方面，本发明涉及真菌菌株，其中id78713(gel3)基因已被无效。因此，在根据本发明的菌株中，id78713(gel3)基因不再是功能性的。这也意味着在根据本发明的菌株中，id78713(gel3)基因被无效。因此，本发明涉及真菌的变体菌株，其中id78713(gel3)基因已被无效。换句话说，这意味着，例如，在根据本发明的菌株中，不产生对应于
id78713(gel3)基因的蛋白。或者，可以产生对应于id78713(gel3)基因的蛋白，但其不是功能性的。
27.根据本发明，术语“变体菌株”应理解为是指与亲本菌株相比已被基因修饰的菌株。因此，根据本发明，术语“亲本菌株”应理解为是指变异菌株从其演变或衍生的菌株，并且其中id78713(gel3)基因未被无效。因此，根据本发明的菌株对应于衍生自亲本菌株的变体菌株，所述变体菌株与亲本菌株相比具有降低的粘度，并且所述变体菌株包含至少一种对应于id78713(gel3)基因的无效的基因修饰。
28.根据本发明，术语“功能性基因”应理解为特别是指能够产生功能性蛋白的基因。
29.根据本发明，术语“功能性蛋白”应理解为特别是指具有以下活性的蛋白：例如，对于由id78713(gel3)基因编码的蛋白，糖苷水解酶活性。
30.根据本发明，与其中id78713(gel3)基因未被无效的亲本菌株相比，所述真菌菌株具有降低的粘度。根据优选实施方案，真菌菌株的粘度比亲本菌株低至少3倍，更具体地至少低8或10倍。
31.表述“与亲本菌株相比降低的粘度”是指变体菌株的粘度低于亲本菌株的粘度。本领域技术人员知道，对于发酵浆汁中相同的真菌浓度，应比较根据本发明的变体菌株的粘度和亲本菌株的粘度。
32.根据本发明，粘度优选通过实施例2中描述的方法(也在hardy et al.,rh
é
ologie,vol.27,43-48(2015)中描述)或通过使用以下参数(称为例如测试a)测量：
[0033]-所使用的轴(转子)是具有38mm的直径，32mm的高度，29mm的节距并且具有8mm宽度的带的叶轮；
[0034]-内径为45mm的杯(定子)；
[0035]-转子和定子之间的垂直空间为500μm；以及以下方案：
[0036]-用70ml待测量粘度的介质填充杯；
[0037]-在27℃的温度下通过4s-1
至100s-1
，然后100s-1
至4s-1
的对数剪切速率扫描测量粘度；
[0038]-任选地，一式两份地进行测量。
[0039]
优选地，根据本发明的粘度通过使用ta instruments ar 2000流变仪，特别地通过在27℃的温度下在4至100s-1
的对数剪切速率扫描，甚至更优选地通过使用双向扫描(从4s-1
至100s-1
并且然后从100s-1
至4s-1
)来测量。根据一个实施方案，当真菌浓度为约35g/l时，使用用5s-1
的对数剪切速率扫描的ta instruments ar 2000流变仪在27℃下测量的根据本发明的菌株具有约1.5pa.s的粘度。“真菌浓度”应理解为是指其中粘度被测量的培养基中的浓度。典型地，培养基对应于发酵浆汁。根据本发明，术语“约”意味着这些值不应该被认为是严格的值。因此，“约1.5pa.s”应理解为是指1.45pa.s-1.55pa.s的值，并且“约35g/l”应理解为是指34.5g/l-35.5g/l的值。
[0040]
根据本发明，并且在另一个具体实施方案中，根据本发明的菌株具有与亲本菌株相比降低至少50％的粘度。根据本发明，术语“至少50％”是指在50％和100％之间的所有值，特别是数值55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，
97％，98％，99％和100％。优选地，根据本发明的菌株具有与亲本菌株相比降低至少65％的粘度。本领域技术人员知道如何计算百分比减少。这种降低速率可以例如根据下式计算：((终值－初始值)/初始值)*100。
[0041]
gel3基因(在里氏木霉参考基因组中也称为id78713，参见https://www.uniprot.org/uniprot/g0rl27)编码属于糖苷水解酶家族72的蛋白。例如，这些酶是参与真菌细胞壁生源说的β-1,3-葡聚糖基转移酶。根据本发明，术语id78713优于术语gel3。
[0042]
根据本发明，id78713(gel3)基因由seq id no:2所示，但也可对应于该基因的变体或直系同源基因。优选地，id78713(gel3)基因仅由seq id no:2所示。
[0043]
根据本发明，“基因变体或直系同源基因”应理解为是指还编码属于糖苷水解酶家族72的蛋白的基因。id78713(gel3)基因的变体或id78713(gel3)基因的直系同源基因典型地由与seq id no:2的基因具有至少80％同一性的序列所示。因此，id78713(gel3)基因的变体或id78713(gel3)基因的直系同源基因对应于衍生自seq id no:2所示序列的基因。更具体地，id78713(gel3)基因的变体或id78713(gel3)基因的直系同源基因由与seq id no:2基因具有至少90％，特别是至少95％，优选至少98％或99％同一性的序列所示。
[0044]
id78713(gel3)基因由seq id no:2所示，id78713(gel3)基因编码的蛋白由seq id no:3所示。因此，id78713(gel3)基因的变体或id78713(gel3)基因的直系同源基因编码seq id no:3的蛋白，或编码与所述seq id no:3具有至少80％，特别是至少90％，更具体是至少95％，98％或99％同一性的序列。
[0045]
根据本发明，术语“至少80％”是指包括80％至100％的所有值，特别是数值80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。本领域技术人员知道如何计算两个序列之间的同一性百分比。例如，根据本发明，给定序列与seq id no:2或seq id no:3相比的同一性百分比应理解为是指序列全长上的同一性百分比。因此，该百分比对应于该给定序列与seq id no:2或3之间相同核苷酸/残基的数目除以这两个序列中较长序列中核苷酸或残基的数目。
[0046]
因此，在一个实施方案中，在根据本发明的所述菌株中，无效的id78713(gel3)基因对应于seq id no:2所示的基因或与seq id no:2的基因具有至少80％同一性，特别是至少90％，更具体是至少95％同一性的基因。在甚至更优选的实施方案中，在根据本发明的所述菌株中，无效的id78713(gel3)基因对应于seq id no:2所示的基因。根据该最后一个实施方案，根据本发明的菌株因此包含编码seq id no:3所示的蛋白的基因的缺失。
[0047]
在优选的方面，在根据本发明的菌株中，id78713(gel3)基因已经通过诱变或通过同源重组被无效。根据本发明，无效包括全部或部分id78713(gel3)基因的缺失。优选地，在根据本发明的菌株中，id78713(gel3)基因已经通过使用无效盒被无效。仍更优选地，所述无效盒由seq id no:1所示，并且特别用于属于里氏木霉种的真菌。
[0048]
诱变是基因工程中常用的技术。其目的是主动将突变引入dna以产生基因修饰的基因。根据本发明，诱变更具体地应理解为指定点诱变。事实上，定点诱变能够将鉴定的突变引入特定基因。为此，合成含有突变的目标dna(此处为id78713(gel3)基因)，然后将其引入待突变的细胞中，典型地通过使用载体，其中dna修复机制将其整合到基因组中。
[0049]
同源重组是基因工程中常用的技术，其由dna分子之间的交换组成，典型地通过使用载体。
[0050]
术语“载体”应理解为是指其中能够插入外源核酸片段的任何dna序列，所述载体能够将外源dna引入宿主细胞。载体的实例是质粒、粘粒、酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)、噬菌体p1衍生的人工染色体(pac)和病毒衍生的载体。根据本发明的载体使得能够引入突变或缺失。
[0051]
在一个优选实施方案中，所述无效盒包含三个dna片段：
[0052]
(1)靶基因上游的区域，
[0053]
(2)选择标记，和
[0054]
(3)靶基因下游的区域。
[0055]
在本发明的情况下，“靶基因”应理解为是指id78713(gel3)基因。靶基因上游和下游的区域是两个重组元件，每一个在基因的每一端，并且是用于精确靶向待无效的序列所必需的。
[0056]
根据本发明，靶基因上游的区域(即id78713(gel3)基因上游的序列5')特别由序列seq id no:10所示。
[0057]
根据本发明，靶基因下游的区域(即id78713(gel3)基因下游的序列3')特别由序列seq id no:12所示。
[0058]
表述“选择标记”应理解为是指其表达赋予含有它的细胞允许它们被选择的特征的基因。事实上，与没有整合基因修饰的细胞相比，选择标记的使用能够鉴定已经整合了修饰的细胞。例如，它是抗生素抗性基因，特别是潮霉素抗生素抗性基因hph，如seq id no:11所示。
[0059]
更具体地，根据本发明，无效盒优选由置于启动子和终止子控制下的抗性基因组成，具有id78713(gel3)基因上游和下游的侧翼区5'和3'。甚至更优选地，根据本发明，无效盒由置于gpda启动子和trpc终止子控制下的潮霉素抗生素抗性基因hph组成(punt and van den hondel,1992)，具有id78713(gel3)基因上游和下游的5'和3'侧翼区。根据本发明，所述无效盒可以可操作地连接到启动子、终止子或其在宿主细胞中表达所需的任何其它序列。
[0060]
可根据本领域技术人员熟知的常规技术扩增无效盒，典型地通过选自标准克隆，融合pcr或体内pcr克隆的方法。优选地，该无效盒通过pcr扩增，特别是通过使用seq id no:4和seq id no:5所示的序列。然后，通过重组将无效盒导入不表达选择标记基因的菌株，特别是里氏木霉菌株。本领域技术人员可以容易地鉴定与本发明的实施相关的选择标记基因。培养后，基于选择标记的表达或非表达选择已导入无效盒的变体/突变体菌株；已被转化的克隆是表达所述选择标记的克隆。这些是根据本发明的菌株。优选地，通过使用seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的引物鉴定突变体菌株。这些遗传重组技术是本领域技术人员熟知的。在优选的方面，根据本发明，真菌是丝状真菌。甚至更优选地，所述丝状真菌选自以下纲：圆盘菌纲(orbiliaceae),盘菌纲(pezizomycetes),座囊菌纲(dothideomycetes),散囊菌纲(eurotiomycetes),茶渍菌纲(lecanoromycetes),锤舌菌纲(leotiomycetes),粪壳菌纲(sordariomycetes),和酵母纲(saccharomycetes)。有利地，根据本发明的丝状真菌属于粪壳菌纲，特别是属于木霉属，更具体属于里氏木霉种。
[0061]
根据本发明，当真菌属于里氏木霉种时，里氏木霉的亲本菌株可以是qm6a菌株(保藏号为atcc 13631)，或由天然分离物qm6a产生的菌株(特别是通过随机或定向诱变获得
的)，诸如菌株rut-c30(保藏号为atcc 56765)、保藏号为cncmi-5221的菌株(于2017年8月3日保藏于the national collection of cultures and microorganisms(cncm,collection nationale de cultures de microorganismes),of the pasteur institute,25rue du docteur roux,f-75724paris cedex 15)、菌株ng14(保藏号为atcc 56767)或菌株qm9414(保藏号为atcc26921)。典型地，根据本发明的菌株呈现低粘度表型，同时仍保持其产生目标蛋白的能力。
[0062]
在第二方面，本发明还涉及基因修饰诸如上述的根据本发明的真菌菌株的方法，其包括无效id78713(gel3)基因的步骤。因此，根据本发明的基因修饰菌株的方法允许获得与亲本真菌菌株相比粘性较小的真菌菌株。这就是为什么根据本发明的菌株可以被认为是亲本真菌菌株的变体。因此，在其生长期间，在相同的生物质浓度和相同的温度下，对于给定的剪切速率，根据本发明的真菌菌株产生比亲本菌株更低的粘度。
[0063]
优选地，在根据本发明的所述基因修饰方法中，无效id78713(gel3)基因的步骤使用诱变或同源重组步骤进行。仍更优选地，在根据本发明的所述基因修饰方法中，无效id78713(gel3)基因的步骤通过在属于里氏木霉种的真菌中，使用诸如上述的无效盒，特别是如seq id no:1所示的无效盒来进行。
[0064]
在第三方面，本发明还涉及产生真菌生物质的方法，其包括在包含合适底物的培养基中培养根据本发明的真菌菌株的步骤。因此，该步骤能够使本发明的真菌菌株生长。本领域技术人员知道用于生长真菌菌株的合适底物。
[0065]
在第四方面，本发明还涉及产生目标蛋白质，特别是酶的方法，其包括在包含合适底物的培养基中培养根据本发明的真菌菌株的步骤。因此，本发明涉及根据本发明的真菌菌株用于产生目标蛋白的用途。
[0066]
因此，有利地，所述方法包括生长根据本发明的真菌菌株的生长阶段，然后是由所述菌株生长并产生目标蛋白的阶段。仍更优选地，所述生长阶段在生长底物的存在下进行，并且所述生长并产生目标蛋白的阶段在诱导底物的存在下进行。生长底物和诱导底物优选为碳底物。
[0067]
因此，碳生长底物优选选自乳糖、葡萄糖、木糖、纤维素生物质的酶促水解产物的单糖的乙醇发酵后获得的残余物，和/或来自纤维素生物质的预处理的水溶性戊糖的粗提取物。
[0068]
因此，诱导碳底物优选选自乳糖、纤维二糖、槐糖、纤维素生物质的酶促水解产物的单糖的乙醇发酵后获得的残余物，和/或来自纤维素生物质的预处理的水溶性戊糖的粗提取物。
[0069]
根据本发明，目标蛋白是可以通过真菌，天然或通过基因修饰(例如，通过使用合适的载体转化后)产生的所有蛋白。
[0070]
有利地，根据本发明的目标蛋白是酶，特别是纤维素分解酶(cellulolytic enzymes)，诸如纤维素水解酶(cellulases)或半纤维素水解酶。优选地，所述酶是纤维素水解酶。根据本发明，术语“纤维素水解酶”应理解为更具体地指选自内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡糖苷酶的酶，并且更具体地，指β-葡糖苷酶。术语“纤维素水解酶”更具体地是指适合于水解纤维素并使产生它们的微生物(例如里氏木霉)能够通过将该聚合物水解成单糖(葡萄糖)而使用纤维素作为碳源的酶。通过根据本发明的菌株，特别是里氏木霉产生纤维
素水解酶可以通过本领域技术人员可用的任何常规技术，或者通过专利ep 448430b1或ep2744899b1中描述的技术来确定。
[0071]
可以获得总分泌蛋白和纤维素水解酶之间的相关性，因为在里氏木霉中，主要的外切葡聚糖酶(cbhi，cbhii)和内切葡聚糖酶(egi，egii)可以占分泌蛋白总量的高达90％(参见，例如，markov,a.v.,gusakov,a.v.,kondratyeva,e.g.,okunev,o.n.,bekkarevich,a.o.,and sinitsyn,a.p.(2005).new effective method for analysis of the component composition of enzyme complexes from trichoderma reesei.biochemistry(moscow)70,657-663)。
[0072]
在第五方面，本发明还涉及从纤维素或木质纤维素底物生产生物来源产品的方法，其包括使用根据本发明的真菌菌株产生纤维素分解酶的步骤。因此，本发明还涉及使用根据本发明的真菌菌株用于从纤维素或木质纤维素底物产生生物来源的产品的方法。
[0073]
在第六方面，本发明涉及从纤维素或木质纤维素底物产生生物燃料的方法，其包括使用根据本发明的真菌菌株产生纤维素分解酶的步骤。因此，本发明还涉及根据本发明的真菌菌株用于从纤维素或木质纤维素底物产生生物燃料的用途。
[0074]
根据本发明，术语“生物燃料”应更具体地理解为是指第二代生物燃料，即衍生自非食品资源的生物燃料。根据本发明，术语“生物燃料”也可定义为源自生物质转化且可用于能量目的的任何产物。首先，不希望受到任何限制，可以列举例如生物气，可以掺入(可能在随后的转化之后)到燃料中或可以是完全成熟的燃料的产物，诸如醇(乙醇、丁醇和/或异丙醇，取决于使用的发酵生物体的类型)、溶剂(丙酮)、酸(丁酸)、脂质和它们的衍生物(短链或长链脂肪酸、脂肪酸酯)，以及氢。优选地，根据本发明的生物燃料是醇，例如乙醇，丁醇和/或异丙醇。更优选地，根据本发明的生物燃料是乙醇。在另一个实施方案中，生物燃料是生物气。在另一个实施方案中，产品是化学工业的目标分子，例如另一种醇，诸如1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇；有机酸，诸如乙酸、丙酸、丙烯酸、丁酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、柠檬酸、衣康酸、或羟基酸(诸如乙醇酸、羟基丙酸或乳酸)。
[0075]
在优选的方面，根据本发明的从纤维素或木质纤维素底物产生生物燃料的方法包括：
[0076]
i)预处理纤维素或木质纤维素底物以获得经预处理的底物的步骤，ii)使用根据本发明的菌株产生纤维素分解酶的步骤，
[0077]
iii)在步骤ii)中获得的纤维素分解酶的存在下，酶促水解在步骤i)中获得的所述经预处理的底物以获得水解产物的步骤，
[0078]
iv)醇发酵所述获得的水解产物的步骤，
[0079]
v)分离步骤，特别是通过蒸馏。
[0080]
在甚至更优选的方面，根据本发明的从纤维素或木质纤维素底物产生生物燃料的方法包括：
[0081]
i)预处理纤维素或木质纤维素底物以获得经预处理的底物的步骤，ii)使用根据本发明的菌株产生纤维素分解酶的步骤，
[0082]
iii)在步骤ii)中获得的纤维素分解酶的存在下，酶促水解在步骤i)中获得的所述经预处理的底物以获得水解产物的步骤，
[0083]
iv)醇发酵所述获得的水解产物的步骤，
[0084]
v)分离步骤，特别是通过蒸馏。
[0085]
所述步骤iii)和iv)同时进行。在称为“ssf”(同时糖化并发酵)的生产方法中典型地是这种情况。
[0086]
根据一个具体实施方案，预处理纤维素或木质纤维素底物的步骤是将所述纤维素或木质纤维素基材悬浮在水相中的步骤。
[0087]
根据一个具体实施方案，步骤iii)中获得的水解产物是含有葡萄糖的水解产物。
[0088]
根据一个具体实施方案，醇发酵所述获得的水解产物的步骤是在发酵生物体存在下发酵从水解产物产生的葡萄糖以产生发酵浆汁的步骤。例如，发酵生物体是酵母。
[0089]
根据一个具体实施方案，分离步骤是生物燃料和发酵浆汁的分离，特别是通过蒸馏。
[0090]
根据甚至更优选的实施方案，待水解的纤维素或木质纤维素底物以6-40％干物质，优选20-30％干物质的量悬浮在水相中。将ph调节至4-5.5，优选4.8-5.2，并将温度调节至40℃-60℃，优选45℃-50℃。通过添加作用于预处理的底物的酶来引发水解反应。通常使用的酶的量为每克预处理的底物10-30mg分泌的蛋白质或更少。反应通常持续15至48小时。通过测定释放的糖，特别是葡萄糖来监测反应。通过过滤或离心将糖溶液与基本上由木质素组成的未水解的固体部分分离，然后在发酵单元中处理。
[0091]
根据另一个甚至更优选的实施方案，当水解和发酵步骤同时进行时，同时添加酶和发酵生物体，然后在30℃至35℃的温度下孵育以产生发酵浆汁。根据该实施方案，存在于预处理的底物中的纤维素被转化为葡萄糖，并且同时，在同一反应器中，发酵生物体(例如酵母)根据本领域技术人员已知的ssf(同时糖化和发酵)方法将葡萄糖转化为终产物。取决于发酵生物体的代谢和水解能力，操作的成功完成可能需要添加更多或更少量的外源性纤维素混合物。
[0092]
在第七方面，本发明还涉及根据本发明的真菌菌株用于将纤维素或木质纤维素水解成葡萄糖的用途。
[0093]
在第八方面，本发明还涉及根据本发明的真菌菌株用于改进相容菌株，特别是工业菌株的性能的用途。
[0094]
在本说明书中，在一个方面中指出的定义和优选项适用于其它方面。例如，以上本发明的第一方面中指出的所有定义和优选项也适用于第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八方面。
[0095]
附图简要说明
[0096]
本发明的其它特征，细节和优点将在阅读附图时显现。
[0097]
图1
[0098]
[图1]表示对于在摇瓶中培养的不同菌株在5s-1
的剪切速率下测量的表观粘度。
[0099]
图2
[0100]
[图2]表示在生物反应器(rutc30和tr3126-δgel3)中培养的不同菌株在5s-1
剪切速率下测量的表观粘度。
[0101]
图3
[0102]
[图3]表示在生物反应器(cl847和cl847-δgel3)中培养的不同菌株在5s-1
剪切速率下测量的表观粘度。
[0103]
本发明的序列
[0104]
[表1]
[0105]
[0106]
[0107]
[0108][0109]
本专利申请中引用的参考文献
[0110]
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–
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[0112]
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[0113]
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te'o vs,bergquist pl,nevalainen km.,(2002).biolistic transformation of trichoderma reesei usingthe bio-rad seven barrels hepta adaptor system.j microbiol methods.51(3):393-9.
具体实施方式
[0116]
实施例1a：高产菌株中id78713(gel3)基因的无效
[0117]
id78713(gel3)的无效盒由在gpda启动子和trpc终止子控制下的潮霉素抗生素抗性基因hph组成(punt and van den hondel,199)，具有id78713(gel3)基因上游和下游的5'和3'侧翼区。该序列如seq id no:1所示。合成dna盒并将该盒插入pex-a质粒(例如可从addgene获得)。扩增并提取质粒后，使用引物p61和p62通过pcr(聚合酶链式反应)扩增无效盒(参见下表2)。
[0118]
[表2]
[0119]
引物名称对应于引物的序列p61seq id no:4p62seq id no:5p78seq id no:6p79seq id no:7p91seq id no:8p92seq id no:9
[0120]
本发明的引物序列
[0121]
用于转化的菌株是高产菌株rutc30(montenecourt and eveleigh,1977)，其中通过用编码选择标记amds的基因替换编码序列使基因ku70(id 63200)无效(et al.,1987)。该基因的无效促进同源重组(guangtao et al.,2009)。该菌株称为tr3126。
[0122]
具有由seq id no:1所示的盒的tr3126菌株的转化由biolistique(te'o et al.,2002)通过使用5μg的纯化盒进行。通过pcr验证无效盒基因座处的整合，使用盒上游的引物(p91)和hph基因中的引物(p78)(5'验证)以及盒下游的引物(p92)和hph基因中的引物(p79)(3'验证)。被由此获得的id 78713(gel3)基因无效的菌株称为tr3126-δgel3。
[0123]
实施例1b：高产菌株中id78713(gel3)基因的无效
[0124]
测试第二菌株：cl847菌株(durand h et al.)。
[0125]
通过原生质体方法进行cl847菌株的转化(m et al.,doi:10.1016/0378-1119(87)90110-7)。与实施例1a类似，验证了无效盒基因座处的整合。被由此获得的id78713(gel3)基因无效的菌株称为cl847-δgel3。
[0126]
实施例2：测量粘度的方法
[0127]
对于流变测量，所使用的轴(转子)是不锈钢的大叶轮，其直径为38mm，高度为32mm，节距为29mm，并且具有宽度为8mm的带(ribbon)。该叶轮与内径为45mm且转子和定子之间的垂直间距为500μm的杯(定子)一起使用。校准后，叶轮类似于半径为14mm的库埃特圆筒。
[0128]
用从反应器(摇瓶，例如如实施例3所示，或生物反应器)收集的70ml发酵浆汁填充该杯。粘度测量在27℃的温度下通过4s-1
至100s-1
的对数剪切速率扫描进行。该范围对应于工业规模上预期的平均剪切速率。扫描是双向扫描(从4s-1
到100s-1
，然后从100s-1
到4s-1
)。流变测量一式两份进行。
[0129]
所有测量均在ta instruments ar 2000流变仪上进行。
[0130]
实施例3：摇瓶培养方案
[0131]
摇瓶培养在直径为19cm，含有400ml培养基的fernbach烧瓶中进行，用来自冷冻管的不同菌株的孢子接种，并在infors multitron培养箱中以150rpm和30℃孵育。
[0132]
培养基具有以下最终组成：
[0133]-5.6g/l(nh4)2so4[0134]-4.4g/l k2hpo4
[0135]-0.3g/lmgso4,7h2o
[0136]-0.15g/l cacl2,2h2o
[0137]-1ml/l微量元素溶液(feso4:5g/l,mnso4:1.4g/l,znso4:1.4g/l,cocl2:3.7g/l)
[0138]-5.85g/l btca(丁烷四羧酸)
[0139]-3.0g/l koh，晶体
[0140]-1.5g/l玉米浆(例如roquette)
[0141]-30g/l葡萄糖。
[0142]
用30％氢氧化钠将培养基的ph调节至6.0。
[0143]
化合物在121℃下灭菌20分钟(葡萄糖与其它化合物分开灭菌)。
[0144]
取常规2ml样品以监测残余葡萄糖。然后，当残余葡萄糖小于5g/l(对应于10g/l数量级的真菌浓度)时，取100ml样品精确测量真菌浓度(通过过滤并然后在1.2μm过滤器上干燥)和浆汁粘度(根据实施例2中描述的方法)。
[0145]
实施例4：摇瓶培养物的粘度比较
[0146]
根据实施例3中描述的方法一式两份培养两种菌株，然后根据实施例2中描述的方法表征发酵浆汁的粘度：
[0147]
所测试的两种菌株是：
[0148]-呈现id78713(gel3)基因无效的tr3126-δgel3菌株；
[0149]-用作高粘度对照的亲本菌株tr3126
[0150]
真菌浓度测量显示，在所进行的所有培养中，浓度具有相同的数量级，悬浮液中约10g/l的真菌(参见下表3)。
[0151]
[表3]
[0152][0153]
测试的菌株的真菌浓度(一式两份进行实验)
[0154]
粘度测量(如图1所示)显示id78713(gel3)基因的无效导致粘度的急剧下降。在5s-1
的剪切速率下，tr3126-δgel3菌株获得的粘度比粘性对照(tr3126)的粘度低约8至10倍。
[0155]
实施例5：生物反应器中的培养方案
[0156]
在直径为16cm的发酵罐中进行生物反应器培养，所述发酵罐含有2l培养基，所述培养基以10％v/v从根据实施例3中描述的方案进行的预培养物接种。通过直径为8cm的rayneri涡轮以1000rpm的固定速度进行搅拌。将温度控制在27℃，并且通过自动添加5n氨溶液将ph控制在4.8。
[0157]
培养基具有以下最终组成：
[0158]-3ml/l 85％正磷酸
[0159]-0.25ml/l 96％硫酸
[0160]-1.66g/l氢氧化钾koh，晶体
[0161]-2.8g/l(nh4)2so4[0162]-0.6g/l mgso4,7h2o
[0163]-0.6g/l cacl2,2h2o
[0164]-0.12g/l na2hpo4,12h2o
[0165]-1ml/l微量元素溶液(feso4:5g/l,mnso4:1.4g/l,znso4:1.4g/l,cocl2:3.7g/l)
[0166]-1g/l玉米浆(例如roquette)
[0167]-80g/l葡萄糖
[0168]
化合物在121℃下灭菌20分钟(葡萄糖与其它化合物分开灭菌)。
[0169]
调节培养基的ph，并然后用用于检查ph的氨溶液控制在4.8。
[0170]
取约100ml的常规样本：(i)监测残余葡萄糖，(ii)精确测量真菌浓度(通过过滤，并然后在1.2μm过滤器上干燥)，和(iii)测量浆汁的粘度(根据实施例2中描述的方法)。
[0171]
实施例6：生物反应器培养物中粘度的比较
[0172]
根据实施例5中描述的方法一式两份培养两种菌株，并根据实施例2中描述的方法表征发酵浆汁的粘度(对于浆汁中不同浓度的真菌)：
[0173]-呈现id78713(gel3)基因无效的tr3126-δgel3菌株
[0174]-参考菌株rut-c30(用作高粘度对照)
[0175]
在不同真菌浓度下的粘度表征显示出id78713(gel3)基因无效赋予的实际优势(参见图2)，其中：
[0176]-如在摇瓶中，当真菌浓度为约10g/l时，粘度低约10倍；
[0177]-当浓度为约25g/l时，粘度低约3倍；
[0178]-id78713(gel3)(tr3126-δgel3)无效的菌株在35g/l下的粘度与野生型菌株(rut-c30)在15g/l下的粘度数量级相同。
[0179]
因此，在35g/l下的id78713(gel3)无效的菌株的培养物不需要比在15g/l下的野生型菌株的培养物更多的用于搅拌的能量，这使得能够在相同的能量消耗下提高培养物的产率。
[0180]
实施例7：生物反应器培养物中两种其它菌株的粘度比较
[0181]
根据实施例5中描述的方法培养两种菌株，并根据实施例2中描述的方法表征发酵浆汁的粘度(对于浆汁中不同浓度的真菌)：
[0182]-呈现id78713(gel3)基因无效的cl847-δgel3菌株
[0183]-亲本菌株cl847(用作对照)
[0184]
在不同真菌浓度下的粘度表征再次表明，在cl847菌株中，当真菌浓度为12-14g/l时，id78713(gel3)基因无效(参见图3)赋予的优势是粘度低约3倍。