快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的试剂盒及鉴定方法

1.本发明涉及水产生物技术领域，尤其涉及一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力试剂盒及鉴定方法。


背景技术：

2.自然状况下，由于水体盐度的变化、水生植物的光合作用、水面风速大小、温度的升降、昼夜变化和季节变换等，水体中的溶解氧浓度会随之发生变化。加上人类的活动，农业生产中大量的施用化肥造成的水体富营养化、生活和工业污水的排放和全球变暖等现象，养殖鱼类的低氧耐受能力大大限制了水产养殖密度，因此，对养殖鱼类群体耐低氧能力进行判断并在幼苗时期就筛选具有耐低氧能力群体对于养殖产业的发展至关重要。
3.瓦氏黄颡鱼(pelteobagrus vachelli)俗称江黄颡鱼、硬角黄蜡丁、朗丝(四川)、肥佗、黄姑，主要分布于长江、珠江、钱塘江、淮河、黄河及其支流。瓦氏黄颡鱼具有生长速度快、食性杂、容易驯养、营养价值高、肉味鲜美等优点，因此是水产养殖业一个很有养殖前景的品种。但是在低氧下，瓦氏黄颡鱼的食欲下降，使得鱼体生长缓慢，肥满度降低。为了避免鱼体质量下降，需要花费大量成本来维持水体适宜的溶氧浓度，避免浮头甚至泛塘的出现。根据本实验室之前所授权的专利“一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的snp分子标记及其应用”(zl 201811294276.x)，与其区别特征在于，本专利取瓦氏黄颡鱼肝脏组织利用特异性引物对catalase和trypsin进行qrt-pcr实验，通过计算其相对表达量，判断所测鱼体耐低氧程度。本专利适用于瓦氏黄颡鱼耐低氧群体的初步筛选。


技术实现要素：

4.发明目的：为了解决鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的问题，本发明提供了一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的试剂盒及其鉴定方法。
5.技术方案：本发明的快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的试剂盒，包括catalase、trypsin特异性正向引物和特异性反向引物；所述catalase特异正向引物的核苷酸序列如seq id no.1gtgagcgcattcctgaacgg所示，特异反向引物的核苷酸序列如seq id no.2agagaacctcacagcgaccg所示；所述trypsin特异正向引物的核苷酸序列如seq id no.3gatcaagcgaaggactttgtgaagaac所示，特异反向引物的核苷酸序列如seq id no.4aggatgaggatggaggcagaacc所示。
6.进一步地，所述试剂盒还包括qrt-pcr反应缓冲液和蒸馏水。
7.进一步地，所述qrt-pcr反应缓冲液为2
×
taq pro universal sybr green qpcr master mix。
8.本发明还公开一种所述试剂盒的鉴定方法，包括如下步骤：
9.(1)提取待测瓦氏黄颡鱼肝脏样品的rna，反转录，得到cdna；
10.(2)以步骤(1)所得cdna为模板，利用所述试剂盒进行qrt-pcr反应，计算得到catalase、trypsin的相对表达量，通过catalase相对表达量是否在1.5-2.5和trypsin相对
表达量是否在0.2-0.6判断待测瓦氏黄颡鱼样品的耐低氧能力。
11.进一步地，步骤(1)中，所述提取方法包括硅胶膜纯化技术。
12.进一步地，步骤(2)中，所述qrt-pcr反应体系，每20-50μl包括：cdna模板2-5μl、特异性正向引物0.4-1μl、特异性反向引物0.4-1μl、qrt-pcr反应缓冲液10-25μl和蒸馏水7.2-18μl。
13.进一步地，步骤(2)中，所述qrt-pcr反应体系的反应程序为：95℃30s，然后扩增40个循环，每个循环反应程序为95℃10s，60℃30s，最后熔解，程序为95℃15s,60℃60s,95℃15s。
14.进一步地，步骤(2)中，所述判断方法为当至少满足一个区间时，说明该群体耐低氧能力一般；当catalase和trypsin相对表达量都在0.9-1.1时，说明该群体耐低氧能力好；若两个都不满足说明该群体耐低氧能力差。
15.进一步地，步骤(1)中，所述瓦氏黄颡鱼肝脏样品为鱼体长12-14cm，体重11-20g的瓦氏黄颡鱼低氧处理12小时的肝脏组织。
16.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
17.(1)本发明运用筛选出的瓦氏黄颡鱼低氧胁迫下的标志基因，研制一种筛选耐低氧群体的试剂盒，通过12小时低氧胁迫，快速检测群体耐低氧能力，挑选耐低氧群体。在养殖过程中减少维持溶氧的成本，提高瓦氏黄颡鱼养殖业的经济效益。
18.(2)本发明研究表明，瓦氏黄颡鱼体内catalase、trypsin的相对表达量与耐低氧能力存在一定的关系，通过本发明提供的catalase、trypsin、β-actin的特异性正向引物和特异性反向引物可检测出瓦氏黄颡鱼的catalase、trypsin的相对表达量，利用简便的快速方法判断瓦氏黄颡鱼群体的耐低氧能力，即节约了成本，又为其绿色健康养殖提供基础。
附图说明
19.图1是实施例1中catalase、trypsin的qrt-pcr结果；
20.图2是实施例2中catalase、trypsin的qrt-pcr结果。
具体实施方式
21.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
22.本发明提供了一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的试剂盒及方法，包括catalase、trypsin及β-actin特异性正向引物和特异性反向引物；所述catalase特异性正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，特异性反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；
23.seq id no.1gtgagcgcattcctgaacgg
24.seq id no.2agagaacctcacagcgaccg
25.在本发明中，所述trypsin特异性正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，特异性反向的核苷酸序列如seq id no.4所示；
26.seq id no.3gatcaagcgaaggactttgtgaagaac
27.seq id no.4aggatgaggatggaggcagaacc
28.在本发明中，所述β-actin特异性正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，特
异性反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
29.seq id no.5cactgctgcctcttcctc
30.seq id no.6atccacatcgcacttcat
31.在本发明中，所述试剂盒还包括：qrt-pcr反应缓冲液和蒸馏水；所述qrt-pcr反应缓冲液优选2
×
taq pro universal sybr green qpcr master mix。
32.本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒的瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力鉴定方法，包括以下步骤：
33.(1)从待测瓦氏黄颡鱼群体中抽取体长12-14cm,体重11-13g的鉴定样本，鱼处理时间为12小时。
34.(2)被检测鱼分为低氧组和对照组，处理时间为12小时的低氧组氧气浓度为0.8-1.2mg o
2 l-1
，对照组氧气浓度为7.0-7.5mg o
2 l-1
；
35.(3)实验处理后，提取该群体瓦氏黄颡鱼鉴定样本的肝脏rna，反转录得到cdna。
36.(4)以步骤(3)所得的cdna作为模板，利用上述技术方案所述的试剂盒进行qrt-pcr反应，采用2-δδct
计算相对基因表达量，其中δδct＝(ct
target.n-ct
actin.n
)-(ct
target.c-ct
actin.c
)；其中ct为steponeplus qrt-pcr system输出的ct值，target代表目的基因，actin代表β-actin，n代表实验组，c代表对照组。以β-actin计算得到catalase和trypsin的相对表达量，catalase相对表达量的范围在1.5-2.5，trypsin相对表达量的范围符合0.2-0.6，判断方法：当至少满足一个区间时，说明该群体耐低氧能力一般；当catalase和trypsin相对表达量都在0.9-1.1时，说明该群体耐低氧能力好；若两个都不满足说明该群体耐低氧能力差。
37.在本发明中，步骤(3)所述抽提的方法优选的包括硅胶膜纯化技术。本方法对具体如何进行rna提取以及rna反转录没有特殊限定，采用本领域已知方法即可。
38.在本发明中，步骤(4)所述qrt-pcr反应体系：每20-50μl包括：cdna模板2-5μl、特异性正向引物0.4-1μl、特异性反向引物0.4-1μl、qrt-pcr反应缓冲液10-25μl和蒸馏水7.2-18μl。
39.在本发明中，步骤(4)所述qrt-pcr的反应程序优选：95℃30s，然后扩增40个循环，每个循环反应程序为95℃10s，60℃30s，最后熔解，程序为95℃15s,60℃60s,95℃15s。
40.实施例1
41.a)0.8-1.2mg o
2 l-1
低氧胁迫12小时的瓦氏黄颡鱼群体的获得；
42.b)0.8-1.2mg o
2 l-1
低氧胁迫瓦氏黄颡鱼群体肝脏rna及cdna的获得；
43.c)基于权利要求1所述的引物对，对瓦氏黄颡鱼的cdna进行qrt-pcr扩增；
44.d)根据扩增结果，计算瓦氏黄颡鱼的catalase、trypsin基因的相对表达量；
45.e)根据实验结果，判断瓦氏黄颡鱼群体的耐低氧能力。
46.具体步骤如下：
47.a)0.8-1.2mg o
2 l-1
低氧胁迫12小时的瓦氏黄颡鱼群体的获得；
48.实验采用的瓦氏黄颡鱼来自江苏省南京市水产科学研究所,本次实验从瓦氏黄颡鱼鱼苗开始驯化，保证同一亲本同一产地同一饲养条件，饲养条件为：水温控制在26
±
0.8℃，ph控制在7.0
±
0.2，实验前一直保持溶解氧(do)为7.1
±
0.5mg l-1
，总氨氮为0.075
±
0.005mg l-1
，除此之外，饲料前期为卤虫开口，后期转为人工饲料。实验处理前，进行规格筛
选，挑选100尾无病健康、体质良好的瓦氏黄颡鱼，平均体重为12.2
±
0.5g，平均长度为13.1
±
0.3cm。将72尾实验鱼平均分配到6个鱼缸中，这6个鱼缸平均分为缺氧组(1.0
±
0.2mg o
2 l-1
)和对照组(6.8
±
0.2mg o
2 l-1
)，每天喂食两次，实验前24h停食。实验全程通过人工测量氧气浓度以保证实验条件准确性，重复实验为同样样品测3次。
49.在进行正式实验前，已通过预实验测定瓦氏黄颡鱼在氧气浓度降低至0.61mg l-1
，出现“浮头”现象。因此，为了使瓦氏黄颡鱼获得一个低氧环境而不影响其正常的生存，选择水溶氧量0.8-1.2mg o
2 l-1
作为低氧胁迫的低氧条件。对照组的氧气浓度为6.8-7.2mg o
2 l-1
。
50.b)剪取鱼体的肝脏，置于-80℃保存，用于rna的提取及cdna的获得；
51.本实验采用商用rna提取试剂盒，进行rna的提取，利用试剂进行反转录，获得cdna。
52.c)基于权利要求1所述的引物对，对瓦氏黄颡鱼的cdna进行qrt-pcr扩增；
53.qrt-pcr反应体系：cdna模板2μl、特异性正向引物0.4μl、特异性反向引物0.4μl、qrt-pcr反应缓冲液10μl和蒸馏水7.2μl。
54.在本发明中，步骤(3)所述qrt-pcr的反应程序优选：95℃30s，然后扩增40个循环，每个循环反应程序为95℃10s，60℃30s，最后熔解，程序为95℃15s,60℃60s,95℃15s。
55.d)根据扩增结果，计算瓦氏黄颡鱼的catalase、trypsin基因的相对表达量；
56.采用2-δδct
计算相对基因表达量，其中δδct＝(ct
target.n-ct
actin.n
)-(ct
target.c-ct
actin.c
)；其中ct为steponeplus qrt-pcr system输出的ct值，target代表目的基因，actin代表β-actin，n代表实验组，c代表对照组。
57.e)根据实验结果，判断瓦氏黄颡鱼的耐低氧能力。
58.根据qrt-pcr实验所得catalase相对表达量的范围在1.86
±
0.28，trypsin相对表达量的范围在0.41
±
0.10。本次实验数据如图1所示，从图1看出该群体catalase和trypsin相对表达量都在范围内，说明所测群体耐低氧能力一般。
59.实施例2
60.利用本实验室前期经2代选育的瓦氏黄颡鱼耐低氧群体为实验对象。
61.a)0.8-1.2mg o
2 l-1
低氧胁迫12小时的耐低氧瓦氏黄颡鱼群体的获得；
62.b)0.8-1.2mg o
2 l-1
低氧胁迫耐低氧瓦氏黄颡鱼群体肝脏rna及cdna的获得；
63.c)基于权利要求1所述的引物对，对耐低氧瓦氏黄颡鱼的cdna进行qrt-pcr扩增；
64.d)根据扩增结果，计算耐低氧瓦氏黄颡鱼的catalase、trypsin基因的相对表达量；
65.e)根据实验结果，判断耐低氧瓦氏黄颡鱼群体的耐低氧能力。
66.具体步骤如下：
67.a)0.8-1.2mg o
2 l-1
低氧胁迫12小时的耐低氧瓦氏黄颡鱼群体的获得；
68.实验所用耐低氧瓦氏黄颡鱼来自本实验室前期经2代选育的瓦氏黄颡鱼耐低氧群体。取120尾瓦氏黄颡鱼(体质健康，体长13
±
1.12cm,体重20
±
1.77g)随机分配至三个具有生物过滤装置的水循环养殖池(总体积为390l，水流流量为5l min-1
，温度为25
±
1℃)中，以人工配合饲料喂养，饲料配方：蛋白含量》42.0％,灰分》14％，钙成分0.5-3.5％，氯化钠0.3-2.5％。在水体温度为25
±
1℃、正常水体溶氧浓度为6.8-7.2mg o2l-1
条件下驯养两周。
随后，将120尾鱼平均分配到6个鱼缸中，实验设置缺氧组(1.0
±
0.2mg o
2 l-1
)和对照组(6.8
±
0.2mg o
2 l-1
)，每组3个重复。缺氧组持续低氧胁迫12小时后解剖取肝脏进行下一步实验。
69.b)剪取鱼体的肝脏，置于-80℃保存，用于rna的提取及cdna的获得；
70.本实验采用商用rna提取试剂盒，进行rna的提取，利用试剂进行反转录，获得cdna。
71.c)基于权利要求1所述的引物对，对瓦氏黄颡鱼的cdna进行qrt-pcr扩增；
72.qrt-pcr反应体系：cdna模板2μl、特异性正向引物0.4μl、特异性反向引物0.4μl、qrt-pcr反应缓冲液10μl和蒸馏水7.2μl。
73.在本发明中，步骤(3)所述qrt-pcr的反应程序优选：95℃30s，然后扩增40个循环，每个循环反应程序为95℃10s，60℃30s，最后熔解，程序为95℃15s,60℃60s,95℃15s。
74.d)根据扩增结果，计算瓦氏黄颡鱼的catalase、trypsin基因的相对表达量；
75.采用2-δδct
计算相对基因表达量，其中δδct＝(ct
target.n-ct
actin.n
)-(ct
target.c-ct
actin.c
)；其中ct为steponeplus qrt-pcr system输出的ct值，target代表目的基因，actin代表β-actin，n代表实验组，c代表对照组。
76.e)根据实验结果，判断瓦氏黄颡鱼的耐低氧能力。
77.根据qrt-pcr实验所得catalase相对表达量的范围在1.03
±
0.08，trypsin相对表达量的范围在0.91
±
0.15。本次实验数据如图2所示，从图2看出该群体catalase和trypsin相对表达量都在范围内，说明所测群体耐低氧能力好，而所选取的鱼为耐低氧群体，与事实相符。