基于宏基因组学的农产品表面的微生物采样及检测方法

1.本发明涉及一种基于宏基因组学的农产品表面的微生物采样及检测方法，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.农产品表面定殖着多种微生物并保持动态平衡，微生物在物质合成、降解、碳氮元素循环等方面具有十分重要的生态功能。在农产品领域，对表面微生物进行检测可分析农产品的各项指标情况。然而微生物的种类和数量繁多，且大多数难以单独分离、培养和鉴定。对于农产品表面微生物的检出可以依赖于细菌培养技术、纯种细菌的分离技术和鉴定等传统的技术。传统的农产品微生物检验存在以下问题：由于培养条件导致样本培养阳性率低；由于样本检测种类有限，有时会无法检测到微生物或者不能同时检测到多种微生物，而如果进行多种检测，又会导致累计成本逐渐增高。而且通过这些方法做出实验结果所需时间长、操作繁琐、受培养条件和主观因素大且在现有的条件下有99％以上的微生物无法进行培养。
3.近年来，高通量测序技术的发展给微生物的研究带来了新的方法和策略，其在微生物基因组中的应用产生了宏基因组学(metagenome)这一新的学科。宏基因组是以居于同一环境中的所有微生物基因组为研究对象，通过对环境样品中的全基因组dna进行高通量测序，获得单个样品的饱和数据量，基于denovo组装进行微生物群落结构多样性分析、微生物群体基因组成与功能分析以及特定环境相关的代谢通路分析等，从而进一步发掘和研究具有应用价值的基因及环境中微生物群落内部、微生物与环境间的相互关系。
4.目前大多数农产品微生物是采用16srrna检测技术，即利用特异性的引物对细菌16srrna基因进行pcr扩增，然后基于高通量测序技术对微生物进行识别和分析。16srrna基因普遍存在于原核微生物中，是研究原核微生物多样性应用最广泛的分子标记。与传统培养方法相比，该技术的最大优势在于无需培养，不受细菌生长环境限制，并且测序速度快，引物的通用性好，一对引物几乎能扩增全部的细菌。但16srrna测序选择性扩增目的基因片段获得的信息较少，即使经过不断优化也只能将细菌鉴定到属水平，无法获得种水平细菌的具体信息，例如结合分枝杆菌复合群由于菌种中间差异小，单独依靠16srrna并不能鉴定到具体的种，而且16srrna鉴定是基于pcr的鉴定，因此存在容易污染而获得假阳性的情况。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种基于宏基因组学的农产品表面的微生物采样及检测方法，通过后续宏基因组测序可获取微生物更精细的分类学信息和更详细的基因序列信息。
6.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于宏基因组学的农产品表面的微生物采样方法，步骤如下：
7.s1、使用一次性医用消毒棉签蘸取无菌生理盐水，在一次性灭菌规格板规定的区
域内进行采样；
8.s2、在农产品表面采集样品，取所述步骤s1所得棉签在每个区域打圈50次；
9.s3、将所述步骤s2所得采样后的棉签放入无菌pbw溶液中，4℃下保存备用。
10.进一步地，所述步骤s1中消毒为使用75％酒精消毒。
11.进一步地，所述步骤s1中的无菌生理盐水为：体积分数为0.9％生理盐水在121℃下，进行高压蒸汽灭菌15分钟制得。
12.进一步地，所述步骤s2中采集样品的区域大小为3cm*3cm。
13.进一步地，所述步骤s3中的无菌pbw溶液的制备方法为：取蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、蒸馏水1000g，调整ph值至7.4后，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
14.本技术还提供一种基于宏基因组学的农产品表面的微生物的检测方法，使用如上所述的基于宏基因组学的农产品表面的微生物采样方法进行采样，所述检测方法还包括以下步骤：
15.s4、样品预处理：将所述步骤s3得的pbw溶液及棉签振荡后取出所述棉签，离心收集下层菌液于收集管中，在所述收集管中添加溶菌酶混合均匀，并37℃孵育15min，形成样本溶液；
16.s5、核酸dna提取：使用所述步骤s4得到的样本溶液进行核酸dna的提取；
17.s6、高通量测序文库的构建：采用mgieasy酶切dna文库制备试剂套装进行样本dna文库构建；
18.s7、高通量测序并进行分析。
19.本发明的有益效果在于：本发明中采样过程不会对农产品表面造成损伤，避免了侵入性采样对农产品造成的刺激，安全性更高，适合农产品采样使用。且本方法收集到的生物量较大，后续最终获得的总dna浓度及质量能够达到微生物群落分析测序的要求。本技术还优化了样本预处理过程，使得核酸提取效率有所提高，结果更加准确；采用了酶切法构建高通量测序文库，相对于超声打断法，酶切法操作更为简单，样本损耗量更低，可以兼容更低的样本起始量。并且不需要使用特定的机械设备如covaris打断仪，能够降低建库的成本。基于宏基因组学的农产品表面微生物检测方法，可以实现对农产品表面不同类型的微生物同时检测，更大限度地涵盖到农产品表面种类广、数量多的微生物，具有良好的应用前景。
20.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
21.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
23.本发明提供一种基于宏基因组学的农产品表面的微生物采样方法，包括以下步骤：
24.s1、使用一次性医用消毒棉签蘸取无菌生理盐水，在一次性灭菌规格板规定的区域内进行采样；
25.s2、在农产品表面采集样品，取所述步骤s1所得棉签在每个区域打圈50次；
26.s3、将所述步骤s2所得采样后的棉签放入无菌pbw溶液中，4℃下保存备用。
27.其中，步骤s1中消毒为使用75％酒精消毒；无菌生理盐水为：体积分数为0.9％生理盐水在121℃下，进行高压蒸汽灭菌15分钟制得。步骤s2中采集样品的区域大小为3cm*3cm。步骤s3中的无菌pbw溶液的制备方法为：取蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、蒸馏水1000g，调整ph值至7.4后，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
28.本技术还提供一种基于宏基因组学的农产品表面的微生物的检测方法，包括以下步骤：
29.s1、使用一次性医用消毒棉签蘸取无菌生理盐水，在一次性灭菌规格板规定的区域内进行采样；
30.s2、在农产品表面采集样品，取所述步骤s1所得棉签在每个区域打圈50次；
31.s3、将所述步骤s2所得采样后的棉签放入无菌pbw溶液中，4℃下保存备用；
32.s4、样品预处理：将所述步骤s3得的pbw溶液及棉签振荡后取出所述棉签，离心收集下层菌液于收集管中，在所述收集管中添加溶菌酶混合均匀，并37℃孵育15min，形成样本溶液；
33.s5、核酸dna提取：使用所述步骤s4得到的样本溶液进行核酸dna的提取；
34.s6、高通量测序文库的构建：采用mgieasy酶切dna文库制备试剂套装进行样本dna文库构建；
35.s7、高通量测序并进行分析。
36.其中，步骤s1-s3同基于宏基因组学的农产品表面的微生物采样方法，此采样方法不会对农产品表面造成损伤，在一定程度上提高了安全性，且采样所采用的材料价廉易得，不会造成较高的成本损耗。
37.步骤s4具体为将步骤s3所得pbw溶液及棉签在涡旋振荡器上进行振荡2min后，取出棉签，高速离心机离心1min，速度14000r/min，离心后弃掉上清液，下层菌液转移到收集管中。向收集管中加入溶菌酶(加入量为待测样本溶液体积的1/50，溶菌酶浓度为50mg/ml)，然后充分混匀，于37℃孵育15min。需要说明的是，此处的离心设置数据可进行修改，使得溶液得以离心即可。步骤s4考虑到样本中可能存在革兰氏阳性菌等难以裂解的病原体，因此本发明在核酸提取前加入溶菌酶消化的步骤，可以提高核酸提取效率。
38.步骤s5采用qiaamp dna microbiome kit试剂盒进行dna提取，步骤s6采用mgieasy酶切dna文库制备试剂套装进行样本dna文库构建，使用qubit对pcr纯化后产物进行定量，使用agilent 2100对文库进行质控，采用的文库构建试剂盒是使用片段化酶对dna进行片段化，dna的损失较机械法(如超声打断)更小，同时片段化的速率也更快，提高了整个文库的构建效率。步骤s7采用pe100测序策略在bgiseq-500测序仪上进行测序，每个样本预估分配100m reads数据量，并使用centrifuge软件对高通量测序中获得的测序数据进行宏基因组比对分析，比对结果使用pavian进行可视化分析。
39.下面以具体实施例进行详细说明：
40.实施例1
41.具体的，相关制备及检测如下：
42.1、进行待测农产品表面微生物采样：
43.(1)、使用一次性医用消毒棉签蘸取无菌生理盐水，在一次性灭菌规格板规定的区域内进行采样；
44.(2)、选取一定的农产品作为实验对象，在农产品表面采集样品，取步骤(1)所得棉签在每个区域打圈50次；
45.(3)、将步骤(2)所得采样后的棉签放入无菌pbw溶液中，4℃下保存备用。
46.所述步骤(1)中消毒为使用75％酒精消毒，所述无菌生理盐水为：体积分数为0.9％生理盐水在121℃下，进行高压蒸汽灭菌15分钟制得。
47.所述步骤(2)中采集样品的区域大小为3cm
×
3cm，步骤(2)中的农产品为番茄。
48.所述步骤(3)中无菌pbw溶液的制备方法为：取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000g，调整ph值至7.4后，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
49.2、样品预处理
50.将步骤1所得pbw溶液及棉签在涡旋振荡器上进行振荡2min后，取出棉签，高速离心机离心1min，速度14000r/min，离心后弃掉上清液，下层菌液转移到收集管中。向收集管中加入溶菌酶(加入量为待测样本溶液体积的1/50，溶菌酶浓度为50mg/ml)，然后充分混匀，于37℃孵育15min。
51.3、核酸dna提取
52.采用qiaamp dna microbiome kit试剂盒进行dna提取，严格按照试剂盒说明书进行操作。具体操作步骤如下：
53.(1)、向起始量为1ml的样本溶液中加入500μl buffer ahl，室温下孵育30min，上下翻转；
54.(2)、10000
×
g离心10min，除去上清液；
55.(3)、加入190μl buffer rdd和2.5μl benzonase，充分混匀，37℃水浴中以600rpm孵育30min；
56.(4)、加入20μl proteinase k，在56℃水浴中以600rpm孵育30min，然后，慢速旋转收集管；
57.(5)、加入200μl buffer ahl，充分混匀，转移到病原体裂解管中，放入fastprep仪器中，速度为6.5m/s，45s，2次间隔5min，样品保存在冰上；
58.(6)、病原体裂解管以10000
×
g离心1min，将上清转移到新的离心管中。加入40μl proteinase k，旋涡搅拌，在56℃水浴中以600rpm孵育30min；
59.(7)、加入200μl buffer apl2，脉冲涡流混合30s，70℃孵育10min，并快速旋转试管；
60.(8)、将200μl乙醇加入到裂解液中，脉冲涡流搅拌20s，将约700μl的乙醇-裂解液混合物涂到qiaamp ucp mini旋转柱上，以6000
×
g的转速离心1min；
61.(9)、将qiaamp ucp mini旋转柱转移到新的收集管中，加入500μl aw1缓冲液，以6000
×
g转速离心1min；
62.(10)、将旋转柱放入一个新的2ml收集管中，丢弃滤液，加入500μl buffer aw2 ，以20000
×
g离心3min；
63.(11)、将旋转柱放入一个新的2ml收集管中，丢弃滤液，以20000
×
g离心1min；
64.(12)、将旋转柱放入一个新的1.5ml收集管中，加入50μl buffer ave ，室温孵育5min，6000
×
g离心1min以洗脱dna，所得液体即为样本核酸。
65.4、高通量测序文库的构建
66.采用mgieasy酶切dna文库制备试剂套装进行样本dna文库构建,实验流程如下(具体实验操作参照试剂说明书)：
67.4.1酶切打断：使用含片段化酶的反应体系将dna序列片段化
68.(1)、将提取的dna吸取到新的0.2ml pcr管中，体积应≤45μl，不足45μl部分用补充buffer补足；
69.(2)、取出frag buffer ii溶解并涡旋混匀，取出frag enzyme ii上下颠倒10次以上至充分混匀，瞬时离心后置于冰上待用；
70.(3)、在冰上配制酶切打断反应液，加入10μlfrag buffer ii和5μlfrag enzyme ii，用移液器吹打10次以上至完全混匀，瞬时离心后置于冰上待用；
71.(4)、用移液器吸取15μl配制好的酶切打断反应液加入步骤(1)的pcr管中，将移液器调至55μl，吹打10次以上至完全混匀，瞬时离心将反应液收集至管底；
72.(5)、提前按照以下反应条件设置pcr程序并运行，待温度降至4℃后，将步骤(4)所述pcr管置于pcr仪上，跳过第一步(4℃hold)开始30℃反应。若pcr仪不能实现跳过步骤，可设置4℃1min，待温度降至4℃后暂停，放入样本后开始；
73.表1：反应条件
[0074][0075]
(6)、反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底。
[0076]
4.2磁珠片段筛选/纯化
[0077]
(1)、提前30min取出dna clean beads置于室温，使用前充分震荡混匀。用移液器吸取36μl dna clean beads至4.1步骤(6)中的60μl打断产物中，充分混匀，室温孵育5min；
[0078]
(2)、瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，用移液器小心吸取上清至新的1.5ml离心管中；
[0079]
(3)、用移液器吸取12μl dna clean beads至步骤(2)的96μl上清中，充分混匀,室温孵育5min；
[0080]
(4)、瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清；
[0081]
(5)、保持离心管置于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取并丢弃上清；
[0082]
(6)、重复步骤(5)，尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干；
[0083]
(7)、保持离心管置于磁力架上，打开离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂；
[0084]
(8)、将离心管从磁力架上取下，加入43μl te buffer进行dna洗脱，用移液器轻轻吸打至少10次至完全混匀，室温孵育5min；
[0085]
(9)、瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，将41μl上清液转移到新的0.2ml pcr管中；
[0086]
(10)、磁珠片段筛选后的产量小于100ng，可直接进行步骤4.3。
[0087]
4.3末端修复以及添加da尾：对筛选/纯化后的dna片段进行末端修复并添加da尾
[0088]
(1)、取≤100ng的dna进行末端修复，体积应≤40μl，不足40μl部分用te buffer补足；
[0089]
(2)、冰上配制末端修复反应液，加入7.1μlerat buffer和2.9μlerat enzyme mix；
[0090]
(3)、用移液器吸取10μl配制好的末端修复反应液加入磁珠片段筛选或纯化后的40μl样本中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底；
[0091]
(4)、步骤(3)所述pcr管置于pcr仪上，按照以下条件进行反应：
[0092]
表2：反应条件
[0093][0094][0095]
(5)、瞬时离心将反应液收集至管底。
[0096]
4.4接头连接：使用连接酶反应体系，将高通量测序所需的接头序列连接在dna片段两端
[0097]
(1)、4.3步骤(5)的pcr管中加入5μl对应的mgieasy dna adapters或mgieasy dna adapters稀释液，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底；
[0098]
(2)、冰上配制接头连接反应液，加入23.4μlligation buffer和1.6μldna ligase；
[0099]
(3)、移液器缓慢吸取25μl配制好的接头连接反应液加入步骤(1)的pcr管中，涡旋震荡6次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底；
[0100]
(4)、将骤(3)所述pcr管置于pcr仪上，按照以下条件进行反应：
[0101]
表3：反应条件
[0102][0103]
(5)、时离心将反应液收集至管底；
[0104]
(6)、加入20μl te buffer至总体系100μl，全部转移到新的1.5ml离心管中。
[0105]
4.5连接产物纯化
[0106]
(1)、提前30min取出dna clean beads置于室温，使用前充分震荡混匀。用移液器吸取50μl dna clean beads至步骤3.4.6中的接头连接产物中，充分混匀，室温孵育5min；
[0107]
(2)、瞬时离心，将离心管置于磁力架，静置2-5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清；
[0108]
(3)、保持离心管置于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取并丢弃上清；
[0109]
(4)、重复步骤(3)，尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底的液体吸干；
[0110]
(5)、持离心管固定于磁力架上，打开离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂；
[0111]
(6)、将离心管从磁力架上取下，加入21μl te buffer进行dna洗脱，用移液器轻轻吸打至少10次至完全混匀，室温下孵育5min；
[0112]
(7)、瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，将19μl上清液转移到新的0.2ml pcr管中。
[0113]
4.6pcr扩增
[0114]
(1)、在冰上配制pcr反应液，加入25μlpcr enzyme mix和6μlpcr primer mix；
[0115]
(2)、用移液器吸取31μl配制好的pcr反应液加入4.5步骤(7)中的pcr管中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底；
[0116]
(3)、将步骤(2)所述pcr管置于pcr仪上，按照以下条件进行pcr反应：
[0117]
表4：反应条件
[0118][0119]
(4)、瞬时离心将反应液收集至管底；
[0120]
(5)、吸取全部反应液转移到新的1.5ml离心管中。
[0121]
4.7pcr产物纯化：获得高通量测序文库
[0122]
(1)、提前30min取出dna clean beads置于室温，使用前充分震荡混匀；
[0123]
(2)、吸取50μl dna clean beads至4.6步骤(5)中的pcr产物中，充分混匀，室温孵育5min；
[0124]
(3)、瞬时离心，将离心管置于磁力架，静置2-5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清；
[0125]
(4)、保持离心管置于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取并丢弃上清；
[0126]
(5)、重复步骤(4)，尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干；
[0127]
(6)、保持离心管固定于磁力架上，打开离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂；
[0128]
(7)、将离心管从磁力架上取下，加入32μl te buffer进行dna洗脱，用移液器轻轻吸打至少10次至完全混匀，室温下孵育5min；
[0129]
(8)、瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，将30μl上清液转移到新的1.5ml离心管中。
[0130]
4.8rcr产物质检：使用qubit对pcr纯化后产物进行定量，采用agilent2100对文库进行质控
[0131]
5.高通量测序
[0132]
采用pe100测序策略在bgiseq-500测序仪上进行测序，每个样本预估分配100m reads数据量。
[0133]
6.结果分析
[0134]
使用centrifuge软件对高通量测序中获得的测序数据进行宏基因组比对分析，比对结果使用pavian进行可视化分析。
[0135]
综上，发明中采样过程不会对农产品表面造成损伤，避免了侵入性采样对农产品
造成的刺激，安全性更高，适合农产品采样使用。且本方法收集到的生物量较大，后续最终获得的总dna浓度及质量能够达到微生物群落分析测序的要求。优化了样本预处理过程，使得核酸提取效率有所提高，结果更加准确。采用了酶切法构建高通量测序文库，相对于超声打断法，酶切法操作更为简单，样本损耗量更低，可以兼容更低的样本起始量。并且不需要使用特定的机械设备如covaris打断仪，能够降低建库的成本。本发明所提供的基于宏基因组学的农产品表面微生物检测方法，可以实现对农产品表面不同类型的微生物同时检测，更大限度地涵盖到农产品表面种类广、数量多的微生物，具有良好的应用前景。
[0136]
以上所述实施例的各技术特征以及各检测项目可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0137]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。