一株抑制植物病原菌的葡萄园有孢汉逊酵母MP261及其应用

一株抑制植物病原菌的葡萄园有孢汉逊酵母mp261及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株抑制植物病原菌的葡萄园有孢汉逊酵母mp261及其应用。


背景技术：

2.由真菌、卵菌和细菌引起的植物病害在全球范围内都广泛存在，影响农作物和经济作物的产量和品质。为防治这些植物病害，人们通过化学防治、农业防治和生物防治等手段来抑制植物病原菌的生长。化学防治作为最常用的防治手段虽然具有高效的特点，却有造成致病菌产生抗药性、农药残留污染环境和危害人体健康等弊端。
3.生物防治主要是利用生防细菌、生防真菌、生防放线菌、植物诱抗剂来进行防治，具有环境友好、无毒无污染的特点。生物防治中的生防酵母因其具有生长繁殖能力强、遗传稳定、广谱抗菌性、不产生对人体有害的代谢产物等优点越来越受到人们的关注。
4.青枯雷尔氏菌作为土传性植物病原菌，可引起植物细菌性青枯病。其寄主范围广、分布范围广、危害严重，被称为植物的“癌症”。青枯雷尔氏菌在合适的营养条件下，可合成的胞外多糖，胞外多糖被认为是其重要的致病因子。
5.烟草疫霉和辣椒疫霉为常见的疫霉病病原菌。烟草疫霉分布广泛，已在五大洲的多个生态位分离出来，可引起烟草黑胫病，是典型的土传根茎病害，多发于成株期，少数发生在苗床期，我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上，仅次于烟草病毒病。辣椒疫霉引起的辣椒疫病，在高温高湿条件下传播速度尤为快，可引起辣椒的减产甚至绝产，并且其寄主范围广范，严重威胁蔬菜瓜果的产量。
6.灰葡萄孢菌引起灰霉病是一种世界性的植物真菌病害。链格孢菌是一种营腐生生活的病原真菌，它可以使很多重要的经济作物，包括马铃薯、梨、柑橘、烟草等产生不可逆转的病害。禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦生产上的重要病害，其不仅造成经济损失并且病原菌还会产生多种真菌毒素危害人畜健康。尖孢镰刀菌可引起多种农作物枯萎病的土传真菌病害。多主棒孢霉可引起芝麻、莲藕、黄瓜等植物患叶斑病。
7.目前控制植物病害主要还是采用化学防治手段，但是其长期大量使用农药会造成环境污染和药物残留问题。开发生物杀菌剂进行生物防治是我国农业要向着健康可持续方向发展之一。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供了一株抑制植物病原菌的葡萄园有孢汉逊酵母mp261及其应用。本发明通过筛选获得了一株能够强烈抑制多种植物病原菌生长的葡萄园有孢汉逊酵母mp261菌株，该菌或其产生的挥发性气体可以用于制备生防制剂来防治植物病害，具有良好的发展前景。
9.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
10.本发明提供了一株抑制植物病原菌的葡萄园有孢汉逊酵母mp261，其分类命名为
葡萄园有孢汉逊酵母hanseniaspora vineae，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 2022262。
11.进一步的，所述葡萄园有孢汉逊酵母mp261的26s rdna的核苷酸序列如seq id no.3所示。
12.进一步的，所述葡萄园有孢汉逊酵母mp261的菌落呈乳白色，表面干燥、无光泽、中间突起。
13.本发明还提供了所述的葡萄园有孢汉逊酵母mp261在用于制备植物病原菌抑制剂中的应用。
14.进一步的，所述植物病原菌包括青枯雷尔氏菌、辣椒疫霉、烟草疫霉、灰葡萄孢菌、链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉。
15.进一步的，所述葡萄园有孢汉逊酵母mp261能够显著抑制青枯雷尔氏菌、辣椒疫霉、烟草疫霉、灰葡萄孢菌、链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉的菌丝生长。
16.本发明还提供了所述的葡萄园有孢汉逊酵母mp261在用于制备防治植物青枯病和/或疫霉病和/或植物真菌病的生防菌剂中的应用。
17.进一步的，所述生防菌剂中含有葡萄园有孢汉逊酵母mp261发酵液和/或葡萄园有孢汉逊酵母mp261产生的挥发性气体。
18.进一步的，所述葡萄园有孢汉逊酵母mp261发酵液的制备步骤为：将葡萄园有孢汉逊酵母mp261发酵液接种到土豆汁培养基中在28℃，180rpm下震荡培养24h，获得含有葡萄园有孢汉逊酵母mp261的发酵液。
19.进一步的，所述葡萄园有孢汉逊酵母mp261产生的挥发性气体中含有乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、苯乙醇和乙酸苯乙酯。
20.进一步的，所述葡萄园有孢汉逊酵母mp261产生的挥发性气体中乙酸乙酯含量达到73.07％。
21.进一步的，所述疫霉病是由烟草疫霉和/或辣椒疫霉引起的植物疫霉病；所述植物青枯病是由青枯雷尔氏引起的植物细菌性青枯病；所述植物真菌病是由灰葡萄孢菌、链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉引起的植物真菌病。
22.与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
23.本发明筛选得到一株对多种植物病原菌具有显著抑制作用的葡萄园有孢汉逊酵母mp261，并经过对青枯雷尔氏、灰葡萄孢菌、烟草疫霉、辣椒疫霉的平板对峙实验；辣椒疫霉、烟草疫霉、灰葡萄孢菌、链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉平板对扣实验，证明本发明获得的葡萄园有孢汉逊酵母mp261具有广谱抑菌性，将其或其挥发性气体在制备生防制剂，具有良好的市场应用前景。
附图说明
24.图1是葡萄园有孢汉逊酵母mp261的平板培养图；
25.图2是葡萄园有孢汉逊酵母mp261的显微镜镜检图；
26.图3是葡萄园有孢汉逊酵母mp261的26s rdna序列扩增示意图；
27.图4是葡萄园有孢汉逊酵母mp261对辣椒疫霉疫霉菌丝生长抑制结果；
28.图5是葡萄园有孢汉逊酵母mp261对烟草疫霉菌丝生长抑制结果；
29.图6是葡萄园有孢汉逊酵母mp261对灰葡萄孢菌菌丝生长抑制结果；
30.图7是葡萄园有孢汉逊酵母mp261挥发性气体对辣椒疫霉菌丝生长抑制结果；
31.图8是葡萄园有孢汉逊酵母mp261挥发性气体对烟草疫霉菌丝生长抑制结果；
32.图9是葡萄园有孢汉逊酵母mp261挥发性气体对灰葡萄孢菌菌丝生长抑制结果；
33.图10是葡萄园有孢汉逊酵母mp261挥发性气体对链格孢菌菌丝生长抑制结果；
34.图11是葡萄园有孢汉逊酵母mp261挥发性气体对禾谷镰刀菌菌丝生长抑制结果；
35.图12是葡萄园有孢汉逊酵母mp261挥发性气体对尖孢镰刀菌菌丝生长抑制结果；
36.图13是葡萄园有孢汉逊酵母mp261挥发性气体对多主棒孢霉菌丝生长抑制结果；
37.图14是葡萄园有孢汉逊酵母mp261对青枯雷尔氏菌的抑制结果；
38.图15是葡萄园有孢汉逊酵母mp261挥发性气体的gc-ms结果。
具体实施方式
39.以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。
40.实施例1
41.一、菌株的分离与筛选
42.2019年9月于青岛崂山采集不同植物叶片、根以及花瓣等样品，除去病变及坏死部分剪碎待用，将样品剪碎后接入含终浓度为0.01％氯霉素的ypd液体培养基中(1％yeast extract，2％peptone，2％dextrose)，28℃，180rpm震荡培养2d；取上述培养液用无菌水稀释，在ypd平板上进行涂布分离，28℃培养2d后初步观察菌株。挑取合适单菌落再次进行划线分离，得到纯培养菌株。
43.挑取菌株单菌落，利用平板对峙生长方法将单菌落和多种植物病原菌分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，pda)平板(马铃薯200克洗净切块，加入适当水煮沸20～30分钟，纱布过滤取土豆汁，再加入葡萄糖20克，琼脂20克，定容至1000毫升，自然ph)，26～28℃条件下培养。通过测试酵母对植物病原菌菌丝生长的抑制情况，筛选出一株对烟草疫霉等多种植物病原菌的生长具有抑制力的mp261菌株。
44.菌株mp261的平板培养照片如图1所示，菌落呈乳白色，表面干燥、无光泽、中间突起。图2展示了细胞形态为柠檬状和卵圆形。
45.二、mp261菌株的分类鉴定
46.采用26s rdna分子特征鉴定方法进行pcr序列测定：
47.(1)、26s rdna序列引物
48.nl1：gcatatcaataagcggaggaaaag(seq id no.1)；
49.nl4：ggtccgtgtttcaagacgg(seq id no.2)；
50.(2)、pcr反应体系如下：transstart fastpfu dna polymerase：1μl；5
×
transstart fastpfu buffer 10μl；high pure dntps(2.5mm)：4μl；27f：2μl；1492r：2μl；模板：1μl；ddh2o：30μl；
51.pcr反应程序如下：95℃预变性2min；95℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min；35个循环，72℃复性；pcr产物电泳如图3所示。胶回收pcr产物，进行ta克隆，挑取单菌落送测序公司测序。
52.(3)、经测序，菌株mp261的26s rdna序列如下：
53.ttttaaatttacaaaataggaggaaaagaaaccaaccgggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggcactttcagtgtccgagttgtaatttgtagaagtagttttggggctggtccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggatcccagttctttgtaaaacgctttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgtttggacgccctgcgctccttgtgggtgcaggacacgcttttcactgggccaacatcggttttggcagcaggataaatcgttaggaacgtagctgccctcgggtagtgttacagcctagcggaatactgctagccgggactgaggactgcgtcttttgacaaggatgttggcataatggttaaatgccgcccgtttgaaaaacccgggcccaaagaa(seq id no.3)。
54.(4)、结论：经过ncbi数据库比对，待检测mp261菌株与葡萄园有孢汉逊酵母(hanseniaspora vineae strain x11-10)菌株的26s rdna(genbank：mn337242.1)的序列相似度为99.33％；与葡萄园有孢汉逊酵母(hanseniaspora vineae strain hn001)菌株16s rdna(genbank：mw076944.1)的序列相似度为99.83％；表明该mp261菌株为葡萄园有孢汉逊酵母(hanseniaspora vineae)。
55.将本发明筛选到的葡萄园有孢汉逊酵母mp261菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022年3月15日，葡萄园有孢汉逊酵母hanseniaspora vineae mp261的保藏编号为cctcc no：m 2022262。
56.三、葡萄园有孢汉逊酵母mp261对多种植物病原菌的生防实验
57.1、平板对峙实验测试mp261菌株对3种植物病原菌菌丝生长抑制作用
58.实验方法：将mp261菌株在pda平板上26℃活化培养2天备用；3种植物病原菌(辣椒疫霉、烟草疫霉、灰葡萄孢菌)分别在pda平板上26～28℃活化培养3～6天，然后用打孔器在活化好的菌株菌丝边缘(生长状况尽量一致)打取圆形菌饼(直径0.60cm)，再用接种针分别将mp261菌株和病原菌菌饼挑至新的平板，以空白菌饼为对照，然后将培养皿倒置于培养箱(26～28℃)中培养3～6天，待空白组长满板时，测定菌丝的生长情况，计算mp261菌株对3种植物病原菌生长的抑制率。
59.测试发现，mp261菌株对3种植物病原菌的菌丝生长的都有明显抑菌效果。图4-图6展示了mp261菌株对3种植物病原菌(辣椒疫霉、烟草疫霉、灰葡萄孢菌)的抑制效果(图中间为病原菌，四周为mp261菌株)。结果显示mp261菌株对辣椒疫霉、烟草疫霉、灰葡萄孢菌都有很好的抑制作用。进一步分析表明，mp261菌株对辣椒疫霉的菌丝生长抑制率为33.4％；对烟草疫霉的菌丝生长抑制率为37.2％；对灰葡萄孢菌的菌丝生长抑制率为35.6％。
60.2、mp261菌株挥发性气体对多种植物病原菌抑制作用
61.植物病原菌分别在pda平板上26～28℃活化培养3～6天。mp261菌株在pda平板中28℃活化2d，活化后接种环挑单菌落于100ml土豆汁培养基中28℃，180rpm摇24h，备用。然后用打孔器在活化好的植物病原菌菌株菌丝边缘(生长状况尽量一致)打取圆形菌饼(直径0.60cm)接在另一pda平板上；将得到的mp261发酵液稀释成1
×
106细胞/ml，取20μl涂布在pda平板上，对照组不处理。将接有植物病原菌的pda平板与涂布mp261菌株的pda平板对扣，对照组将植物病原菌的pda平板与空白的pda平板对扣，封口膜封严。接有病原菌的平板在上，涂布mp261平板在下，28℃培养3-6天，待对照组病原菌长满板后观察实验结果。
62.结果如图7-图13显示，mp261菌株产生的挥发性气体对辣椒疫霉、烟草疫霉、灰葡
萄孢菌、链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉菌丝生长的都有明显抑菌效果。表1展示了mp261菌株产生的挥发性气体对上述病原菌的抑制效果，其中mp261菌株对灰葡萄孢菌的抑制率最高。
63.表1、mp261菌株的挥发性气体对病原菌的抑制
[0064][0065]
实施例2
[0066]
用无菌棉棒蘸取青枯雷尔氏菌菌液后，将其涂布在平板表面，然后在平板中央接种mp261菌株。将培养皿倒置于培养箱(26～28℃)中培养1～2天，测定mp261菌株对青枯雷尔氏的抑菌作用。
[0067]
测试结果如图14和表2所示，发现mp261菌株的菌落周围出现明显的抑菌圈，表明mp261菌株对青枯雷尔氏菌的生长也有显著的抑制效果。
[0068]
表2、mp261菌株对青枯病菌的抑制效果
[0069][0070]
实施例3
[0071]
利用20ml顶空瓶收集mp261产生的挥发性气体，利用固相萃取和气相-质谱gc-ms仪器测试挥发性气体的成分。固相萃取：sigma-aldrich 57329-u(dvb/car/fdms)；gc-ms仪器：tsq series 8000；色谱柱：thermo tg-5silms，毛细管柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)。在40℃下，顶空萃取1小时。进样温度250℃，载气：he，流速为1.3ml/min。柱温升温程序：40℃保持2min，然后以3℃/min升至100，保持0.1min；再以20℃/min升至240℃，保持5min。在全扫描模式下记录色谱图，m/z 40-400amu，离子源温度设置为230℃。所得物质经计算机自动检索，与nist library匹配定性。
[0072]
实验结果表明，mp261能产生多种挥发性气体(图15)。质谱分析表明，在这些挥发性气体中，乙酸乙酯(ethyl acetate)含量为73.07％(2.21min)；3-甲基-1-丁醇乙酸酯(1-butanol，3-methyl-，acetate)含量为10.8％(7.11min)；苯乙醇(phenylethyl alcoho1)含
量为0.27％(17.43min)；乙酸苯乙酯(acetic acid，2-phenylethyl ester)含量为7.73％(23.28min)。
[0073]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。