诱导型质粒自毁辅助重组的制作方法

技术特征：
1.一种环状dna载体，包含：(a)可选择的标志基因序列，其中所述标志基因序列可操作地连接至第一启动子序列，(b)多克隆位点，其中所述多克隆位点任选地包含基因靶向序列，(c)编码位点特异性重组酶的序列，其中所述序列可操作地连接至第二启动子序列，其中所述第二启动子是诱导型的，(d)复制子序列，(e)用于所述位点特异性重组酶的两个靶位点，其中载体包含由所述位点特异性重组酶的所述靶位点之一侧翼在每一侧的第一区域，并且其中所述区域包含(a)和(b)，前提条件是(c)和(d)不在所述第一区域内。2.根据权利要求1所述的环状dna载体，其中所述可选择的标志是抗生素抗性基因，如选自由氯霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、四环素抗性基因和红霉素抗性基因组成的组的抗生素抗性基因。3.根据权利要求1或2所述的环状dna载体，其中所述位点特异性重组酶是位点特异性丝氨酸重组酶。4.根据前述权利要求中任一项所述的环状dna载体，其中所述位点特异性重组酶选自由β-重组酶、cre-重组酶、flp-重组酶和phic31整合酶组成的组。5.根据前述权利要求中任一项所述的环状dna载体，其中所述复制子序列是原核复制子序列。6.根据前述权利要求中任一项所述的环状dna载体，其中所述复制子序列编码复制起点(ori)和复制起始蛋白(rep蛋白)。7.根据前述权利要求中任一项所述的环状dna载体，其中所述复制子序列为允许所述载体在原核宿主细胞如乳杆菌(lactobacilli)或双歧杆菌(bifidobacteria)中复制的复制子序列。8.根据前述权利要求中任一项所述的环状dna载体，其中所述复制子序列是允许在大肠杆菌(e.coli)中复制所述载体的复制子序列。9.根据前述权利要求中任一项所述的环状dna载体，其中所述复制子序列为允许所述载体在大肠杆菌和另一种原核宿主细胞如选自由乳杆菌和双歧杆菌组成的组的宿主细胞中复制的复制子序列。10.根据前述权利要求中任一项所述的环状dna载体，其中所述复制子序列是允许所述载体在选自由以下组成的组的至少一种宿主细胞中复制的复制子序列：格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)(如格氏乳杆菌dsm 14869)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)(如鼠李糖乳杆菌dsm 14870)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)、卷曲乳杆菌(lactobacillus crispatus)、詹氏乳杆菌(lactobacillus jensenii)、阴道乳杆菌(lactobacillus vaginalis)、惰性乳杆菌(lactobacillus iners)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)、弯曲乳杆菌(lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(lactobacillus delbrueckii)和约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的环状dna载体，其中所述第二启动子序列是诱导型原核生物启动子，如选自由sakacin-诱导型启动子、四环素诱导型启动子、d-木糖诱导型启动子、乳糖诱导型启动子、iptg-诱导型启动子、乳酸链球菌素诱导型启动子、胆汁诱导型启动子、细菌素诱导型启动子和合成诱导型启动子组成的组的启动子。12.根据前述权利要求中任一项所述的环状dna载体，其中用于所述位点特异性重组酶的所述两个靶位点是定向的，使得用于所述位点特异性重组酶的两个靶位点之间的位点特异性重组的产物是包含(a)和(b)的第一环状dna产物以及包含(c)和(d)的第二环状dna产物。13.根据前述权利要求中任一项所述的环状dna载体，其中所述载体还包含插入在所述多克隆位点中的基因靶向序列。14.一种用于在环状dna载体和宿主细胞基因组的靶区之间引入重组的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将根据权利要求13的包含基因靶向序列的环状dna载体引入宿主细胞，其中靶序列包含侧翼序列，所述侧翼序列包含与所述宿主细胞基因组的靶区的相应区域具有至少80％序列同一性的至少约200个连续核苷，(ii)诱导由所述环状dna载体编码的位点特异性重组酶的表达，并且允许在所述位点特异性重组酶的靶位点之间的位点特异性重组，以产生包含(a)和(b)的第一环状dna产物以及包含(c)和(d)的第二环状dna产物，(iii)选择宿主细胞，其中通过所述靶序列的侧翼序列与所述宿主细胞基因组的靶区之间的第一单交叉同源重组事件，将所述包含(a)和(b)的第一环状dna产物整合在所述基因组的靶区，和(iv)选择宿主细胞，其中已经通过所述靶向序列的侧翼序列与所述基因组的靶区之间的第二同源重组事件将(a)从(iii)下获得的宿主细胞的基因组中切除。15.一种用于产生和选择在宿主细胞基因组的靶基因中具有突变的宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将根据权利要求13的包含基因靶向序列的环状dna载体引入宿主细胞，其中靶序列包含侧翼序列，所述侧翼序列包含与所述宿主细胞基因组的靶基因的相应区域具有至少80％序列同一性的至少约200个连续核苷，(ii)诱导由所述环状dna载体编码的位点特异性重组酶的表达，并且允许在所述位点特异性重组酶的靶位点之间的位点特异性重组，以产生包含(a)和(b)的第一环状dna产物以及包含(c)和(d)的第二环状dna产物，(iii)选择宿主细胞，其中通过所述靶序列的侧翼序列与所述宿主细胞基因组的靶区之间的第一单交叉同源重组事件，将所述包含(a)和(b)的第一环状dna产物整合在所述基因组的靶区，以及(iv)选择宿主细胞，其中已经通过所述靶向序列的侧翼序列与所述基因组的靶区之间的第二同源重组事件将(a)从(iii)下获得的宿主细胞的基因组中切除，并且其中所述宿主细胞在所述靶区包含突变。16.一种用于产生在宿主细胞基因组的靶基因中具有功能丧失的宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将根据权利要求13的包含基因靶向序列的环状dna载体引入宿主细胞，其中靶序列包含侧翼序列，所述侧翼序列包含与所述宿主细胞基因组的靶基因的相应区域具有至少
80％序列同一性的至少约200个连续核苷，(ii)诱导由所述环状dna载体编码的位点特异性重组酶的表达，并且允许在所述位点特异性重组酶的靶位点之间的位点特异性重组，以产生包含(a)和(b)的第一环状dna产物以及包含(c)和(d)的第二环状dna产物，(iii)选择宿主细胞，其中通过所述靶序列的侧翼序列与所述宿主细胞基因组的靶区之间的第一单交叉同源重组事件，将所述包含(a)和(b)的第一环状dna产物整合在所述基因组的靶区，以及(iv)选择宿主细胞，其中已经通过所述靶向序列的侧翼序列与所述基因组的靶区之间的第二同源重组事件将(a)从(iii)下获得的宿主细胞的基因组中切除，并且其中所述宿主细胞包含所述靶基因的功能丧失。17.一种用于产生在宿主细胞基因组的靶基因中具有功能增益的宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将根据权利要求13的包含基因靶向序列的环状dna载体引入宿主细胞，其中靶序列包含侧翼序列，所述侧翼序列包含与所述宿主细胞基因组的靶基因具有至少80％序列同一性的至少约200个连续核苷，(ii)诱导由所述环状dna载体编码的位点特异性重组酶的表达，并且允许在所述位点特异性重组酶的靶位点之间的位点特异性重组，以产生包含(a)和(b)的第一环状dna产物以及包含(c)和(d)的第二环状dna产物，(iii)选择宿主细胞，其中通过所述靶序列的侧翼序列与所述宿主细胞基因组的靶区之间的第一单交叉同源重组事件，将所述包含(a)和(b)的第一环状dna产物整合在所述基因组的靶区，以及(iv)选择宿主细胞，其中已经通过所述靶向序列的侧翼序列与所述基因组的靶区之间的第二同源重组事件将(a)从(iii)下获得的宿主细胞的基因组中切除，并且其中所述宿主细胞包含所述靶基因的功能增益。18.一种用于制备表达重组多肽的宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将根据权利要求13的包含基因靶向序列的环状dna载体引入宿主细胞，其中靶序列包含侧翼序列，所述侧翼序列包含与所述宿主细胞基因组的靶区的相应区域具有至少80％序列同一性的至少约200个连续核苷，并且其中所述基因靶向序列编码重组多肽，(ii)诱导由所述环状dna载体编码的位点特异性重组酶的表达，并且允许在所述位点特异性重组酶的靶位点之间的位点特异性重组，以产生包含(a)和(b)的第一环状dna产物以及包含(c)和(d)的第二环状dna产物，(iii)选择宿主细胞，其中通过所述靶序列的侧翼序列与所述宿主细胞基因组的靶区之间的第一单交叉同源重组事件，将所述包含(a)和(b)的第一环状dna产物整合在所述基因组的靶区，以及(iv)选择宿主细胞，其中已经通过所述靶向序列的侧翼序列与所述基因组的靶区之间的第二同源重组事件将(a)从(iii)下获得的宿主细胞的基因组中切除。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述重组多肽是选自由抗体(如单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合抗体、单结构域抗体、骆驼抗体)、酶、细胞因子、激素和血液凝固蛋白组成的组的多肽。20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述侧翼序列包含200至1500范围内的连续核苷，例如至少约300个连续核苷，如至少约400个连续核苷，例如至少约500个连
续核苷，如至少约600个连续核苷，例如至少约700个连续核苷，如至少约800个连续核苷，例如至少约900个连续核苷，如至少约1000个连续核苷，例如至少约1100个连续核苷，如至少约1200个连续核苷，例如至少约1300个连续核苷，如至少约1400个连续核苷，例如至少约1500个连续核苷。21.根据权利要求14至20中任一项所述的方法，其中所述侧翼序列与宿主细胞基因组靶基因的相应区域具有至少85％的序列同一性，例如与宿主细胞基因组靶基因的相应区域具有至少95％的序列同一性，如与宿主细胞基因组靶基因的相应区域具有至少97％的序列同一性，例如与宿主细胞基因组靶基因的相应区域具有至少98％的序列同一性，如与宿主细胞基因组靶基因的相应区域具有至少99％的序列同一性，例如与宿主细胞基因组靶基因的相应区域具有100％的序列同一性。22.根据权利要求14至21中任一项所述的方法，其中(iii)下的所述选择使用所述环状dna载体的可选择的标志基因序列(a)。23.根据权利要求14至21中任一项所述的方法，其中(iii)下的所述选择使用pcr和/或dna测序，如对所述靶向序列和靶区之间的序列连接进行测序。24.根据权利要求14至23中任一项所述的方法，其中在(iv)下选择的所述宿主细胞是通过反选择进行选择的。25.根据权利要求14至24中任一项所述的方法，其中在(iv)下选择的所述宿主细胞对可选择的标志呈阴性。26.根据权利要求14至25中任一项所述的方法，其中在(iv)下选择的所述宿主细胞是使用pcr进行选择的。27.根据权利要求14至26中任一项所述的方法，其中(iv)的产物是包含靶区的缺失、靶区的部分缺失、靶区的序列插入、靶区的点突变或靶区的序列替换的宿主细胞。28.根据权利要求14至27中任一项所述的方法，其中宿主细胞是原核生物。29.根据权利要求14至28中任一项所述的方法，其中宿主细胞是乳杆菌或双歧杆菌。30.根据权利要求14至29中任一项所述的方法，其中宿主细胞选自由以下组成的组：格氏乳杆菌(如格氏乳杆菌dsm 14869)、鼠李糖乳杆菌(如鼠李糖乳杆菌dsm 14870)、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌、阴道乳杆菌、惰性乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌和约氏乳杆菌。31.根据权利要求14至30中任一项所述的方法，其中复制子包含大肠杆菌(e.coli)的复制起点，如pbr322的复制起点。32.根据权利要求14至31中任一项所述的方法，其中复制子包含编码调节蛋白repa的repa或者编码repfib复制蛋白a的repb或者编码复制起始蛋白的repc。33.根据权利要求14至32中任一项所述的方法，其中通过转化如电转化、缀合或转导，引入所述环状dna载体。34.根据权利要求14至33中任一项所述的方法，其中靶基因编码细胞表面蛋白。35.根据权利要求14至34中任一项所述的方法，其中细胞表面蛋白是分选酶依赖性蛋白(sdp)或s层蛋白。36.根据权利要求14至35中任一项所述的方法，其中靶基因编码参与细胞表面分子生
物合成的细胞蛋白。37.根据权利要求14至36中任一项所述的方法，其中细胞表面分子为胞外多糖(eps)。38.根据权利要求14至37中任一项所述的方法，其中靶基因编码参与细菌粘附、自动聚集和/或生物膜形成的蛋白质。39.根据权利要求14至38中任一项所述的方法，其中靶基因选自由n506_1709、n506_1778、n506_0396、n506_0397、n506_0398、n506_0399、n506_0400、n506_0401、n506_0402、n506_0403、n506_0404、n506_0405、n506_0406、n506_0407、n506_0408、n506_0409、n506_0410和n506_0411组成的组。40.根据权利要求14至39中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为格氏乳杆菌(如格氏乳杆菌dsm 14869)。41.一种通过权利要求14至40中任一项所述的方法获得的重组宿主细胞。42.根据权利要求1至13中任一项所述的环状dna载体用于将基因序列引入到宿主细胞基因组中的用途。43.根据权利要求1至13中任一项所述的环状dna载体用于增加宿主细胞的组织粘附的用途。44.根据权利要求43所述的用途，用于增加细菌宿主细胞对阴道组织、优选人阴道组织的组织粘附。45.根据权利要求43或44所述的用途，其中宿主细胞是乳杆菌或双歧杆菌。46.根据权利要求43至45中任一项所述的用途，其中所述宿主细胞选自由以下组成的组：格氏乳杆菌(如格氏乳杆菌dsm 14869)、鼠李糖乳杆菌(如鼠李糖乳杆菌dsm 14870)、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌、阴道乳杆菌、惰性乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌和约氏乳杆菌。47.根据权利要求42至46中任一项所述的用途，其中环状载体引入靶区的缺失、靶区的部分缺失、靶区的序列插入、靶区的点突变或靶区的序列替换。48.根据权利要求42至46中任一项所述的用途，其中所述基因序列在所述宿主细胞中表达。49.根据权利要求42至46中任一项所述的用途，其中所述基因序列阻断内源宿主基因的表达。50.根据权利要求42至46中任一项所述的用途，其中所述基因序列替换相应的内源宿主基因。51.根据权利要求42至50中任一项所述的用途，其中宿主细胞为乳杆菌或双歧杆菌。52.根据权利要求42至51中任一项所述的用途，其中所述宿主细胞选自由以下组成的组：格氏乳杆菌(如格氏乳杆菌dsm 14869)、鼠李糖乳杆菌(如鼠李糖乳杆菌dsm 14870)、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌、阴道乳杆菌、惰性乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌和约氏乳杆菌。53.根据权利要求51或52所述的用途，其中靶基因选自由n506_1709、n506_1778、n506_0396、n506_0397、n506_0398、n506_0399、n506_0400、n506_0401、n506_0402、n506_0403、
n506_0404、n506_0405、n506_0406、n506_0407、n506_0408、n506_0409、n506_0410和n506_0411组成的组。54.根据权利要求53所述的用途，其中所述宿主细胞为格氏乳杆菌(如格氏乳杆菌dsm 14869)。

技术总结
本发明提供了一种环状DNA载体，其可以用于在宿主细胞的靶区中引入特异性突变。本发明进一步提供了使用环状DNA载体来生成工程化宿主细胞的方法。环状DNA载体和方法可用于研究基因功能和生成产生重组基因产物的细胞。基因功能和生成产生重组基因产物的细胞。基因功能和生成产生重组基因产物的细胞。


技术研发人员：左芳雷 曾珠 哈罗德
受保护的技术使用者：鹿园益生菌和酵素有限公司
技术研发日：2020.05.15
技术公布日：2022/7/14