一种多分散液滴数字核酸检测方法及其应用

1.本发明属于基因检测领域，具体涉及一种多分散液滴数字核酸检测方法及其应用。


背景技术：

2.核酸检测是传染病预防、诊断和监测的重要手段。相关技术中，对于核酸检测的方法包括实时定量聚合酶链式反应(qpcr)和核酸等温扩增技术等。其中，实时定量聚合酶链式反应(qpcr)是临床上核酸检测和定量的金标准。尤其是随着微流控技术的发展，数字pcr也逐渐成为新一代的绝对定量pcr技术。除此之外，核酸等温扩增技术，如环介导等温扩增(lamp)、滚环扩增(rca)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、链置换扩增(sda)、序列依赖的核酸扩增(nasba)、解旋酶依赖扩增(hda)等也均因为不需要温度循环，对仪器的依赖性低，灵敏度高、选择性好等优势被逐渐应用在各领域中。而其他技术，如基于规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)技术(如sherlock、detectr)，也因其快速又灵敏的特性备受关注。但在实际使用中，基于crispr的方法虽然被用于与核酸扩增技术结合，实现高灵敏度的检测，但由于反应温度和缓冲液成分浓度的差异，这种结合往往被分为多段进行，无法实现一步检测，既增加了实验操作难度，又增大了交叉污染的可能性。而且，这种分段式操作也使得这些方法不适用于数字化的核酸检测当中，限制了其应用。而且，当前已有的单分散液滴的制备方法操作复杂，耗时长，易出现死体积，造成试剂的浪费。不利于数字化核酸检测技术的有机结合。
3.因此，开发一种能够与数字化的核酸检测结合的一步式核酸检测技术，将对于核酸检测的稳定性、高通量性和高灵敏度提供有力的技术支持。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种多分散液滴数字核酸检测方法，本发明中的检测方法能够通过简易操作快速地将反应试剂分割成独立的液滴，降低了对复杂仪器的要求。而且通过这种快速的乳液分割有效地避免在试剂分割之前进行的核酸扩增或cas蛋白对靶标的切割。与单分散液滴相比，同一目标分子浓度下，多分散液滴所需要的样品体积更少，检测过程方便、快速、灵敏度高。即使不结合预扩增过程，基于多分散液滴的crispr检测方法也能达到am水平的检测灵敏度。
5.本发明的第一个方面，提供一种多分散液滴数字核酸检测方法，包括如下步骤：将油相溶液、检测样品和检测试剂混合，分散为液滴并孵育后，根据阳性液滴的数量以及体积，定量检测样品中的目标核酸分子。
6.数字式核酸检测方法是将包含目标分子的反应液分散成成千上万个小腔室，使得每个腔室只包含一个或零个目标分子。反应之后，根据荧光强度可区分阳性与阴性腔室，通过腔室的总数与阳性腔室的总数和体积，可以实现准确定量。由于限域效应，目标分子在腔室中的浓度升高，使得数字化的检测方法比本体检测更加灵敏。而其计数方式使其能够实
现目标核酸的绝对定量。
7.本发明中的检测方法相对于基于当前已有的单分散液滴的检测方法，其操作简单、用时短，不容易出现死体积，有效避免了试剂的浪费，提高检测灵敏度以及定量准确性。
8.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂为恒温扩增检测试剂。
9.在本发明的一些实施方式中，所述恒温扩增检测试剂包括引物、酶、显色液、dntp。
10.当然，本领域技术人员根据实际使用需求，可以合理选择特定的恒温扩增检测试剂，包括但不限于lamp、rpa、rca、nasba、sda等恒温扩增反应，以配合本发明中的检测方法实现核酸检测的目的。
11.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂为crispr-cas反应体系试剂。
12.在本发明的一些实施方式中，所述crispr-cas反应体系试剂包括cas蛋白、crrna。
13.当然，本领域技术人员根据实际使用需求，可以合理选择特定的crispr-cas反应体系试剂，以配合本发明中的检测方法实现核酸检测的目的。
14.在本发明的一些实施方式中，所述crispr-cas反应体系包括crispr-cas12a反应体系、crispr-cas13a反应体系。
15.当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，选择其他的crispr-cas反应体系进行替代使用，包括但不限于crispr-cas12a、crispr-cas13a、crispr-cas14。
16.在本发明的一些实施方式中，所述油相溶液包括氟油、碳油。
17.当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择所适用的油相溶液，包括但不限于上述的氟油、碳油。
18.在本发明的一些实施方式中，所述油相溶液还包括表面活性剂。
19.在本发明的一些实施方式中，所述表面活性剂包括span 80、tween 20、abil em90、abil em180。
20.当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择适当的表面活性剂与对应的油进行复配使用，包括但不限于上述span 80、tween 20、abil em90、abil em180。
21.在本发明的一些实施方式中，所述油相溶液具体为90％(v/v)棕榈酸异丙酯和10％abil em180的混合溶液。
22.在本发明的一些实施方式中，通过如下式(1)～(4)中的至少一个定量计算目标核酸分子，
[0023][0024]
[0025][0026][0027]
其中，各式中，n代表液滴总数，b代表阴性液滴总数，v代表液滴的体积，λ代表待测样品的浓度，p表示阳性液滴的概率，m代表液滴尺寸种类(》20000)，x代表阳性液滴尺寸种类，ni代表某一体积液滴的总数，bi代表某一体积液滴中阴性的总数，vi代表某一液滴的体积，vj代表体积唯一化后的液滴体积。
[0028]
在本发明的一些实施方式中，式(1)为当液滴为均一体积时，阳性液滴的概率计算公式。而式(2)则是基于式(1)推导得到的多分散情况下阳性液滴的概率计算公式。而对式(2)求一介导等于零，即可得到使得阳性液滴概率最大时的浓度，这一计算公式则为上述式(3)。进一步假设在多分散液滴下，每个液滴的体积都是唯一的，即可将式(3)化简为式(4)。
[0029]
在本发明的一些实施方式中，所述检测方法还包括在油相溶液、检测样品和检测试剂混合后进行分散。
[0030]
在本发明的一些实施方式中，所述分散包括振荡分散、吹吸分散、搅拌分散、超声分散。
[0031]
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，采用其他简易分散方式进行分散，包括但不限于上述振荡分散、吹吸分散、搅拌分散、超声分散。
[0032]
在本发明的一些实施方式中，振荡频率为2000-2500rpm，振荡时间为1-5s。
[0033]
在本发明的一些实施方式中，振荡频率为2500rpm，振荡时间为1s。
[0034]
在本发明的一些实施方式中，吹吸次数为4-7次。
[0035]
在本发明的一些实施方式中，吹吸次数为4次。
[0036]
振荡的时间长短与振荡频率有关，吹吸次数与不同量程的枪头有关，因此，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理调整振荡的时间长短以及吹吸次数，以获得相似的分散效果。
[0037]
在本发明的一些实施方式中，具体分散方式为：将油相溶液与目标分子、检测反应试剂混合后，在涡旋振荡器上振荡1－5秒或移液枪吹吸4-7次，从而可将试剂快速分割成多分散液滴。
[0038]
现有技术中的样品的分割主要通过微流控芯片、毛细管和不混溶相的切割等技术来实现，然而这些方法都存在一些无法避免的问题。如微流控芯片的制造需要复杂而又精密的仪器，且依赖于有经验的工作人员。液滴的大小和均匀性与仪器的稳定性、通道大小、微细加工的精度以及连续相的黏度等等因素相关。这些方法需要专门的仪器和复杂的操作步骤，将导致检测的时间和成本提高。并且长时间的液滴制备过程会导致核酸的提前扩增以及不希望的酶反应，导致最后结果定量不准确。而本发明利用涡旋振荡器振荡数秒或移液枪反复吹吸，使反应试剂在油相中快速形成体积不一的多分散液滴，同样适用于各种核
酸检测方法中。
[0039]
在本发明的一些实施方式中，当采用基于多分散液滴的恒温扩增核酸检测方法时，其检测步骤为：将检测样品与lamp反应体系混合后，迅速加入适量的油相溶液进行覆盖。以最大的振荡频率2500rpm振荡1～2s后进行恒温扩增，收集荧光信号，计算阳性液滴的体积，定量样品中目标分子的浓度。
[0040]
在本发明的一些实施方式中，当采用基于多分散液滴的crispr-cas免扩增核酸检测技术时，其检测步骤为：将检测样品与crispr-cas反应体系混合后，迅速加入适量的油相溶液进行覆盖。以2500rpm振荡1～2s后，收集荧光信号，计算阳性液滴的数量以及体积，定量样品中目标分子的浓度。
[0041]
本发明的第二个方面，提供一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储有计算机可执行指令，用于执行本发明第一个方面所述的检测方法。
[0042]
本发明的第三个方面，提供一种核酸检测系统，所述系统中输入有本发明第一个方面所述的检测方法。
[0043]
本发明的有益效果是：
[0044]
1.本发明在样品的分割上不再如现有技术中采用复杂的微流控系统、芯片或仪器产生均一的液滴，且不需要复杂操作，对设备依赖程度低，可在几秒内完成生成试剂的快速分割，液滴集中在50μm以下。
[0045]
2.本发明中的样品需求量和试剂损耗量低，所需的试剂总量在5μl以下，没有传统数字核酸检测方法中的死体积问题，灵敏度更高，定量更准确，亦不会造成试剂浪费，降低了实验成本。
[0046]
3.本发明是通过快速的乳液分割，有效地避免在试剂分割之前进行的核酸扩增或cas蛋白对靶标的切割，并基于液滴数量以及尺寸计算目标核酸浓度，检测灵敏度可达到am水平。
附图说明
[0047]
图1为本发明实施例中的多分散液滴核酸检测方法流程示意图。
[0048]
图2为本发明实施例中的多分散液滴核酸检测方法生成的液滴大小分布，其中，a为振荡分散，b为吹吸分散。
[0049]
图3为本发明实施例中的基于多分散液滴的恒温扩增核酸检测方法的液滴明场(a)和荧光场(b)图像。
[0050]
图4为本发明实施例中的基于多分散液滴的crispr-cas免扩增核酸检测方法的空白对照液滴(a)和含有目标分子的阳性液滴(b)图像。
[0051]
图5为本发明实施例中的基于多分散液滴的crispr-cas12a免扩增dna检测方法的灵敏度测试，a为不同浓度下的对比图，b为同一浓度下的对比图。
[0052]
图6为本发明实施例中的基于多分散液滴的crispr-cas13a免扩增rna检测方法的灵敏度测试，a为不同浓度下的对比图，b为同一浓度下的对比图。
[0053]
图7为本发明实施例中的基于多分散液滴的crispr-cas12a/cas13a免扩增双基因(dna与rna)同时检测方法的测试，a为体系中存在dna与rna模板时fam和hex荧光通道的液滴图像，b为体系中存在dna与rna模板时各通道阳性液滴的统计结果。
具体实施方式
[0054]
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
[0055]
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
[0056]
一种多分散液滴数字核酸检测方法
[0057]
检测流程如图1所示。本发明实施例中的多分散液滴数字核酸检测方法检测原理为：本发明实施例中的核酸检测方法主要是基于多分散液滴与核酸等温扩增技术结合实现的核酸检测。
[0058]
其中，多分散液滴是利用特定的油相溶液包覆目标分子和检测反应试剂得的。
[0059]
检测反应试剂包括本领域中常规的核酸检测试剂，如dntps、特异性引物、探针、聚合酶等成分，也包括基于crispr-cas系统下的非扩增技术相关试剂，如cas12a或cas13a相关蛋白、crrna、检测缓冲液。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他的核酸检测试剂，包括但不限于上述的dntps、特异性引物、探针、聚合酶、cas12a或cas13a相关蛋白、crrna、检测缓冲液。
[0060]
而对于油相溶液，其可以采用本领域中单一性的油相溶液，如氟油、碳油等，也可以将其与表面活性剂复配得到。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择所适用的油相溶液，包括但不限于上述的氟油、碳油。而对于表面活性剂的选择，在本发明实施例中，具体采用的是非离子型表面活性剂，包括span80、tween20、abil em90、abil em180等。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择适当的表面活性剂与对应的油进行复配使用，包括但不限于上述span80、tween20、abil em90、abil em 180。
[0061]
其中，对于多分散液滴的具体制备方法，具体为：将油相溶液与目标分子、检测反应试剂混合后，在涡旋振荡器上振荡1－5秒或移液枪吹吸4-7次，从而可将试剂快速分割成多分散液滴。但需要注意的是，振荡的时间长短与振荡频率有关，吹吸次数与不同量程的枪头有关，因此，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理调整振荡的时间长短以及吹吸次数，以获得相似的分散效果。
[0062]
而当形成了多分散液滴后即可送至温控装置中进行孵育扩增。所用温控装置包括但不限于pcr仪、恒温仪、恒温水浴、恒温培养箱。在孵育结束后，通过荧光显微镜或基于手机的简易装置读取阳性液滴并记录其明场位置，计算阳性液滴的体积以及个数。
[0063]
其中，对于检测的目标分子原始浓度的计算方式为：
[0064]
当液滴为均一体积时，阳性液滴的概率为：
[0065][0066]
其中，式(1)中，n代表液滴总数，b代表阴性液滴总数，v代表液滴的体积，λ代表待测样品的浓度，p表示均一体积时阳性液滴的概率。
[0067]
由此推导得到多分散情况下，阳性液滴的概率为：
[0068][0069]
其中，式(2)中，ni代表某一体积液滴的总数，bi代表某一体积液滴中阴性的总数，
vi代表某一液滴的体积，λ代表待测样品的浓度，p表示多分散情况下阳性液滴的概率。
[0070]
对式(2)求一介导等于零，即可得到使得阳性液滴概率最大时的浓度，具体公式为：
[0071][0072]
其中，式(3)中，ni代表某一体积液滴的总数，bi代表某一体积液滴中阴性的总数，vi代表某一液滴的体积，λ代表待测样品的浓度，m代表液滴尺寸种类。
[0073]
进一步假设在多分散液滴下，每个液滴的体积都是唯一的，那么上式可化简为：
[0074][0075]
其中，式(4)中，vj代表体积唯一化后的液滴体积，λ代表待测样品的浓度，x代表阳性液滴尺寸种类。
[0076]
最后，根据样品的总体积以及显微镜读取得到的各个阳性液滴的体积，即可计算样品的浓度。
[0077]
基于上述理论得到的多分散液滴恒温扩增或crispr免扩增核酸检测技术，其中，采用多分散液滴crispr免扩增核酸检测技术时，其不仅不需要预先核酸扩增就能实现cas蛋白介导的核酸检测，还有效的避免了因扩增带来的假阳性或假阴性问题。而且，当采用多分散液滴crispr免扩增核酸检测技术时，其相对于多分散液滴恒温扩增核酸检测技术的优势在于：由于目标分子没有进行扩增反应放大信号，因此不能保证每个核酸模板都产生信号，因此采用测定标准曲线进行定量，该方法检测线性范围为0.1-100fm，因此，能够相对灵敏的检测各类核酸分子。
[0078]
实施例1基于多分散液滴的恒温扩增核酸检测方法
[0079]
在本实施例中，使用基于多分散液滴的恒温扩增核酸检测方法对目标分子进行检测。
[0080]
具体检测步骤如下：
[0081]
1)将总计3μl的包含目标分子的lamp反应体系转移至ep管中，迅速向ep管中加入适量的油相溶液进行覆盖。
[0082]
其中，在本实施例中，目标分子具体为含有新冠病毒n基因dna的pef-nsp125-3ha质粒(质粒的构建方法参考本领域常规技术手册进行，其中，新冠病毒n基因dna是经由新冠病毒n基因rna(数据库编号为nc-045512)反转录得到)；具体的lamp反应体系如表1所示。
[0083]
表1
[0084]
组分体积(μl)最终浓度dntps1.51.2mm引物组共0.751
×
lamp dye0.251
×
mg
2
1.2510mmbst 2.00.75480u/mlisothermal buffer1.251
×
质模板粒130.3pg/μlh2o5.5 [0085]
其中，引物的具体核苷酸序列为：
[0086]
fip：5
’‑
gcggccaatgtttgtaatcagtagacgtggtccagaacaa-3’(seq id no:1)；
[0087]
bip：5
’‑
tcagcgttcttcggaatgtcgctgtgtaggtcaaccacg-3’(seq id no:2)；
[0088]
f3：5
’‑
gctgctgaggcttctaag-3’(seq id no:3)；
[0089]
b3：5
’‑
gcgtcaatatgcttattcagc-3’(seq id no:4)；
[0090]
loop f：5
’‑
ccttgtctgattagttcctggt-3’(seq id no:5)；
[0091]
loop b：5
’‑
tggcatggaagtcacacc-3’(seq id no:6)。
[0092]
在本实施例中，油相溶液具体为90％(v/v)棕榈酸异丙酯和10％abil em180的混合溶液。
[0093]
2)以2500rpm振荡1s，lamp体系被分割成大小不一的液滴。使用显微镜进行观察，发现液体尺寸主要分布在10-50μm(如图2所示)。
[0094]
3)将生成的液滴转移至恒温仪中进行扩增(温度控制在60－65℃，反应时长为30－60分钟)。然后使用荧光显微镜收集液滴的信号，并记录同一视野下的明场，确定阳性液滴的体积。根据上述实施例中的公式(1)～(4)和阳性液滴体积，计算样品中目标分子的浓度。
[0095]
其中，阳性液滴的判定方法为：将空白对照组液滴的平均荧光强度与3倍标准偏差之和设置为阳性液滴的阈值，当检测发现超过此阈值的液滴时，即认定为阳性液滴。
[0096]
结果如图3所示。
[0097]
当目标分子为新冠病毒n基因dna(质粒浓度为30.3pg/μl)为例，采用实施例1中的基于多分散液滴的恒温扩增核酸检测方法进行检测，可以发现，在明场和荧光场下能够明显看出液滴的形成以及阳性液滴的表征，从而说明在至少30.3pg/μl的模板质粒浓度下，上述方法具有极好的分辨率以及检测灵敏度。
[0098]
实施例2基于多分散液滴的crispr-cas免扩增核酸检测方法
[0099]
在本实施例中，使用基于多分散液滴的crispr-cas免扩增核酸检测方法对目标分子进行检测。
[0100]
在本实施例中，所用的crispr-cas系统选择为crispr-cas12a，当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他crispr-cas系统进行替代。
[0101]
具体检测步骤如下：
[0102]
1)将待测目标分子与crispr-cas12a检测试剂按照表2所示组成在ep管中进行混合后，迅速向ep管中加入适量的油相溶液进行覆盖。
[0103]
其中，在本实施例中，目标分子具体为新冠n基因dna；具体的crispr-cas反应体系如表2所示。
[0104]
表2
[0105]
组分体积(μl)最终浓度
cas12a0.5200nmcrrna1.25250nmreporter1.251μmbuffer1.251
×
dna模板1.2510fmh2o7 [0106]
其中，在本实施例中，crrna的具体核苷酸序列为：5
’‑
uaauuucuacuaaguguagaucccccagcgcuucagcguuc-3’(seq id no:7)。模板dna序列:5
’‑
atgcgcgacattccgaagaacgctgaagcgctgggggcaaattgtgcaat-3’(seq id no:8)。
[0107]
2)以2500rpm振荡1s，crispr-cas反应体系被分割成大小不一的液滴。使用显微镜进行观察，发现液体尺寸主要分布在10-50μm。
[0108]
3)将生成的液滴转移至恒温仪中进行crispr-cas切割(37－45℃，反应60－120分钟)。然后使用荧光显微镜收集液滴的信号，并记录同一视野下的明场，确定阳性液滴的数量体积。根据不同浓度下阳性液滴数量多少，绘制标准曲线。根据标准曲线，定量未知样品浓度。
[0109]
结果如图4～5所示。
[0110]
如图4所示，可以发现，在10fm模板浓度下，其阳性液滴能清楚的从镜检中被发现，并能够准确的被测定。
[0111]
如图5所示。发明人进一步调整模板的浓度范围(0(ntc)、102、103、104、105am)，并同时对于102am进行多次重复试验以验证检测技术的稳定(如图5b)，可以发现，本发明中的检测方法的检测灵敏度可达到102am且多次测定后结果稳定，均与对照组有显著差异性，说明本实施例中的检测方法的检测灵敏度高、稳定性好。
[0112]
实施例3基于多分散液滴的crispr-cas免扩增核酸检测方法
[0113]
在本实施例中，使用基于多分散液滴的crispr-cas免扩增核酸检测方法对目标分子进行检测。
[0114]
在本实施例中，所用的crispr-cas系统选择为crispr-cas13a，当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他crispr-cas系统进行替代。本发明可用的crispr-cas系统包括但不限于crispr-cas12a、crispr-cas13a。
[0115]
具体检测步骤如下：
[0116]
1)将待测目标分子与crispr-cas13a检测试剂按照表2所示组成在ep管中进行混合后，迅速向ep管中加入适量的油相溶液进行覆盖。
[0117]
其中，在本实施例中，目标分子具体为新冠n基因单链rna分子(nc-045512)；具体的crispr-cas反应体系如表3所示。
[0118]
表3
[0119]
组分体积(μl)最终浓度cas13a1.25100nmcrrna1.25100nmreporter1.25500nmbuffer1.251
×
template1.25500nmh2o6.25 [0120]
其中，在本实施例中，crrna的具体核苷酸序列为：5
’‑
gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaacuuugcggccaauguuuguaa-3’(seq id no:9)。模板rna序列为：5
’‑
aacacaagcuuucggcagacgugguccagaacaaacccaaggaaauuuuggggaccaggaacuaaucagacaaggaacugauuacaaacauuggccgcaaauugcacaauuugcccccagcgcuucagcguucuucggaaugucgcgcauuggcauggaaguc-3’(seq id no:10)。
[0121]
2)以2500rpm振荡1s，crispr-cas反应体系被分割成大小不一的液滴。使用显微镜进行观察，发现液体尺寸主要分布在10-50μm。
[0122]
3)将生成的液滴转移至恒温仪中进行crispr-cas切割(37－45℃，反应60－120分钟)。然后使用荧光显微镜收集液滴的信号，并记录同一视野下的明场，确定阳性液滴的数量与体积。根据不同浓度下阳性液滴数量多少，绘制标准曲线。根据标准曲线，定量未知样品浓度。
[0123]
结果如图6所示。
[0124]
如图6所示。发明人进一步调整模板的浓度范围(0(ntc)、101、102、103、104、105am)，并同时对于101am进行多次重复试验以验证检测技术的稳定(如图6b)，可以发现，本发明中的检测方法的检测灵敏度可达到101am且多次测定后结果稳定，均与对照组有显著差异性，说明本实施例中的检测方法的检测灵敏度高、稳定性好。
[0125]
实施例4基于多分散液滴的crispr-cas免扩增双基因检测方法
[0126]
在本实施例中，使用基于多分散液滴的crispr-cas免扩增核酸检测方法对dna、rna进行同时检测。
[0127]
在本实施例中，所用的crispr-cas系统选择为crispr-cas12a和crispr-cas13a，当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他crispr-cas系统进行替代。本发明可用的crispr-cas系统包括但不限于crispr-cas12a、crispr-cas13a。
[0128]
具体检测步骤如下：
[0129]
1)将待测目标dna/rna与crispr-cas12a/cas13a检测试剂按照表3所示组成在ep管中进行混合后，迅速向ep管中加入适量的油相溶液进行覆盖。
[0130]
其中，在本实施例中，dna目标分子具体为合成的双链dna序列，rna目标分子为合成的单链rna序列；具体的crispr-cas反应体系如表4所示。
[0131]
表4
[0132][0133][0134]
其中，在本实施例中，cas12a-crrna和cas13a-crrna为实施例2和实施例3中的crrna。
[0135]
2)以2500rpm振荡1s，crispr-cas反应体系被分割成大小不一的液滴。使用显微镜进行观察，发现液体尺寸主要分布在10-50μm。
[0136]
3)将生成的液滴转移至恒温仪中进行crispr-cas切割(37-45℃，反应60-120分钟)。
[0137]
结果如图7所示。
[0138]
如图7所示。模板dna和rna浓度为100fm，进行多次重复试验以验证检测技术的稳定，可以发现，本发明中的检测方法在体系中含有模板时，均与对照组有显著差异性，说明本实施例中的检测方法可以实现dna和rna的双基因检测。
[0139]
本发明实施例中的检测方法还可以通过计算机可读存储介质或检测系统的形式用于实际的检测作业中，通过执行相关指令，执行上述实施例中的检测方法，完成对特定核酸分子的检测。
[0140]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。