一种快速制备重组胶原蛋白海绵的方法及其特征

1.本发明涉及一种快速制备重组胶原蛋白海绵的方法及其特征，属于生物医用材料技术领域。


背景技术：

2.胶原蛋白是广泛分布于动物组织中的重要结构蛋白，其具有三螺旋结构，具有优良的生物活性，可以起到诱导血小板聚集和释放反应的作用，还可以激活凝血因子，进而起到止血的作用。胶原蛋白制品在在医药、生物、美容、组织工程和材料工程等领域有广泛应用。
3.胶原蛋白海绵多是由纯化后的胶原蛋白溶液通过真空冷冻干燥技术进行低温脱水制得的，并且在原位可以形成大量贯穿的微小孔洞，正是这种多孔的结构，促进了空气流动，也增加了药物负载的能力，进而适用于组织创面的修复填充。
4.由于胶原蛋白提取过程复杂，目前的提取工艺无法完全去除潜在的毒素，导致了胶原蛋白海绵的成本较高且无法避免易致敏性。目前胶原蛋白海绵制备工艺较为繁琐，且成本高昂，常常需要通过京尼平、戊二醛、甲醛、碳化二亚胺、改性戊二醛等交联剂交联胶原进行胶原蛋白海绵的制备。采用重组胶原蛋白在很大程度上减少了提取过程的不利因素，进而获得纯度较高、性能稳定的胶原蛋白。为了胶原蛋白海绵使用时的稳定性及机械性能要求，使用高浓度胶原蛋白液低温冻干成型制备胶原蛋白海绵，可以保证胶原蛋白的生物活性，基本满足临床需求。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种利用高浓度重组胶原蛋白快速制备胶原蛋白海绵的方法。本发明制备的胶原蛋白海绵具有均匀致密性、热变性温度高、对细胞生长影响小的胶原蛋白海绵。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种制备重组胶原蛋白海绵的方法，所述制备方法包括以下步骤：
7.(1)将表达核苷酸序列如seq id no.1所示的编码类人胶原蛋白基因的基因工程菌接种于培养基中经诱导表达后，离心获得发酵上清液；
8.(2)向发酵上清液中加入硫酸铵i，冰浴，离心取上清；
9.(3)向上清液中加入硫酸铵ii，冰浴，离心收集沉淀；
10.(4)用透析液溶解沉淀置于透析袋中，在透析液中进行透析，获得纯化的胶原蛋白；
11.(5)将纯化的胶原蛋白置于冰上静置；
12.(6)将静置后的胶原蛋白冷冻冻干获得重组胶原蛋白海绵。
13.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的基因工程菌以毕赤酵母为宿主。
14.在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母包括gs115。
15.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述硫酸铵i的终浓度为15～25％。
16.在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述硫酸铵ii的终浓度为55～65％。
17.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中所述透析液为超纯水。
18.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中所述透析在冰浴中进行，每4-6h更换一次超纯水，共换4-6次。
19.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中透析袋分子量采用8-10kda。
20.在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中所述静置的时间为10～24h。
21.本发明还提供了一种胶原蛋白海绵，所述胶原蛋白海绵为采用所述方法制备得到。
22.本发明还提供了所述制备重组胶原蛋白海绵的方法或所述胶原蛋白海绵在化工、材料和医药领域中的应用。
23.本发明的有益效果：
24.本发明操作简便，基于重组胶原蛋白的制备基础上进行低温静置凝胶即可获得重组胶原蛋白海绵。本发明通过非交联的方式获得高强度的胶原蛋白海绵，利用高浓度胶原蛋白液所制备形成的胶原蛋白海绵具有较高的机械强度和弹性，有助于其为细胞生长提供营养机制，更有临床修复创面的潜力。本研究获得的重组胶原蛋白海绵具有热稳定性，其热变性温度高，以保证其在常温及干热条件下保持生物活性，有利于生物医学材料的制备和临床应用。本研究制备的重组胶原蛋白海绵结构均一，为多孔片状结构，且细胞毒性小。
附图说明
25.图1：本发明中重组胶原蛋白凝胶在冰浴和常温条件下的不同状态。
26.图2：本发明中重组胶原蛋白海绵外观图。
27.图3：本发明中重组胶原蛋白海绵内部结构图(扫描电镜)。
28.图4：本发明中重组胶原蛋白海绵的热变性温度曲线(dsc)。
29.图5：本发明中重组胶原蛋白海绵采用mtt法对细胞的体外毒性检测。a为添加不同含量的胶原蛋白细胞数量与空白对照数量的比值；b和c分别为细胞空白对照和添加胶原蛋白海绵后的细胞形态。
具体实施方式
30.以下结合说明书附图和具体实施例来说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域的常规试剂、方法和设备。
31.下述实施例中涉及到的培养基如下：
32.培养基均使用去离子水配制，配制完成后121℃灭菌15～20min。
33.lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。加入20g/l琼脂粉，以配制lb固体培养基。
34.ypd培养基：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l。加入20g/l琼脂粉，以配制ypd固体培养基。
35.md培养基：去离子水798ml/l，加入20g/l琼脂粉；倒板前加入体积分数10％的10
×
ynb酵母基础氮源母液，体积分数10％的10
×
ynb酵母基础氮源母液，葡萄糖20g/l，以配制md固体培养基。
36.罐上培养基：85％h3po
4 26.7ml/l；caso4·
2h2o 1.175g/l；k2so
4 18.2g/l；mgso4·
7h2o14.9g/l；koh 4.13g/l；甘油40.0g/l；ptm1 4.35ml/l。培养基灭菌后用氨水调ph至5.2；其中，ptm1为微量元素，每升溶液中含如下成分：cuso4·
5h2o 6.0g；nai 0.08g；mnso4·
h2o3.0g；na2moo4·
2h2o 0.2g；硼酸0.02g；cocl
2 0.5g；zncl
2 20.0g；feso4·
7h2o 65.0g；生物素0.2g；硫酸5.0ml。补料流加50％甘油和分析纯甲醇。
37.实施例1重组胶原蛋白宿主菌通过5-l发酵罐发酵
38.(1)重组表达载体ppic9k-hhlc的构建
39.将核苷酸序列如seq id no.1所示的编码类人胶原蛋白的基因通过ecori和noti两个酶切位点整合到ppic9k载体上，通过热激方法转化到宿主菌株e.coli top10中，涂布于含有氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养过夜，筛选并挑取阳性克隆子，用含氨苄青霉素的lb液体培养基进行培养。采用质粒小提试剂盒提取质粒，得到重组表达载体ppic9k-hhlc。
40.(2)重组基因工程菌的构建
41.在37℃条件下，利用saci限制性内切酶线性化步骤(1)构建的重组表达载体ppic9k-hhlc，孵育1h后获得线性化片段，通过pcr纯化试剂盒对线性化片段进行纯化和回收得ppic9k-hhlc线性化质粒。将纯化后的线性化质粒通过电转化方式转入毕赤酵母gs115感受态细胞，并涂布于md平板上，在30℃静置培养3-5天。挑选阳性克隆子分别接种到含有1、2、3、4mg/ml g418的ypd平板上，置于30℃培养3-5天，挑选在不同浓度均可生长的阳性克隆子进行诱导表达，获得多拷贝数的重组毕赤酵母工程菌gs115/ppic9k-hhlc。
42.(3)5l发酵罐发酵
43.将gs115/ppic9k-hhlc单菌落接种于200ml ypd培养基中，30℃，220rpm条件下培养16-20h获得种子培养液。在5-l发酵罐上采用do-搅拌偶联模式进行发酵生产，将种子培养液按体积比10％接种于2l罐上培养基中进行培养，初始转速300rpm，进行do-搅拌偶联模式下进行，最高转速为800rpm；通气量为2vvm；生长期培养温度为30℃，菌株生长过程补加氨水维持发酵液ph稳定在5.2。当do快速上升时补加50％甘油，当湿菌体质量为180-210g/l时，停止流加甘油并使保持菌株饥饿状态2-3h后，将发酵罐温度调到22℃，进入甲醇诱导阶段，并维持到诱导表达结束。诱导过程中甲醇补充采用分阶段流加方式，从1ml/l/h低速开始流加甲醇，使其最终流速为6-7ml/l/h，do维持在20％左右，do-搅拌偶联模式，设置转速下限为300rpm，上限为800rpm，通气量为2.5vvm，温度下降至22℃，连续培养96-108h后，发酵液在5000rpm条件下离心30min，收集发酵上清液，胶原蛋白产量可达2.33g/l。
44.实施例2重组胶原蛋白海绵的快速制备方法
45.(1)蛋白纯化
46.将实施例1中的发酵上清液置于4℃条件下，以4500rpm离心30min，收集上清液。在上清液中，加入20％硫酸铵于冰浴中进行沉淀6-8h后，在4℃下进行高速离心(10000rpm，5min)以去除杂蛋白，收集上清液。
47.在上清液中加入终浓度为60％硫酸铵，于冰浴中进行过夜沉淀。在4℃条件下高速10000rpm，离心5min，收集沉淀。
48.用超纯水溶解沉淀后，加入到8-10kda的透析袋中，在冰浴条件下于超纯水中进行
透析，每4-6h换一次超纯水(透析液)，共换4-6次。此时，可以获得高浓度的重组胶原蛋白溶液。
49.(2)制备胶原蛋白海绵
50.将步骤(2)透析后的胶原蛋白溶液加入到12孔板中，每孔加2-3ml，于冰上静置10-24h。该凝胶在冰浴中可以形成凝胶，在加热或室温下则变澄清(图1)。此时凝胶的蛋白浓度约为20-25mg/ml。
51.将凝胶后的胶原蛋白置于-80℃进行冷冻，并用冷冻干燥机冻干获得重组胶原蛋白海绵(图2)。
52.实施例3扫描电镜重组胶原蛋白海绵的内部结构
53.通过扫描电子显微镜(fei quanta 200,thermos)观察重组胶原蛋白海绵的结构和表面形貌。撕取一片海绵固定在样品台上，喷金后在5.0kv加速电压下观察(图3)。本发明的方法制备得到的重组胶原蛋白海绵内部成片层状，多孔洞，且孔洞分布成纤维带状排布。采用重组胶原蛋白制备的海绵相对于该重组胶原蛋白冻干样品有更强的手触弹性和结构稳定性，原蛋白的冻干粉末无法用镊子完整夹取，而胶原蛋白海绵可以用镊子完整夹起，且捏起来更有弹性，加之其多孔结构有助于承载空气流动，对于药物负载具有潜力。
54.实施例4重组胶原蛋白海绵的热稳定性
55.采用dsc测量法(q200,ta)对重组胶原蛋白海绵的热稳定性进行了评价。升温速度维持速率为5℃/min，温度范围为40～200℃。取2-5mg样品密封在铝锅中，用空坩锅作为加热参考，结果如4所示，制备得到的重组胶原蛋白海绵的变性温度td为134.18℃(图4)。通过动物组织提取的胶原蛋白通常热变性温度较低，大部分为25-40℃，仅有少部分来源的胶原蛋白热变性温度可以到80℃左右，这大大限制了其在储存和制备过程中的应用。本发明的胶原蛋白海绵具有较高的热稳定性能，可以满足绝大多数的生产、储存和应用需求。
56.实施例5重组胶原蛋白海绵的体外细胞毒性评价
57.向实施例2获得的重组胶原蛋白海绵中加入胶原蛋白海绵用培养基(dmem 10％fbs)配置成5mg/ml初始溶液，并使用培养基进一步稀释至2、4、8倍，用0.22μm滤膜过滤，以用于mtt法进行细胞毒性实验。
58.利用c2c12细胞进行体外细胞毒性评价，将c2c12细胞接种于96孔板(dmem 10％fbs培养基，细胞密度为10
×
105/ml，100μl/孔)，置于37℃含5％co2的培养箱中培养至细胞贴壁或培养8h，吸尽上清。设置空白对照组(bc)和不同浓度胶原添加组(ca)，空白对照组仅为新鲜培养基，不同浓度胶原添加组为添加100μl含不同稀释倍数胶原蛋白海绵的新鲜培养基。
59.96孔板与所有样品在37℃、5％co2条件下孵育，取出一板细胞在培养8h后每孔加入10mg/ml mtt溶液10μl。继续培养4h后，1500rpm离心5min，取上清。在每孔中加入等体积的二甲基亚砜200μl，摇匀使其完全溶解。通过酶标仪测量od
490nm
，根据以下公式计算细胞毒性。显微镜下观察胶原蛋白海绵添加组和空白对照组细胞形态。
60.相对增长率(％)＝od蛋白/od空白
×
100％。
61.结果如图5所示，加入添加5mg/ml以内浓度的胶原蛋白可以维持细胞85％的相对增长速度，细胞形态上并未看到明显的抑制或促进作用。说明该胶原蛋白海绵对细胞的毒害性小。
62.本发明提供了一种利用重组胶原蛋白制备重组胶原蛋白海绵的快速制备方法，制备过程简单，使用材料获得稳定且没有病原性和毒素的污染，设备要求低，效率高，成本可控。且按照本发明中方法制备得到的重组胶原蛋白海绵外形规整光滑，质地均一致密，有弹性；热稳定性好，适合常温高温条件下使用；此外对细胞生长毒性小，适合临床的开发应用。
63.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。