一株具有抑菌作用的戴尔凯氏有孢圆酵母MP023及其应用

一株具有抑菌作用的戴尔凯氏有孢圆酵母mp023及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有抑菌作用的戴尔凯氏有孢圆酵母mp023及其应用。


背景技术：

2.目前主要通化学防治、农业防治、生物防治来治理植物病害。化学防治因其高效、便捷是最主要的防治手段，但是由于化学防治，长期使用植物产生抗药性，农药残留污染环境。生物防治是利用植物有益微生物或微生物的代谢产物防治植物病害的方法，包括生防细菌、生防真菌、生防放线菌、生防病毒、植物诱抗剂等。生物防治由于其环境友好的特点已经成为近些年来研究热点，生物防治本身作为一种控制植物病害的重要手段，被认为是最有潜力替代化学防治的防治方法之一。
3.虽然目前已经获得了一些能够显著抑制果蔬病害的生防酵母，但还没有能够替代化学杀菌剂的生防酵母出现。生防酵母从实验室走向实际生产应用仍然需要一段艰难的旅程。其中人们对酵母菌防治机制仍然不十分清楚，这也是使其不能走向实际应用的主要原因之一。酵母抑制机制复杂，可能涉及酵母、病原体、宿主和微生物群落之间的相互作用。目前为止已知的酵母菌的生防机制有竞争、酶的分泌、毒素的产生、挥发性有机化合物(voc)的释放、真菌寄生和植物抗性诱导植物抗性等。
4.酵母产生的挥发性有机化合物已被许多研究证明具有抑制植物病原菌的作用。酵母菌因具有生长繁殖能力强、遗传稳定、广谱抗菌性以及不产生对人体有害的代谢产物等优点，在防治植物病害的生防制剂方面具有良好的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供了一株具有抑菌作用的戴尔凯氏有孢圆酵母mp023及其应用。所述戴尔凯氏有孢圆酵母mp023能显著抑制多种病原菌，比如立枯丝核菌、草莓根腐病菌、链格孢菌、灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌的生长。
6.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
7.本发明提供了一株具有抑菌作用的戴尔凯氏有孢圆酵母mp023，其分类命名为戴尔凯氏有孢圆酵母torulaspora delbrueckii，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 2022264。
8.进一步的，所述戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的26s rdna的核苷酸序列如seq id no.3所示。
9.进一步的，所述戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的菌落呈乳白色，规则圆形或椭圆形，表面光滑，中间突起。
10.本发明还提供了所述的戴尔凯氏有孢圆酵母mp023在用于制备植物病原菌抑制剂中的应用。
11.进一步的，所述病原菌包括立枯丝核菌、草莓根腐病菌、链格孢菌、灰葡萄孢菌、尖
孢镰刀菌。
12.进一步的，所述戴尔凯氏有孢圆酵母mp023能够显著抑制立枯丝核菌、草莓根腐病菌、链格孢菌、灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌的菌丝生长。
13.本发明还提供了所述的戴尔凯氏有孢圆酵母mp023在用于制备防治植物病害的生防制剂中的应用。
14.进一步的，所述植物病害是由立枯丝核菌、草莓根腐病菌、链格孢菌、灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌中的至少一种引起的。
15.进一步的，所述生防菌剂中含有戴尔凯氏有孢圆酵母mp023发酵液和/或戴尔凯氏有孢圆酵母mp023产生的挥发性气体。
16.进一步的，所述戴尔凯氏有孢圆酵母mp023发酵液的制备步骤为：将所述戴尔凯氏有孢圆酵母mp023接种到土豆汁葡萄糖培养基中在28℃，180rpm下震荡培养24h。
17.进一步的，所述戴尔凯氏有孢圆酵母mp023产生的挥发性气体含有3-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇乙酸酯和苯乙醇。
18.进一步的，所述3-甲基-1-丁醇含量超过15％。
19.与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
20.本发明筛选得到一株对多种植物病原菌有抑制作用的戴尔凯氏有孢圆酵母mp023，并经过戴尔凯氏有孢圆酵母mp023菌株对立枯丝核菌、草莓根腐病菌、链格孢菌、灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌抑制实验，证明本发明获得的戴尔凯氏有孢圆酵母mp023产生的挥发性气体具有广谱抑菌性，将其用于制备生防制剂，具有良好的市场应用前景。
附图说明
21.图1是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的平板培养图；
22.图2是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的细胞显微镜镜检图；
23.图3是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的26s rdna序列扩增示意图；
24.图4是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023对灰葡萄孢菌菌丝生长抑制结果；
25.图5是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023对草莓根腐病菌菌丝生长抑制结果；
26.图6是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的挥发性气体对立枯丝核菌的抑制效果；
27.图7是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的挥发性气体对草莓根腐病菌的抑制效果；
28.图8是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的挥发性气体对链格孢菌的抑制效果；
29.图9是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的挥发性气体对灰葡萄孢菌的抑制效果；
30.图10是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的挥发性气体对尖孢镰刀菌的抑制效果；
31.图11是戴尔凯氏有孢圆酵母mp023的挥发性气体物质气相色谱图。
具体实施方式
32.以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。
33.实施例1
34.一、菌株的分离与筛选
35.2019年6月于青岛地区采集不同植物叶片、根以及花瓣等样品，除去病变及坏死部分剪碎待用，将样品接入含终浓度为0.01％氯霉素的ypd液体培养基中(10g/l酵母提取物，
20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖)，然后至于摇床28℃，180rpm培养两天；取上述培养液用无菌水稀释至10-6
倍，在ypd平板上进行涂布分离培养后，获得酵母单菌落，再利用平板划线分离的方法获得多个纯培养的酵母菌株。
36.利用平板对峙方法测试酵母菌株抑制植物病原菌的能力，采用的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，pda)培养基，该培养基制备的方法为：马铃薯200克洗净切块，加入适当水煮沸20～30min，过滤取土豆汁，再加入葡萄糖20克，琼脂20克，定容至1000毫升，自然ph。在26～28℃条件下培养，通过测试酵母菌株对植物病原菌菌丝生长的抑制情况，筛选出一株对多种植物病原菌的生长具有抑制力的mp023菌株。
37.mp023菌株的平板培养照片如图1所示，菌落呈乳白色，规则圆形或椭圆形，表面光滑，中间突起。显微镜镜检照片如图2所示，细胞呈圆形或椭圆形。
38.二、mp023菌株的分类鉴定
39.采用26s rdna分子特征鉴定方法进行pcr序列测定：
40.(1)、26s rdna序列引物
41.nl1：gcatatcaataagcggaggaaaag(seq id no.1)；
42.nl4：ggtccgtgtttcaagacgg(seq id no.2)；
43.(2)、pcr反应体系如下：transstart fastpfu dna polymerase：1μl；5
×
transstart fastpfu buffer：10μl；high pure dntps(2.5mm)：4μl；27f：2μl；1492r：2μl；模板：1μl；ddh2o：30μl；
44.pcr反应程序如下：95℃预变性2min；95℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min；35个循环，72℃复性；pcr电泳结果如图3所示。胶回收pcr产物，进行ta克隆，挑取单菌落送测序公司测序。
45.(3)、经测序，mp023菌株的26s rdna序列如下：
[0046][0047]
(4)、结论：经过ncbi数据库比对，待检测mp023菌株与戴尔凯氏有孢圆酵母(torulaspora delbrueckii strain rhtd8)菌株的26s rdna(genbank：mk034127.1)的序列相似度为99.5％；与戴尔凯氏有孢圆酵母(torulaspora delbrueckii strain exoc35)菌株16s rdna(genbank：ef063125.1)的序列相似度为99.34％；表明该mp023菌株为戴尔凯氏有孢圆酵母(torulaspora delbrueckii)。
[0048]
将本发明筛选到的戴尔凯氏有孢圆酵母mp023菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国
ms，tsq series 8000)分析挥发性气体的成分。色谱柱型号为thermo tg-5silms，毛细管柱规格为30m
×
0.25mm
×
0.25μm)。在40℃下，顶空萃取1小时。进样温度250℃，载气：he，流速为1.3ml/min。柱温升温程序：40℃保持2min，然后以3℃/min升至100，保持0.1min；再以20℃/min升至240℃，保持5min。在全扫描模式下记录色谱图，m/z 40-400amu，离子源温度设置为230℃。所得物质经计算机自动检索，与nist library匹配定性。
[0060]
mp023菌株产生的挥发性气体色谱图如图11所示。实验发现mp023菌株能产生多种挥发性气体，质谱分析表明，mp023菌株产生的挥发性气体中3-甲基-1-丁醇(1-butanol，3-methyl-)含量为15.04％(3.56min)；3-甲基-1-丁醇乙酸酯(1-butanol，3-methyl-，acetate)含量为1.02％(7.19min)；苯乙醇(phenylethyl alcohol)含量为1.59％(17.44min)。
[0061]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。