新颖icos抗体及包含它们的肿瘤靶向抗原结合分子
技术领域：
：1.本发明涉及新颖icos抗体和包含它们的肿瘤靶向激动性icos抗原结合分子，以及其作为免疫调节剂在癌症治疗中的用途。
背景技术：
：：2.调节免疫抑制性途径是近来癌症治疗的重大突破。靶向细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4，yervoy/伊匹单抗(ipilimumab))和程序性细胞死亡蛋白1(pd-1，opdivo/纳武单抗(nivolumab)或keytruda/派姆单抗(pembrolizumab))、相应的pd-l1(阿特珠单抗(atezolizumab))的检查点阻断抗体已展现出可接受的毒性、有希望的临床应答、持久的疾病控制和在多种肿瘤适应症患者中改善的存活。然而，只有少数患者对免疫检查点阻断(icb)疗法产生持久应答，其余患者表现为原发性或继发性抗药性，这表明显然需要调节其他途径，从而为更多患者提供存活益处。因此，需要联合策略来改善治疗效益。3.icos(cd278)是诱导性t细胞共刺激因子，并且属于b7/cd28/ctla-4免疫球蛋白超家族(hutloff,等人,nature1999,397)。其表达似乎主要局限于在nk细胞上仅存在微弱表达的t细胞(ogasawara等人,jimmunol.2002,169和未公布的使用人nk细胞的自有数据)。与在t细胞上进行组成型表达的cd28不同，icos几乎不在幼稚的th1和th2效应t细胞群体上表达(pauloscmetal.,scitranslmed2010,2)，而是在静息th17、t滤泡辅助细胞(tfh)和调节性t(treg)细胞上表达。然而，在先前抗原引发、相应的tcr/cd3-接合时，在所有t细胞亚群上均强烈诱导icos(wakamatsu等人,procnatalacadsciusa,2013,110)。4.通过icos途径进行的信号传导发生在其配体，所谓的icos-l(b7h、b7rp-1、cd275)结合时，其在b细胞、巨噬细胞、树突状细胞和经tnf-α处理的非免疫细胞上表达(simpson等人,currentopinioninimmunology2010,22)。cd28和ctla4的配体b7-1和b7-2两者都不能结合或活化icos。尽管如此，已显示出icos-l与cd28和ctla-4均弱结合(yao等人,immunity2011,34)。激活后，icos(二硫醚连接的同型二聚体)通过pi3k和akt途径来诱导信号。与cd28不同，icos具有独特的ymfmsh2结合基序，其招募与cd28招募的同种型相比脂质激酶活性更高的pi3k变体。因此，可以观察到磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸酯的大量产生以及伴随的akt信号传导的增加，表明icos在t细胞存活中的重要作用(simpson等人,currentopinioninimmunology2010,22)。5.如sharpe(immunolrev.,2009,229)所回顾的，icos/icos配体途径通过控制il-10产生tregs，在刺激效应t细胞应答、t依赖性b细胞应答和调节t细胞耐受性方面发挥关键作用。此外，icos对趋化因子(c-x-c基序)受体5(cxcr5) 滤泡辅助t细胞(tfh)，调节生发中心反应和体液免疫的独特t细胞亚群的产生也非常重要。最近在icos缺陷小鼠中的研究表明，icos可以调节白细胞介素-21(il-21)的产生，从而调节t辅助(th)17型(th17)细胞和tfh的扩增。在此背景下，icos被描述为使cd4t细胞向th1样th17表型双极化，这已表明与几种癌症适应症(包括黑素瘤、早期卵巢癌等)患者存活的改善相关(ritayoung,jclincellimmunol.2016,7)。6.icos缺陷小鼠显示出生发中心形成受损，并且il-10和il-17的产生减少，这在多种疾病模型(例如糖尿病(th1)、气道炎症(th2)和eae神经炎症模型(th17))中表现为自身免疫表型发育受损(warnatz等人,blood2006)。鉴于此，icos突变的人类常见变异型免疫缺陷病患者表现出严重的低丙球蛋白血症和b细胞稳态失调(sharpe,immunolrev.,2009,229)。要注意的是，通过icos受体进行的有效共刺激信号传导仅发生在接受同时发生的tcr激活信号的t细胞中(wakamatsu等人,procnatalacadsciusa,2013,110)。7.t细胞双特异性(tcb)分子是极好的免疫细胞接合物，因为它们绕过了相应t细胞受体识别mhci肽的需要，但会使多克隆t细胞能够对细胞表面肿瘤相关抗原产生应答(yuraszeck等人,clinicalpharmacology&therapeutics2017,101)。ceacd3tcb，抗cea/抗cd3双特异性抗体，是使免疫系统参与抗癌的研究性免疫球蛋白g1(igg1)t细胞双特异性抗体。它旨在通过同时与t细胞上的人cd3ε和各种癌细胞(包括crc(结直肠癌)、gc(胃癌)、nsclc(非小细胞肺癌)和bc(乳腺癌))表达的癌胚抗原(cea)结合，从而将t细胞重定向至肿瘤细胞。t细胞和肿瘤细胞的交联导致cd3/tcr下游信号传导，并且导致免疫突触的形成、t细胞活化、细胞毒性颗粒和其他细胞因子的分泌，从而最终导致肿瘤细胞的剂量和时间依赖性裂解。此外，认为ceacd3tcb用于增加t细胞浸润并产生高度发炎的肿瘤微环境，使其成为免疫检查点阻断疗法(icb)的理想组合伙伴，特别是对于因缺乏足够的内源性自适应和功能性免疫浸润而表现出原发性icb抗药性的肿瘤。然而，考虑到肿瘤微环境(tme)中功能失调的t细胞上存在几种共刺激受体(如4-1bb(cd137)、icos和ox40)的矛盾表达，通过阻断t细胞上的单个或多个抑制途径来关闭制动器可能还不够。已发现，当抗cea/抗cd3双特异性抗体(即ceatcb)与肿瘤靶向激动性icos抗原结合分子组合时，会实现更好的抗肿瘤效果。t细胞双特异性抗体向t细胞提供初始tcr激活信号传导，并且其后与肿瘤靶向激动性icos抗原结合分子的结合会进一步增强抗肿瘤t细胞免疫。8.对于icos，越来越多的文献主体实际上支持使cd278结合在cd4 和cd8 效应t细胞上具有抗肿瘤潜力这种观点。icos-icos-l信号传导的激活作为单一疗法以及在抗clta4治疗的背景下，在几种同系小鼠模型中诱导了有效的抗肿瘤应答，其中icos下游信号传导的激活显著增加了抗ctla4疗法的效力(fut等人,cancerres,2011,71和allison等人,wo2011/041613a2,2009)。来自接受抗ctla4抗体治疗的患者的新数据也表明，cd4和cd8t细胞上icos表达水平持续升高与肿瘤患者(如转移性黑素瘤、尿路上皮癌、乳腺癌或前列腺癌患者)的总体存活率改善相关(giacomo等人,cancerimmunolimmunother.2013,62；carthon等人,clincancerres.2010,16；vonderheide等人,clincancerres.2010,16；liakou等人,procnatlacadsciusa2008,105和vonderheide等人,clincancerres.2010,16)。因此，icos阳性t效应细胞被视为伊匹单抗应答的阳性预测生物标志物。目前在晚期非小细胞肺癌或尿路上皮癌患者中测试人源化抗icosigg1抗体jtx2011(vopratelimab)。其作用机制依赖于fcγ交联。最近，已开始进行ky1044(全人抗icosigg4抗体)与阿特珠单抗联合的临床试验(nct03829501)。然而，目前仍需要特别适合与其他治疗剂联合治疗以治疗疾病，特别是癌症的激动性icos抗原结合分子。技术实现要素：9.本发明涉及新颖icos抗体和激动性icos抗原结合分子，所述激动性icos抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与包含所述新颖icos抗体的icos特异性结合的抗原结合结构域。本发明还涉及这些新的激动性icos抗原结合分子及其与其它治疗剂，特别是t细胞活化抗cd3双特异性抗体联合的用途，特别是用于治疗或延缓癌症进展。已经发现，本文所述的联合疗法在诱导早期t细胞活化、t细胞增殖、诱导t记忆细胞以及最终抑制肿瘤生长和消除肿瘤细胞方面比单独用抗cd3双特异性抗体治疗更有效。10.在一个方面，本发明提供一种激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos抗原结合分子包含11.(a)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列；或者12.(b)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或者13.(c)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:24的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:25的氨基酸序列；或者14.(d)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:28的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:29的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:30的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:31的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:32的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:33的氨基酸序列。15.在进一步的方面，提供一种如上定义的激动性icos抗原结合分子，其进一步包含含有能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，所述fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，激动性icos抗原结合分子包含人igg1亚类的fc结构域，其包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。16.在另一个方面，本发明提供一种激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个能够与如前所定义的肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中所述肿瘤相关抗原选自由成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌胚抗原(cea)、叶酸受体α(folr1)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、表皮生长因子受体(egfr)、人表皮生长因子受体2(her2)和p95her2组成的组。17.在一个方面，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与如上定义的肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中所述能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是能够与癌胚抗原(cea)特异性结合的抗原结合结构域。在一个方面，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含18.(a)重链可变区(vhcea)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:52的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:53的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:54的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:55的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:56的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:57的氨基酸序列；或者(b)重链可变区(vhcea)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:60的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:61的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:62的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:63的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:64的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:65的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:60的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:61的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:62的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:63的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:64的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:65的氨基酸序列。19.在另一方面，提供一种如上定义的激动性icos抗原结合分子，其中能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含与seqidno:58的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含与seqidno:59的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者重链可变区(vhcea)，其包含与seqidno:68的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含与seqidno:69的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:58的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:59的氨基酸序列。更具体地，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列。20.在进一步的方面，提供一种根据权利要求1至3中任一项所述的激动性icos抗原结合分子，其中能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是能够与成纤维细胞活化蛋白(fap)特异性结合的抗原结合结构域。在一个方面，能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：(a)重链可变区(vhfap)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:36的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:37的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:38的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:39的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:40的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:41的氨基酸序列；或者21.(b)重链可变区(vhfap)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:44的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:45的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:46的no:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自小鼠免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:10的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:11的氨基酸序列。29.在另一方面，本发明提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:18的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:19的氨基酸序列。在另一方面，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:26的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:27的氨基酸序列。在再一方面，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:34的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:35的氨基酸序列。30.在一个方面，本发明提供一种如前所定义的激动性icos抗原结合分子，其包含31.(a)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，32.(b)一个能够与icos特异性结合的fab片段，以及33.(c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低所述抗原结合分子与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，激动性icos抗原结合分子包含人igg1亚类的fc结构域，其包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。34.在另一方面，本发明提供一种如前所定义的激动性icos抗原结合分子，其包含35.(a)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，36.(b)两个能够与icos特异性结合的fab片段，以及37.(c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低所述抗原结合分子与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，人igg1亚类的fc结构域包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。38.在特定方面，能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是crossfab片段。39.在进一步的方面，提供一种激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，其包含：(a)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列，或者40.(b)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或者41.(c)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:24的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:25的氨基酸序列；或者42.(d)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:28的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:29的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:30的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:31的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:32的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:33的氨基酸序列。43.在一个方面，激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，源自小鼠免疫并包含：重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列。在另一方面，激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，源自兔免疫，并包含:重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列,(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:24的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:25的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:28的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:29的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:30的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:31的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:32的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:33的氨基酸序列。44.在一个方面，提供一种激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，其包含45.(a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者46.(b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者47.(c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者48.(d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。49.在一个方面，激动性icos抗原结合分子是全长抗体。在另一方面，激动性icos抗原结合分子是fab或crossfab片段。在特定方面，激动性icos抗原结合分子是人源化抗体。50.根据本发明的另一方面，提供一种编码如前所述的激动性icos抗原结合分子或icos抗体的分离的核酸，所述激动性icos抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。本发明进一步提供一种载体，特别是表达载体，其包含本发明的分离的核酸；并且提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸或载体。在一些方面，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。51.在另一方面，提供一种产生如前所述的激动性icos抗原结合分子的方法，所述激动性icos抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，所述方法包括在适合于表达激动性icos抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从宿主细胞中回收抗原结合分子。本发明还包括通过本发明方法产生的本文所述的激动性icos抗原结合分子或icos抗体，所述激动性icos抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。52.本发明还提供一种药物组合物，其包含如前所述的激动性icos抗原结合分子和至少一种药用赋形剂，所述icos抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。特别地，药物组合物用于治疗癌症。53.本发明还包括如前所述的包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子或包含激动性icos结合分子的药物组合物用作药物，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。54.在一个方面，提供一种如前所述的包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子或包含激动性icos结合分子的药物组合物，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，用于55.(i)刺激t细胞应答，56.(ii)支持活化t细胞的存活，57.(iii)治疗感染，58.(iv)治疗癌症，59.(v)延缓癌症进展，或60.(vi)延长癌症患者的存活期，61.在具体方面，提供一种如前所述的包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子或如前所述包含激动性icos结合分子的药物组合物，用于治疗癌症，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。62.在另一个具体方面，本发明提供如前所述如本文所述包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子用于治疗癌症，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的所述激动性icos结合分子用于与化疗剂、放射疗法和/或用于癌症免疫疗法的其他试剂联合施用。63.在一个方面，提供如前所述包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子用于治疗癌症，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的所述激动性icos抗原结合分子用于与t细胞活化抗cd3双特异性抗体联合施用。特别地，t细胞活化抗cd3双特异性抗体是抗cea/抗cd3双特异性抗体。64.在进一步的方面，提供如前所述包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子用于治疗癌症，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的所述激动性icos抗原结合分子用于与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂联合施用。在一个方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体或抗pd1抗体。更特别地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂选自由阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗和纳武单抗组成的组。在一个具体方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为阿特珠单抗。65.在进一步的方面，本发明提供一种抑制个体中的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如前所述的激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域；或如前所述包含激动性icos抗原结合分子的药物组合物，所述激动性icos抗原结合分子包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域，以抑制肿瘤细胞的生长。在另一方面，本发明提供一种治疗个体癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的如前所述的激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域。66.还提供如前所述包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子在制造用于治疗有需要的个体的疾病的药物中的用途，特别是在制造用于治疗癌症的药物中的用途。在上述方面中的任何方面，个体为哺乳动物，特别是人。附图说明67.图1a–1h：双特异性激动性icos抗原结合分子示意图。在图1a和图1b中，显示1 1形式的不同类型的fap-icos双特异性抗体(1 1表示与icos以及与fap的单价结合)。图1b中显示的形式也被命名为1 1头至尾。图1c示出2 1形式的fap-icos抗体(对于肿瘤相关靶而言是单价的)，其中fap的vh和vl结构域各自结合到每个fc结构域的c末端，并且在图1d和图1e中，示出两种不同类型的2 1形式，其中包含fap抗原结合结构域的fab结构域与icosigg的fab结构域融合(图1d)，或者其中一个icosfab结构域与fapfab结构域的n末端融合(反向，图1e)。图1f、图1g和图1h示出1 1形式的不同类型的cea-icos双特异性抗体。68.图2a和图2b：所有选定亲本前导克隆作为iggsvsjmab136igg(分子1)与在cho-huicos细胞或sr细胞上表达的icos的结合。图2a示出剂量应答曲线，其示出icos抗体与重组cho细胞上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图2b示出剂量应答曲线，其示出icos抗体与sr细胞上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。被测克隆是icos(009)(分子14)、icos1138(分子18)、1143(分子20)和1167(分子8)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。69.图3a、图3b及图3c：前导克隆009v1、1143v2和1138的选定人源化变体分别与人icos的结合。图中示出剂量应答曲线，其示出三种不同的aicos分子的人源化变体与重组cho细胞上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。70.图4：根据所有选定亲本前导克隆作为iggsvsjmab136的jurkat-nfat测定得到的剂量应答曲线。71.图5a至图5c：根据分别针对前导克隆009v1、1143v2和1138(作为igg)的人源化变体的jurkat-nfat报告测定得到的剂量应答曲线。示出剂量应答曲线，其示出用增加剂量的三种不同aicos分子的人源化变体处理的jurkat-nfat细胞的剂量依赖性活化的每秒计数(cps)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。72.图6a和图6b：双特异性fap-icos抗原结合分子与huicos的结合。图6a示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与重组cho上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。比较2 1形式的双特异性抗体与不同的icos克隆009v1(分子15)、1138(分子19)、1143v2(分子22)和1167(分子9)。图6b示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与重组cho细胞上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。比较包含icos克隆1167的不同形式：分子9(2 1，见图1c)、分子10(1 1，见图1a)和分子11(1 1_ht，见图1b)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。73.图7a和图7b：双特异性fap-icos抗原结合分子与hufap(nih3t3-hfap)的结合。图7a示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与重组3t3-hufap克隆19细胞上的人fap的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。比较2 1形式的双特异性抗体与不同的icos克隆009v1(分子15)、1138(分子19)、1143v2(分子22)和1167(分子9)。图7b示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与重组3t3-hufap克隆19细胞上的人fap的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。比较包含icos克隆1167的不同形式：分子9(2 1，见图1c)、分子10(1 1，见图1a)和分子11(1 1_ht，见图1b)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。74.图8a和图8b：双特异性fap-icos抗原结合分子与活化的pbmc上的食蟹猴icos的结合。示出剂量应答曲线，其示出包含不同icos克隆009v1(分子15)、1138(分子19)、1143v2(分子22)、1167(分子9)和jmab136(分子2)的fap-icos分子的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图8a和图8b分别示出cd4 和cd8 亚群上的结合。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。75.图8c及图8d：双特异性fap-icos抗原结合分子与活化的pbmc上的食蟹猴icos的结合。示出剂量应答曲线，其示出包含含有icos克隆1167的以下不同形式的fap-icos分子的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)：分子9(2 1，见图1c)、分子10(1 1，见图1a)和分子11(1 1_ht)。图8c和图8d分别示出cd4 和cd8 亚群上的结合。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。76.图9a和图9b：双特异性fap-icos抗原结合分子与重组cho细胞上的鼠icos的结合。图9a中示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与鼠icos的剂量依赖性结合的icos 细胞(％)的频率。图9b示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与鼠fap的剂量依赖性结合的icos 细胞(％)的频率。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。提供包含icos克隆1167的以下不同形式的fap-icos分子的数据：分子9(2 1，见图1c)、分子10(1 1，见图1a)和分子11(1 1_ht)。77.图10a至图10c：包含克隆1167的双特异性fap-icos抗原结合分子与人icos(预活化的pbmc)和人fap(nih3t3-hfap)的结合。示出图1a的形式(分子10)、图1d(分子12)和图1e(分子13)的数据。图10a和图10b示出分别针对cd4 和cd8 亚群，fap-icos分子与活化的pbmc上的人icos的剂量依赖性结合。图10c示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与重组3t3-hufap克隆19细胞上的人fap的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。78.图11a至图11c：双特异性cea-icos抗原结合分子与人icos(人pbmc的cd4和cd8亚群)和人cea(mkn-45)的结合。示出cea(a5h1el1d)-icos(1167)1 1(分子41)、cea(a5h1el1d)-icos(h009v1_2)(分子42)和cea(a5h1el1d)-icos(1143v2_1)(分子43)的数据。图11a和图11b示出剂量应答曲线，其示出cea-icos分子与人活化的pbmc(分别为cd4 和cd8 亚群)上的icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图11c示出剂量应答曲线，其示出cea-icos分子与mkn-45细胞上的人cea的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。79.图12a至图12c：选择双特异性形式的前导结合物的种系变体。测试克隆009和1143的不同种系变体作为2 1形式的双特异性fap-icos抗体(图1c)。图12a示出这些分子与在sr细胞上表达的icos的结合，剂量应答曲线示出icos抗体与sr细胞上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图121b示出双特异性fap-icos抗原结合分子与人fap(nih3t3-hfap)的结合。剂量应答曲线示出与重组3t3-hufap克隆19细胞上的人fap进行剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图12c示出在初级pmbc测定中对前导克隆的种系变体的选择。每个点表示个体捐赠者。值表示在整个浓度范围内cd4 t细胞上mficd69的最大值。80.图13a和图13b：在双特异性fap-icos抗原结合分子存在的情况下，tcb介导的t细胞活化增加。示出在5pmmcsptcb存在且fap-icos的浓度增加的情况下，人pbmc效应子、mv3肿瘤细胞以5:1的e:t共孵育48小时后，cd25阳性cd4 t细胞的中位荧光强度(mfi)。图表示出每个分子的三个供体的最大应答。图13a示出不同icos克隆的比较。图13b示出包括克隆1167的不同形式的比较。81.图14a至图14c：在双特异性fap-icos抗原结合分子存在的情况下，tcb介导的t细胞活化增加。示出在80pmceacam5tcb存在且fap-icos浓度增加的情况下，人pbmc效应子、mkn-45肿瘤细胞和nih/3t3-hufap克隆19以5:1:1的e:t共孵育48小时后，cd69阳性cd4 t细胞的中位荧光强度(mfi)。图14a和图14b示出两个供体的剂量应答图表。点表示技术三次重复的平均值，误差条表示sd。图14c示出每个分子的两个供体的最大应答。每个点表示技术三次重复的平均值。82.图15a至图15c：在双特异性cea-icos抗原结合分子存在的情况下，与fap-icos相比，tcb介导的t细胞活化增加。示出在80pmceacam5tcb存在且fap-icos的浓度增加的情况下，人pbmc效应子、mkn-45肿瘤细胞和nih/3t3-hufap克隆19以5:1:1的e:t共孵育48小时后，cd69阳性cd4 t细胞的中位荧光强度(mfi)。图15a和图15b示出两个供体的剂量应答图表。点表示技术三次重复的平均值，误差条表示sd。图15c图表示出每个分子的两个供体的最大应答。每个点表示技术三次重复的平均值。83.图16a至图16c：在双特异性cea-icos抗原结合分子存在的情况下，tcb介导的t细胞活化增加。示出在80pmceacam5tcb存在且cea-icos的浓度增加的情况下，人pbmc效应子、mkn-45肿瘤细胞和nih/3t3-hufap克隆19以5:1:1的e:t共孵育48小时后，cd69阳性cd4 t细胞的中位荧光强度(mfi)。图16a和图16b示出两个供体的剂量应答图表。点表示技术三次重复的平均值，误差条表示sd。图16c图表示出每个分子的三个供体的最大应答。每个点表示技术三次重复的平均值。84.图17：在nsg小鼠中单次注射后包含icos克隆1167的三种双特异性fap-icos抗原结合分子(不同形式)的药代动力学曲线(实例9.1)85.图18：在人源化小鼠中的mkn45异种移植物中使用三种双特异性fap-icos抗原结合分子联合ceacam5tcb的疗效研究的研究设计和治疗组(实例9.2)。86.图19a至图19g：在人源化小鼠中的mkn45异种移植物中以相同剂量进行不同形式的fap-icos和ceacam5tcb联合用药的疗效研究。示出在y轴上绘制的平均肿瘤体积(图19f)或单个小鼠中的肿瘤生长(图19a至图19e)。图19g总结绘制的单个小鼠第50天的肿瘤重量。可以看出，在所有fap-icos分子存在的情况下，tcb介导的肿瘤消退增加。87.图20a至图20f：在人源化小鼠中的mkn45异种移植物中以相同剂量进行不同形式的fap-icos和ceacam5tcb联合用药的疗效研究。示出肿瘤和脾中的immunopd数据。88.图21a至图21g：在人源化小鼠中的mkn45异种移植物中以不同剂量进行1 1形式的fap-icos分子和ceacam5tcb联合用药的剂量应答研究。示出在y轴上绘制的平均肿瘤体积(图21f)或单个小鼠中的肿瘤生长(图21a至图21e)。图21g总结绘制的单个小鼠第50天的肿瘤重量。可以看出，在最低剂量的fap-icos存在的情况下，tcb介导的肿瘤消退增加。89.图22a至图22f：在人源化小鼠中的mkn45异种移植物中以不同剂量进行的具有1 1形式的fap-icos分子的fap-icos和ceacam5tcb联合用药的剂量应答研究。示出肿瘤和脾中的immunopd数据。90.图23：细胞因子分析。在人源化nsg小鼠中的mkn45和3t3-hfap细胞共移植模型中，用不同剂量的fap-icos和ceacam5-tcb联合疗法后选定趋化因子和细胞因子表达的瘤内变化。具体实施方式91.定义92.除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。93.如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的示例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。94.如本文所用，术语“与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域”或“能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域”或“能够与肿瘤相关抗原特异性结合的部分”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合结构域能够通过其靶细胞抗原活化信号传导。在一个特定方面，抗原结合结构域能够将与其连接的实体(例如icos激动剂)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的抗体及其片段。另外，能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如基于设计的重复序列蛋白或设计的重复序列结构域的结合结构域(参见例如wo2002/020565)。95.关于抗体或其片段，术语“能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域”是指分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并且与之互补的区域。可通过例如一种或多种抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供能够特异性抗原结合的抗原结合结构域。具体地，能够特异性抗原结合的抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。在另一方面，“能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域”也可以是fab片段或交叉fab片段。96.本文的术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。97.如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。98.如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合到至少两种独特的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。99.本技术中所用的术语“价态”表示在对一种独特抗原决定簇具有特异性的抗原结合分子中存在特定数量的对一种独特抗原决定簇具有特异性的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在对特定抗原决定簇具有特异性的两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在本发明的特定方面，根据本发明的双特异性抗原结合分子对特定抗原决定簇可以是单价的，意味着它们对所述抗原决定簇仅具有一个结合位点，或者对特定抗原决定簇可以是二价或四价的，意味着它们对所述抗原决定簇分别具有两个结合位点或四个结合位点。100.术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其包含通过二硫键键合的两条轻链和两条重链。从n-末端到c-末端，每条重链具有可变区(vh)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3)(也称为重链恒定区)。类似地，从n-末端到c-末端，每条轻链具有可变区(vl)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是轻链恒定结构域(cl)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，所述五种类型被称为α(iga)、δ(igd)、ε(ige)、γ(igg)或μ(igm)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(igg1)、γ2(igg2)、γ3(igg3)、γ4(igg4)、α1(iga1)和α2(iga2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。[0101]“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、交叉fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见hudson等人，natmed9,129-134(2003)。关于scfv片段的综述，参见例如plückthun在theharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)中所述；还可参见wo93/16185；以及美国专利5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的fab片段和f(ab')2片段的讨论，参见美国专利5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等人，natmed9,129-134(2003)；以及hollinger等人，procnatlacadsciusa90,6444-6448(1993)。在hudson等人，natmed9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(domantis,inc.，waltham，ma；参见例如美国专利6,248,516b1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。[0102]木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。因此，如本文所用，术语“fab片段”是指包含轻链片段以及重链的vh结构域和第一恒定结构域(ch1)的抗体片段，所述轻链片段包含vl结构域和轻链恒定结构域(cl)。fab'片段与fab片段的不同之处在于fab'片段在重链ch1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab’‑sh是fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点(两个fab片段)和fc区的一部分。[0103]术语“交叉fab片段”或“xfab片段”或“交换型fab片段”是指这样的fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交换型fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一个方面，fab重链和轻链的可变区被交换，即交换型fab分子包含含有轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)的肽链，以及含有重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)的肽链。该交换型fab分子也称为crossfab(vlvh)。在另一个方面，当fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换型fab分子包含含有重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)的肽链，以及含有轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)的肽链。该交换型fab分子也称为crossfab(clch1)。[0104]“单链fab片段”或“scfab”是由抗体重链可变结构域(vh)、抗体恒定结构域1(ch1)、抗体轻链可变结构域(vl)、抗体轻链恒定结构域(cl)和连接基组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述连接基在n-末端至c-末端方向上具有以下顺序中的一种：a)vh-ch1-连接基-vl-cl，b)vl-cl-连接基-vh-ch1，c)vh-cl-连接基-vl-ch1，或d)vl-ch1-连接基-vh-cl；并且其中所述连接基是至少30个氨基酸，优选是32个至50个氨基酸的多肽。所述单链fab片段经由cl结构域与ch1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链fab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。[0105]“交换型单链fab片段”或“x-scfab”是由抗体重链可变结构域(vh)、抗体恒定结构域1(ch1)、抗体轻链可变结构域(vl)、抗体轻链恒定结构域(cl)和连接基组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述连接基在n末端至c末端方向上具有以下顺序中的一种：a)vh-cl-连接基-vl-ch1和b)vl-ch1-连接基-vh-cl；其中vh和vl一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中所述连接基是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scfab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。[0106]“单链可变片段(scfv)”是抗体的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的融合蛋白，通过10至约25个氨基酸的短连接基肽连接。连接基通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将vh的n末端与vl的c末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了连接基，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scfv抗体例如描述于houston,j.s.,methodsinenzymol.203(1991)46-96)中。另外，抗体片段包含单链多肽，所述单链多肽的特征在于具有vh结构域，即能够与vl结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有vl结构域的特征，即能够与vh结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。[0107]“支架抗原结合蛋白”是本领域已知的，例如纤连蛋白和设计的锚蛋白重复序列蛋白(darpin)已被用作抗原结合结构域的替代支架，参见例如gebauer和skerra，engineeredproteinscaffoldsasnext-generationantibodytherapeutics.curropinchembiol13:245-255(2009)和stumpp等人，darpins:anewgenerationofproteintherapeutics.drugdiscoverytoday13:695-701(2008)。在本发明的一个方面中，支架抗原结合蛋白选自由以下项组成的组：ctla-4(evibody)、脂质运载蛋白(anticalin)、蛋白a衍生的分子(诸如蛋白a的z结构域(亲和体))、a结构域(avimer/巨型抗体)、血清转铁蛋白(反式体)；设计的锚蛋白重复序列蛋白(darpin)、抗体轻链或重链的可变结构域(单结构域抗体，sdab)、抗体重链的可变结构域(纳米抗体，avh)、vnar片段、纤连蛋白(adnectin)、c型凝集素结构域(四连接素)；新抗原受体β-内酰胺酶的可变结构域(vnar片段)、人γ-晶体蛋白或泛素蛋白(affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、微型体(诸如来自knottin家族的蛋白质)、肽适体和纤连蛋白(adnectin)。ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4)是主要在cd4 t细胞上表达的cd28家族受体。其细胞外结构域具有可变结构域样ig折叠。对应于抗体cdr的环可以用异源序列取代，以赋予不同的结合性质。经工程化改造以具有不同结合特异性的ctla-4分子也称为evibody(例如us7166697b1)。evibody与抗体(例如结构域抗体)的分离的可变区大小大致相同。关于进一步的细节，参见journalofimmunologicalmethods248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是细胞外蛋白质家族，其运输小的疏水性分子，诸如类固醇、胆素、类维生素a和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端处具有许多环，可以工程化改造成与不同的靶抗原结合。anticalin的大小介于160-180个氨基酸之间，并且来源于脂质运载蛋白。关于进一步的细节，参见biochimbiophysacta1482:337-350(2000)、us7250297b1和us20070224633。亲和体是来源于金黄色酿脓葡萄球菌(staphylococcusaureus)的蛋白a的支架，其可以被工程化改造以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化形成了文库。关于进一步细节，参见proteineng.des.sel.2004,17,455-462和ep1641818a1。avimer是来源于a结构域支架家族的多结构域蛋白质。约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键键合结构。多样性是通过重组a结构域家族表现出的自然变异而形成的。关于进一步的细节，参见naturebiotechnology23(12),1556-1561(2005)和expertopiniononinvestigationaldrugs16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列来工程化改造转铁蛋白，以结合不同的靶抗原。工程化改造的转铁蛋白支架的示例包括反式体。关于进一步的细节，参见j.biol.chem274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复序列蛋白(darpin)来源于锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞支架的附接的蛋白质家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33残基基序。它们可通过随机化每个重复序列中的第一α-螺旋和β-转角中的残基，而工程化改造成结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(亲和力成熟方法)。关于进一步的细节，参见j.mol.biol.332,489-503(2003)、pnas100(4),1700-1705(2003)和j.mol.biol.369,1015-1028(2007)以及us20040132028a1。单结构域抗体是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。第一单结构域来源于骆驼科动物的抗体重链的可变结构域(纳米抗体或vhh片段)。此外，术语单结构域抗体包含自体人重链可变结构域(avh)或来源于鲨鱼的vnar片段。纤连蛋白可以经工程化改造以结合抗原的支架。adnectin由iii型人纤连蛋白(fn3)的15个重复单元的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。β-夹层的一个端部处的三个环可以经工程化改造，以使adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗靶标。关于进一步细节，参见proteineng.des.sel.18,435-444(2005)、us20080139791、wo2005056764和us6818418b1。肽适体是组合的识别分子，该组合的识别分子由恒定的支架蛋白，通常是硫氧还蛋白(trxa)组成，所述恒定的支架蛋白含有在活性位点处插入的受约束的可变肽环。关于进一步细节，参见expertopin.biol.ther.5,783-797(2005)。微型体来源于含有3-4个半胱氨酸桥、长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，所述微蛋白的示例包括kalatabi和芋螺毒素以及knottin。微蛋白具有环，其可以经工程化改造为包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠。关于工程化改造的knottin结构域的进一步细节，参见wo2008098796。[0108]作为参考分子的“结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中所述抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。[0109]术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原很大的情况下，抗原结合分子可以仅与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。[0110]如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ecm)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。[0111]“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(spr)技术(在biacore仪器上分析)(liljeblad等人，glycoj17,323-329(2000))以及传统的结合测定(heeley,endocrres28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过spr所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于所述抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子的解离常数(kd)为≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm或≤0.001nm(例如10-8m或更低，例如10-8m至10-13m，例如10-9m至10-13m)。[0112]“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以用解离常数(kd)表示，解离常数(kd)是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(spr)。[0113]如本文所用的“肿瘤相关抗原”或taa是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。在某些实施例中，靶细胞抗原为肿瘤细胞表面的抗原。在一个实施例中，taa选自由以下项组成的组：成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌胚抗原(cea)、叶酸受体α(folr1)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(mcsp)、表皮生长因子受体(egfr)、人表皮生长因子受体2(her2)和p95her2。特别是，肿瘤相关抗原是成纤维细胞活化蛋白(fap)或癌胚抗原(cea)。[0114]术语“成纤维细胞活化蛋白(fap)”也称为脯氨酰内肽酶fap或seprase(ec3.4.21)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然fap，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工fap，以及通过细胞中加工产生的任何形式的fap。该术语还涵盖fap的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，本发明的抗原结合分子能够特异性结合到人、小鼠和/或食蟹猴fap。人fap的氨基酸序列示出于uniprot(www.uniprot.org)登录号q12884(149版，seqidno:254)或ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov/)refseqnp_004451.2中。人fap的细胞外结构域(ecd)从26位的氨基酸延伸至760位的氨基酸。his标记的人fapecd的氨基酸序列示出于seqidno255中。小鼠fap的氨基酸序列示出于uniprot登录号p97321(126版，seqidno:256)或ncbirefseqnp_032012.1中。小鼠fap的细胞外结构域(ecd)从26位的氨基酸延伸至761位的氨基酸。seqidno257示出his标记的小鼠fapecd的氨基酸序列。seqidno258示出his标记的食蟹猴fapecd的氨基酸序列。优选地，本发明的抗fap结合分子结合到fap的细胞外结构域。[0115]术语“癌胚抗原(cea)”也称为癌胚抗原相关细胞粘附分子5(ceacam5)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然cea，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人cea的氨基酸序列示出于uniprot登录号p06731(151版，seqidno:259)中。长期以来，cea被鉴定为一种肿瘤相关的抗原(gold和freedman，jexpmed.，121:439-462，1965；berinsteinn.l.，jclinoncol.，20:2197-2207，2002)。cea最初被归类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现已在多种正常成人组织中鉴定出来。这些组织主要来源于上皮，包括胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的细胞以及结肠、子宫颈、汗腺和前列腺的细胞(nap等人，tumourbiol.，9(2-3):145-53，1988；nap等人，cancerres.，52(8):2329-23339，1992)。上皮来源的肿瘤及其转移均包含cea作为肿瘤相关抗原。cea本身的存在并不表示已转化为癌细胞，但cea的分布具有指示性。在正常组织中，cea通常在细胞顶面上表达(s.,semincancerbiol.9(2):67-81(1999))，使其无法被血流中的抗体吸收。与正常组织相比，cea倾向于在癌细胞的整个表面表达(s.,semincancerbiol.9(2):67-81(1999))。表达模式的这一变化使cea易于与癌细胞中的抗体结合。此外，cea在癌细胞中的表达增加。此外，cea表达的增加促进细胞间粘附的增加，其可能导致转移(marshallj.,seminoncol.,30(asuppl.8):30-6,2003)。cea在各种肿瘤实体中的表达普遍非常高。根据已发表的数据，自己在组织样品中实施的分析证实了cea的高发性，其中在大肠癌(crc)中的发生率为约95％，在胰腺癌中的发生率为90％，在胃癌中的发生率为80％，在非小细胞肺癌(nsclc，与her3共表达)中的发生率为60％，在乳腺癌中的发生率为40％；并且发现在小细胞肺癌和胶质母细胞瘤中的表达水平低。[0116]cea易于从细胞表面裂解，并且直接或通过淋巴管从肿瘤中流入血流中。由于这种特性，血清cea水平已被用作诊断癌症和筛查癌症(尤其是结直肠癌)复发的临床指标(goldenbergdm.，theinternationaljournalofbiologicalmarkers，7:183-188，1992；chaui.等人，jclinoncol.，22:1420-1429，2004；flamini等人，clincancerres；12(23):6985-6988，2006)。[0117]术语“folr1”是指叶酸受体α，并且已被确定为许多癌症的潜在预后和治疗靶点。除非另有说明，否则它是指来自任何脊椎动物来源的任何天然folr1，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人folr1的氨基酸序列如uniprot保藏号p15328(seqidno:260)所示，鼠folr1具有uniprot保藏号p35846(seqidno:261)的氨基酸序列，且食蟹猴folr1具有uniprot保藏号g7pr14(seqidno:262)的氨基酸序列。folr1是一种在细胞质膜上表达的n-糖基化蛋白。folr1对叶酸和几种还原的叶酸衍生物有很高的亲和力，并且介导生理性叶酸(5-甲基四氢叶酸)向细胞内部的递送。folr1是folr1引导的癌症治疗的理想靶点，因为它在绝大多数卵巢癌以及许多子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌和乳腺癌中过表达，而folr1在正常组织上的表达仅限于肾近端小管上皮细胞的顶端膜、肺的肺泡肺细胞、膀胱、睾丸、脉络丛和甲状腺。最近的研究发现，folr1在三阴性乳腺癌中的表达特别高(necela等人plosone2015,10(3),e0127133)。[0118]术语“黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(mcsp)”也称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然mcsp，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人mcsp的氨基酸序列示出于uniprot登录号q6uvk1(103版，seqidno:263)中。mcsp是一种高度糖基化的完整膜硫酸软骨素蛋白聚糖，由细胞膜上表达的n-连接的280kda糖蛋白组分和450kda硫酸软骨素蛋白聚糖组分组成(ross等人,arch.biochem.biophys.1983,225:370-38)。mcsp更广泛地分布在许多正常和转化的细胞中。特别是，mcsp几乎存在于表皮的所有基底细胞中。mcsp在黑素瘤细胞中被差异表达，并且在所分析的90％以上的良性痣和黑素瘤病变中均被表达。还发现mcsp在非黑素细胞来源的肿瘤(包括基底细胞癌、各种神经嵴来源的肿瘤)和乳腺癌中被表达。[0119]术语“表皮生长因子受体(egfr)”也称为原癌基因c-erbb-1或受体酪氨酸蛋白激酶erbb-1，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然egfr，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人egfr的氨基酸序列示出于uniprot登录号p00533(211版，seqidno:264)中。原癌基因“her2”(人表皮生长因子受体2)编码蛋白酪氨酸激酶(p185her2)，其与人表皮生长因子受体相关且有些同源。her2在本领域也称为c-erbb-2，并且有时称为大鼠同源物neu。her2的扩增和/或过表达与多种人类恶性肿瘤有关，并且似乎完整地参与25％-30％的人类乳腺癌和卵巢癌的进展。此外，扩增程度与观察到的中位患者存活期呈负相关(slamon,d.j.等人,science244:707-712(1989))。人her2的氨基酸序列示出于uniprot登录号p04626(230版，seqidno:265)中。本文使用的术语“p95her2”是指her2受体蛋白的羧基末端片段(ctf)，其也称为“611-ctf”或“100-115kdap95her2”。通过启动全长her2分子的密码子位置611处的her2mrna翻译，在细胞中产生p95her2片段(anido电容,emboj25；3234-44(2006))。它的分子量为100至115kda，并且在细胞膜上表达，其中它可形成由分子间二硫键维持的同型二聚体(pedersen等人,molcellbiol29,3319-31(2009))。人p95her2的示例性序列在seqidno:266中给出。[0120]除非另有说明，否则术语“icos”(诱导性t细胞共刺激因子)是指来自任何脊椎动物来源的任何诱导性t细胞共刺激蛋白，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。icos，也称为ailim或cd278，是cd28超家族(cd28/ctla-4细胞表面受体家族)的成员，并且在t细胞初始活化后在t细胞上被特异性表达。icos还在其他t细胞亚群(包括th1、th2和th17)的发育和功能中发挥作用。值得注意的是，icos共同刺激与th1和th2细胞相关联的t细胞增殖和细胞因子分泌。因此，icosko小鼠在各种疾病模型(包括糖尿病(th1)、气道炎症(th2)和eae神经炎症模型(th17))中表现出自身免疫表型发育受损。除了调节t效应(teff)细胞功能外，icos还调节t调节细胞(tregs)。icos在treg上高水平表达，并且与treg稳态和功能有关。激活后，icos(二硫醚连接的同型二聚体)通过pi3k和akt途径来诱导信号。随后的信号传导事件导致谱系特异性转录因子(如t-bet、gata-3)的表达，并且继而影响t细胞增殖和存活。该术语还涵盖icos的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。人icos的氨基酸序列示出于uniprot(www.uniprot.org)登录号q9y6w8(seqidno:1)中。[0121]如前所述，icosl配体(icos-l；b7-h2；b7rp-1；cd275；gl50)，也是b7超家族的成员，是icos的膜结合天然配体，并且在b细胞、巨噬细胞和树突状细胞的细胞表面上被表达。在它与icos相互作用时，icos-l在细胞表面上起非共价连接的同型二聚体的作用。还报告了人icos-l与人cd28和ctla-4结合(yao等人,2011,immunity,34:729-740)。huicos-l的胞外结构域的示例性氨基酸序列在seqidno:215中给出。[0122]术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为vh和vl)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(fr)和三个高变区(hvr)。参见例如，kindt等人，kubyimmunology，第6版，w.h.freemanandco.，第91页(2007)。单个vh或vl结构域可足以赋予抗原结合特异性。[0123]如本文所用的术语“高变区”或“hvr”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“cdr”)。[0124]通常，抗体包含六个cdr；三个在vh中(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)，并且三个在vl中的(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)。本文中的示例性cdr包括：[0125](a)在氨基酸残基26-32(l1)、50-52(l2)、91-96(l3)、26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)处发生的高可变环(chothia和lesk，j.mol.biol.196:901-917(1987))；[0126](b)存在于氨基酸残基24-34(l1)、50-56(l2)、89-97(l3)、31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)处的cdr(kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))；以及[0127](c)存在于氨基酸残基27c-36(l1)、46-55(l2)、89-96(l3)、30-35b(h1)、47-58(h2)和93-101(h3)处的抗原接触点(maccallum等人，j.mol.biol.262:732-745(1996))。[0128]除非另有说明，否则cdr根据kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域技术人员将理解，也可以根据chothia(同上)、mccallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定cdr名称。[0129]kabat等人定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将该“kabat编号”系统分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的ntkvdkkv(seqidno:267)的氨基酸序列。通常，具有epksc的氨基酸序列(seqidno:268)的片段跟随以连接ch1结构域与铰链区。[0138]术语“铰链区”表示抗体重链多肽的在野生型抗体重链中连接ch1结构域和ch2结构域的部分，例如根据kabat的eu编号系统从约216位至约230位，或根据kabat的eu编号系统从约226位至约230位。其他igg亚类的铰链区可以通过与igg1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定。铰链区通常是由两种氨基酸序列相同的多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含多达25个氨基酸残基，并且是柔性的，允许相关联靶结合位点独立移动。铰链区可细分为三个结构域：上铰链区、中铰链区和下铰链区(例如，参见roux,等人,j.immunol.161(1998)4083)。[0139]本文中的术语“fc结构域”或“fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链c末端区域。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。在一个方面，人igg重链fc结构域从cys226或从pro230或从ala231延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的c末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者所述抗体可以包括全长重链的切割变体。这可能是重链的最后两个c末端氨基酸为甘氨酸(g446)和赖氨酸(k447，根据eu索引)的情况。因此，fc区的c末端赖氨酸(lys447)或c末端甘氨酸(gly446)和赖氨酸(lys447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含fc区的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有c末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个方面，包括如本文所指定的fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的c末端甘氨酸-赖氨酸二肽(g446和k447，根据eu索引编号)。在一个方面，包括如本文所指定的fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，所述重链包含另外的c末端甘氨酸残基(g446，根据eu索引编号)。iggfc区包含iggch2结构域和iggch3结构域。[0140]人iggfc区的“ch2结构域”通常从约eu231位的氨基酸残基延伸至约eu340位的氨基酸残基(根据kabat的eu编号系统)。在一个方面，ch2结构域具有apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqestyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskak(seqidno:269)的氨基酸序列。ch2结构域的独特之处在于它与另一个结构域的配对不紧密。相反，两个n连接的支链碳水化合物链介于完整天然fc区的两个ch2结构域之间。据推测，碳水化合物可能为结构域-结构域配对提供替代物，并有助于稳定ch2结构域。burton,mol.immunol.22(1985)161-206。在一个方面中，碳水化合物链连接至ch2结构域。本文的ch2结构域可以是天然序列ch2结构域或变体ch2结构域。[0141]“ch3结构域”包括fc区中残基c末端至ch2结构域的延伸部分，表示大致从eu341位延伸至eu446位(根据kabat的eu编号系统)的抗体重链多肽部分。在一个方面，ch3结构域具有gqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seqidno:270)的氨基酸序列。本文的ch3区可以是天然序列ch3结构域或变体ch3结构域(例如在一条链中具有引入的“突起”(“杵”)而在另一条链中具有相应的引入的“空腔”(“臼”)的ch3结构域；参见以引用方式明确并入本文的美国专利号5,821,333)。此类变体ch3结构域可用于促进如本文所述的两条不相同的抗体重链的异二聚化。在一个实施例中，人igg重链fc区从cys226或从pro230延伸至重链的羧基末端。然而，fc区的c末端赖氨酸(lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据eu编号系统，eu编号系统也称为eu索引，如在kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中所述。[0142]“杵臼结构(knob-into-hole)”技术描述于例如us5,731,168；us7,695,936；ridgway等人，proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述突起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在一个具体实施例中，突起修饰包含fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代t366w，而孔修饰包含fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代t366s、l368a和y407v。在另一个具体实施例中，包含突起修饰的fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代s354c，而包含孔修饰的fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代y349c。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc区的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定化二聚体(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。[0143]“与免疫球蛋白的fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。例如，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的fc区的n-末端或c-末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。可以根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见例如bowie,j.u.等人，science247:1306-10(1990))。[0144]术语“效应子功能”是指可归因于抗体的fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)、fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如b细胞受体)，以及b细胞活化。[0145]fc受体结合依赖性效应子功能可通过抗体的fc区与fc受体(fcr)的相互作用来介导，fc受体是造血细胞上的特异性细胞表面受体。fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已被证明可通过吞噬免疫复合物来介导去除抗体包被的病原体，并且通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)来裂解涂有相应抗体的红细胞及其他各种细胞靶点(例如，肿瘤细胞)(参见例如vandewinkel,j.g.和anderson,c.l.，j.leukoc.biol.49(1991)511-524)。fcrs由其对免疫球蛋白同种型的特异性来限定：igg抗体的fc受体称为fcγr。fc受体结合描述于例如：ravetch,j.v.和kinet,j.p.，annu.修订版，immunol.9(1991)457-492；capel,p.j.等人，immunomethods4(1994)25-34；dehaas,m.等人，j.lab.clin.med.126(1995)330-341；以及gessner,j.e.等人，ann.hematol.76(1998)231-248。[0146]igg抗体(fcγr)fc区受体的交联触发多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞细胞毒性、炎症介质的释放以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。已在人体中鉴no:281)、ggsg(seqidno:282)、ggsgngsg(seqidno:283)、ggngsgsg(seqidno:284)和ggngsg(seqidno:285)。特定目标肽连接基为(g4s)(seqidno:271)、(g4s)2或ggggsggggs(seqidno:272)、(g4s)3(seqidno:276)和(g4s)4(seqidno:277)。[0155]如本技术中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、蛋氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)，以及缬氨酸(val，v)。[0156]“融合”或“连接”意指组分(例如多肽和所述tnf配体家族成员的胞外域)通过肽键、直接或经由一个或多个肽连接基连接。[0157]相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基并引入缺口(如果需要的话)以实现最大的序列同一性百分比后，并且在不将任何保守取代考虑为所述序列同一性的一部分的情况下，与所述参考多肽序列中的氨基酸残基相同的所述候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如blast、blast-2、align.sawi或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序align-2来生成氨基酸序列同一性％的值。align-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(genentech,inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到u.s.copyrightoffice,washingtond.c.,20559，在那里以美国版权登记号txu510087注册。align-2程序可从基因泰克公司(genentech,inc.,southsanfrancisco,california)公开获得，或者可以从所述源代码编译。align-2程序应经编译以在unix操作系统上使用，所述unix操作系统包括数字unixv4.0d。所有序列比较参数均由align-2程序设置并且不变。在采用align-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列a与给定氨基酸序列b的氨基酸序列同一性％(其可以另选地表达为给定氨基酸序列a具有或包含与给定氨基酸序列b的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：[0158]100乘以分数x/y[0159]其中x是由序列比对程序align-2在该程序对a和b的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中y是b中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，a与b的氨基酸序列同一性％将不等于b与a的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用align-2计算机程序获得的。[0160]在某些实施例中，考虑了本文提供的激动性icos结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善激动性icos结合分子的结合亲和力和/或其他生物特性。激动性icos结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码分子的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。用于取代诱变的感兴趣的位点包括hvr和框架(fr)。保守性取代在表b中表头“优选的取代”下提供，并在下文中参考氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可以将氨基酸取代引入感兴趣的分子中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的adcc或cdc)筛选。[0161]表a[0162][0163][0164]可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：[0165](1)疏水性；正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；[0166](2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；[0167](3)酸性：asp、glu；[0168](4)碱性：his、lys、arg；[0169](5)影响链取向的残基：gly，pro；[0170](6)芳族：trp、tyr、phe。[0171]非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。[0172]术语“氨基酸序列变体”包括实质性变体，其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸取代。通常，相对于亲本抗原结合分子，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简而言之，将一个或多个hvr残基突变并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个hvr内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的抗原结合能力即可。例如，可在hvr中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。另选地或另外地，利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。[0173]氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入的实例包括激动性icos结合分子，其n或c末端与多肽融合，这会增加激动性icos结合分子的血清半衰期。[0174]在某些实施例中，改变本文提供的激动性icos结合分子以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，从而便利地获得分子的糖基化变体。当激动性icos结合分子包含fc结构域时，与其连接的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过n-连接连接于fc区的ch2结构域的asn297。参见，例如，wright等人tibtech15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、n-乙酰基葡糖胺(glcnac)、半乳糖和唾液酸，以及连接于双触角寡糖结构的“茎”中的glcnac的岩藻糖。在一些实施例中，可以对激动性icos结合分子中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的变体。在一个方面，提供了激动性icos结合分子的变体，其具有缺乏连接(直接或间接)于fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。此类岩藻糖基化变体可具有改善的adcc功能，参见例如美国专利公开号us2003/0157108(presta,l.)或us2004/0093621(协和发酵工业株式会社(kyowahakkokogyoco.,ltd))。本发明的激动性icos结合分子的其他变体包括具有两分型寡糖的变体，例如其中与fc区连接的双触角寡糖是通过glcnac两分的。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能，参见例如wo2003/011878(jean-mairet等人)；美国专利号6,602,684(umana等人)；以及us2005/0123546(umana等人)。还提供了在附接于fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的cdc功能并描述于例如wo1997/30087(patel等人)；wo1998/58964(raju,s.)；以及wo1999/22764(raju,s.)中。[0175]在某些实施例中，可期望产生本发明的激动性icos结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体，例如“thiomab”，其中分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于分子的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或连接基-药物部分缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的v205(kabat编号)；重链的a118(eu编号)；以及重链fc区的s400(eu编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述形成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。[0176]在某些方面，可进一步修饰本文提供的激动性icos结合分子以使其含有本领域已知且易于获得的另外的非蛋白质性部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接于抗体的聚合物的数目可变化，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、双特异性抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。在另一方面，提供可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质性部分是碳纳米管(kam,n.w.等人，proc.natl.acad.sci.usa102(2005)11600-11605)。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害，但是将非蛋白质性部分加热至抗体-非蛋白质性部分附近的细胞被杀死的温度的波长。在另一方面，可以获得本文提供的激动性icos结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒性剂缀合的抗体。[0177]术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使rna(mrna)、病毒来源的rna或质粒dna(pdna)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(pna)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如dna或rna片段。[0178]关于“分离的”核酸分子或多核苷酸，是指已经从其天然环境中移除的核酸分子，dna或rna。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实施例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含在通常包含多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。分离的rna分子包括本发明的体内或体外rna转录物，以及正链和负链形式和双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。[0179]关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如align-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。[0180]术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体dna、质体dna、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。[0181]术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导所述基因的表达的dna分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mrna的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。[0182]术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如cho细胞、bhk细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、yo骨髓瘤细胞、p3x63小鼠骨髓瘤细胞、per细胞、per.c6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。[0183]药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。[0184]药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。[0185]“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。[0186]术语“药物组合物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用配制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。[0187]“药用赋形剂”是指药物组合物中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药用赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。[0188]术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。[0189]如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。[0190]如本文所用的术语“癌症”是指增生性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(nscl)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomachcancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括以上癌症中的任一种的难治性型式，或一种或多种以上癌症的组合。[0191]本发明的激动性icos结合分子[0192]本发明提供了新型双特异性抗原结合分子，其具有特别有利的性质，诸如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物学活性、靶向效率、降低的毒性、可以给予患者的扩展剂量范围以及从而可能增强的功效。[0193]包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域的示例性激动性icos结合分子[0194]在一个方面，本发明提供激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos抗原结合分子包含(a)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列；或者[0195](b)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或者[0196](c)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨idno:65的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:60的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:61的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:62的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:63的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:64的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:65的氨基酸序列。[0208]在另一方面，提供一种如上定义的激动性icos抗原结合分子，其中能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含与seqidno:58的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含与seqidno:59的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者重链可变区(vhcea)，其包含与seqidno:68的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含与seqidno:69的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:58的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:59的氨基酸序列。更具体地，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列。[0209]在进一步的方面，提供一种根据权利要求1至3中任一项所述的激动性icos抗原结合分子，其中能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是能够与成纤维细胞活化蛋白(fap)特异性结合的抗原结合结构域。在一个方面，能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：(a)重链可变区(vhfap)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:36的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:37的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:38的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:39的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:40的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:41的氨基酸序列；或者[0210](b)重链可变区(vhfap)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:44的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:45的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:46的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:47的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:48的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:49的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：(a)重链可变区(vhfap)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:36的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:37的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:38的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:39的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:40的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:41的氨基酸序列。[0211]在另一方面，提供一种激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个能够与fap特异性结合的抗原结合结构域，其中能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：(a)重链可变区(vhfap)，其包含与seqidno:42的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含与seqidno:43的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(b)重链可变区(vhfap)，其包含与seqidno:50的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含与seqidno:51的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在特定方面，能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhfap)，其包含seqidno:42的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含seqidno:43的氨基酸序列。在进一步的方面，能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhfap)，其包含seqidno:50的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含seqidno:51的氨基酸序列。[0212]此外，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中能够与icos特异性结合的抗原结合结构域包含[0213](a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0214](b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0215](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0216](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0217]因此，在一个方面，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自小鼠免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自小鼠免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:10的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:11的氨基酸序列。[0218]在一个特定方面，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自小鼠免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:296的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:297的氨基酸序列。在另一个方面，提供其人源化变体，即能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，其包含重链no:26的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:27的氨基酸序列。在进一步的方面，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:298的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:299的氨基酸序列。在另一方面，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:300的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:301的氨基酸序列。在一个方面，提供其人源化变体，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含选自由seqidno:144、seqidno:145、seqidno:146、seqidno:147、seqidno:148、seqidno:149、seqidno:150和seqidno:151组成的组的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含选自由seqidno:152和seqidno:153组成的组的氨基酸序列。[0223]在一个方面，本发明提供一种如前所定义的激动性icos抗原结合分子，其包含[0224](a)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，[0225](b)一个能够与icos特异性结合的fab片段，以及[0226](c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低所述抗原结合分子与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，激动性icos抗原结合分子包含人igg1亚类的fc结构域，其包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。[0227]在另一方面，本发明提供一种如前所定义的激动性icos抗原结合分子，其包含[0228](a)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，[0229](b)两个能够与icos特异性结合的fab片段，以及[0230](c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低所述抗原结合分子与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，人igg1亚类的fc结构域包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。[0231]在特定方面，能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是crossfab片段。[0232]本发明的示例性激动性icos抗体[0233]在进一步的方面，提供一种激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，其包含：(a)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列，或者[0234](b)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或者[0235](c)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:24的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:25的氨基酸序列；或者[0236](d)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:28的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:29的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:30的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:31的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:32的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:33的氨基酸序列。[0237]在一个方面，激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，源自小鼠免疫并包含：重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列。在另一方面，激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，源自兔免疫，并包含:重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列,(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:24的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:25的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:28的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:29的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:30的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:31的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:32的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:33的氨基酸序列。[0238]在一个方面，提供一种激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，其包含[0239](a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0240](b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0241](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0242](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0243]因此，在一个方面，提供源自小鼠免疫的激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，其包含重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自小鼠免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:10的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:11的氨基酸序列。[0244]在一个特定方面，提供源自小鼠免疫的激动性icos抗原结合分子，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:296的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:297的氨基酸序列。在另一个方面，提供其人源化变体，即能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，其包含重链可变区(vhicos)，其包含选自由seqidno:124、seqidno:125、seqidno:126、seqidno:127、seqidno:128、seqidno:129、seqidno:130和seqidno:131组成的组的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含选自由seqidno:132、seqidno:133、seqidno:134和seqidno:135组成的组的氨基酸序列。[0245]在另一方面，本发明提供源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0246]在一个方面，本发明提供源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子，其包含重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:18的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:19的氨基酸序列。[0247]在进一步的方面，源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子包含重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:34的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:35的氨基酸序列。在一个方面，提供其人源化变体，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含选自由seqidno:136、seqidno:137、seqidno:138、seqidno:139和seqidno:140组成的组的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含选自由seqidno:141、seqidno:142和seqidno:143组成的组的氨基酸序列。[0248]在进一步的方面，激动性icos抗原结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个特定方面，源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:26的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:27的氨基酸序列。在进一步的方面，源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:298的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:299的氨基酸序列。在另一方面，源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:300的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:301的氨基酸序列。在一个方面，提供其人源化变体，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含选自由seqidno:144、seqidno:145、seqidno:146、seqidno:147、seqidno:148、seqidno:149、seqidno:150和seqidno:151组成的组的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含选自由seqidno:152和seqidno:153组成的组的氨基酸序列。[0249]在一个方面，激动性icos抗原结合分子是全长抗体。在另一方面，激动性icos抗原结合分子是fab或crossfab片段。在特定方面，激动性icos抗原结合分子是人源化抗体。[0250]本发明的示例性双特异性激动性icos抗原结合分子[0251]在一个方面，本发明提供双特异性激动性icos结合分子，其包含(a)一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，和(b)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，和(c)fc结构域。因此，在这种情况下，激动性icos结合分子对于与icos的结合是单价的，并且对于与肿瘤相关抗原的结合是单价的(1 1形式)。[0252]在一个特定方面，提供激动性icos结合分子，其中所述分子包含：(a)能够与icos特异性结合的第一fab片段，(b)能够与肿瘤相关抗原特异性结合的第二fab片段，和(c)包含能够彼此稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域。[0253]在一个方面，提供激动性icos结合分子，其中所述分子包含：(a)能够与icos特异性结合的第一fab片段；(b)能够与肿瘤相关抗原特异性结合的第二抗原结合结构域，包括vh和vl结构域；和(c)包含能够彼此稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，并且其中能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的vh和vl结构域之一与fc结构域的第一亚基的c末端融合，并且vh和vl中的另一个与fc结构域的第二亚基的c末端融合。这种分子被称为1 1头至尾。[0254]在另一方面，本发明提供双特异性激动性icos结合分子，其包含(a)两个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，和(b)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，和(c)fc结构域。因此，在这种情况下，激动性icos结合分子对于与icos的结合是二价的，并且对于与肿瘤相关抗原的结合是单价的(2 1形式)。[0255]在一个方面，提供激动性icos结合分子，其中所述分子包含：(a)两个能够与icos特异性结合的fab片段；(b)能够与肿瘤相关抗原特异性结合的第二抗原结合结构域，包括vh和vl结构域；和(c)包含能够彼此稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，并且其中能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的vh和vl结构域之一与fc结构域的第一亚基的c末端融合，并且vh和vl中的另一个与fc结构域的第二亚基的c末端融合。这种分子被称为2 1。[0256]在另一方面，本发明提供激动性icos结合分子，其包含(a)能够与icos特异性结合的第一fab片段，(b)能够与肿瘤相关抗原特异性结合的第二fab片段，(c)能够与icos特异性结合的第三fab片段，和(d)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中第二fab片段(b)在fab重链的c末端与第一fab片段(a)的fab重链的n末端融合，所述第一fab片段(a)又在其c末端与第一fc结构域亚基的n末端融合，并且第三fab片段(c)在fab重链的c末端与第二fc结构域亚基的n末端融合，并且其中在能够与靶细胞抗原(i)特异性结合的第二fab片段中，fab轻链和fab重链的可变区vl和vh被彼此替换。[0257]在再一方面，本发明提供激动性icos结合分子，其包含(a)能够与icos特异性结合的第一fab片段，(b)能够与肿瘤相关抗原特异性结合的第二fab片段，(c)能够与icos特异性结合的第三fab片段，和(d)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中第一fab片段(a)在fab重链的c末端与第二fab片段(b)的fab重链的n末端融合，所述第二fab片段(b)又在其c末端与第一fc结构域亚基的n末端融合，并且第三fab片段(c)在fab重链的c末端与第二fc结构域亚基的n末端融合，并且其中在能够与靶细胞抗原(i)特异性结合的第二fab片段中，fab轻链和fab重链的可变区vl和vh被彼此替换。[0258]减少fc受体结合和/或效应子功能的fc结构域修饰[0259]本发明的激动性icos结合分子的fc结构域由一对包含免疫球蛋白分子重链结构域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白g(igg)分子的fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含ch2和ch3igg重链恒定结构域。fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。[0260]因此，包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子包含iggfc结构域，特别是igg1fc结构域或igg4fc结构域。更具体地，包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子包含igg1fc结构域。[0261]fc结构域为本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定方面，与天然igg1fc结构域相比，本发明的激动性icos结合分子的fc结构域表现出降低的与fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个方面，fc结构域基本上不结合fc受体和/或不诱导效应子功能。在一个特定方面，fc受体是fcγ受体。在一个方面，fc受体是人fc受体。在一个具体方面，fc受体是活化人fcγ受体，更具体地是人fcγriiia、fcγri或fcγriia，最具体地是人fcγriiia。在一个方面，fc结构域不诱导效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(cdc)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(adcp)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与nk细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的t细胞引发。[0262]在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的fc结构域中，从而生成fc区变体。fc区变体可包含人fc区序列(例如人igg1、igg2、igg3或igg4fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。[0263]在一个特定方面，本发明提供一种抗体，其中fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与fc受体的结合，特别是与fcγ受体的结合。[0264]在一个方面，本发明抗体的fc结构域包含降低fc结构域与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于fc结构域的两个亚基中的每一个中。特别地，fc结构域在e233、l234、l235、n297、p331和p329位(eu编号)处包含氨基酸取代。特别地，fc结构域包含igg重链234和235位(eu编号)和/或329位(eu编号)的氨基酸取代。更具体地，提供根据本发明的抗体，其包含在igg重链中具有氨基酸取代l234a、l235a和p329g(“p329glala”，kabateu编号)的fc结构域。氨基酸取代l234a和l235a是指所谓的lala突变。氨基酸取代的“p329glala”组合几乎完全消除人igg1fc结构域的fcγ受体结合，如国际专利申请公开号wo2012/130831a1所述，所述专利申请公开还描述制备这种突变fc结构域的方法和用于确定其特性(诸如fc受体结合或效应子功能)的方法。[0265]具有降低的fc受体结合和/或效应子功能的fc结构域还包括具有fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的fc突变体，包括所谓的“dana”fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。[0266]在另一方面，fc结构域为igg4fc结构域。与igg1抗体相比，igg4抗体表现出降低的与fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。在一个更具体的方面，fc结构域是在s228位处(kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代s228p的igg4fc结构域。在一个更具体的方面，fc结构域是包含氨基酸取代l235e和s228p以及p329g(eu编号)的igg4fc结构域。wo2012/130831中也描述了此类igg4fc结构域突变体及其fcγ受体结合特性。[0267]具有延长的半衰期和改善的新生儿fc受体(fcrn)结合、负责将母体igg转移至胎儿(guyer,r.l.等人，j.immunol.117(1976)587-593，以及kim,j.k.等人，j.immunol.24(1994)2429-2434)的抗体描述于us2005/0014934中。那些抗体包含这样的fc区，所述fc区中具有改善fc区与fcrn的结合的一个或多个取代。此类fc变体包括在以下fc区残基中的一处或多处具有取代的fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。关于fc区变体的其他示例，还参见duncan,a.r.和winter,g.,nature322(1988)738-740；us5,648,260；us5,624,821；以及wo94/29351。[0268]与fc受体的结合可以例如通过elisa或通过表面等离子体共振(spr)使用标准仪器(诸如biacore仪器(gehealthcare))容易地确定，并且fc受体诸如可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。另选地，可以使用已知表达特定fc受体的细胞系(诸如表达fcγiiia受体的人nk细胞)来评估fc结构域或包含fc结构域的细胞活化双特异性抗原结合分子对fc受体的结合亲和力。fc结构域的效应子功能，或本发明的包含fc结构域的双特异性抗原结合分子，可以通过本领域已知的方法来测量。本文描述了用于测量adcc的合适的测定法。用于评定感兴趣的分子的adcc活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；hellstrom等人，procnatlacadsciusa83,7059-7063(1986)和hellstrom等人，procnatlacadsciusa82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；bruggemann等人，jexpmed166,1351-1361(1987)。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的actitm非放射性细胞毒性测定(celltechnology,inc.mountainview,ca)；以及cytotox非放射性细胞毒性测定(promega,madison,wi))。用于此类测定的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。另选地或另外地，可例如在诸如在clynes等人，procnatlacadsciusa95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的adcc活性。[0269]以下部分描述了包含降低fc受体结合和/或效应子功能的fc结构域修饰的本发明激动性icos结合分子的优选方面。在一个方面，本发明涉及双特异性抗原结合分子，(a)至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，以及(c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该氨基酸取代降低抗体与fc受体的结合亲和力，特别是与fcγ受体的结合亲和力。在另一方面，本发明涉及激动性icos结合分子，其包含：(a)至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域，以及(c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该氨基酸取代降低效应子功能。在特定方面，fc结构域属于人igg1亚类，其具有氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。[0270]在本发明的一个方面，fc区在d265和p329位处包含氨基酸取代。在一些方面，fc区包含ch2结构域中的氨基酸取代d265a和p329g(“dapg”)。在一个此类实施例中，fc区是igg1fc区，特别是小鼠igg1fc区。dapg突变在例如wo2016/030350a1中有描述，并且可以被引入重链的ch2区以消除抗原结合分子与鼠fcγ受体的结合。[0271]促进异源二聚化的fc结构域修饰[0272]本发明的激动性icos结合分子包含与fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合位点，因此所述fc结构域的所述两个亚基可包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的激动性icos结合分子的产率和纯度，因此在本发明的双特异性抗原结合分子的fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。[0273]因此，在特定方面，本发明涉及激动性icos结合分子，其包含：(a)至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，以及(c)包含能够彼此稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中fc结构域包含促进fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人iggfc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在fc结构域的ch3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在fc结构域的ch3结构域中。[0274]在一个具体方面，所述修饰是所谓的“杵进入臼”修饰，所述修饰包括fc结构域的两个亚基中的一个中的“杵”修饰和fc结构域的两个亚基中的另一个中的“臼”修饰。因此，本发明涉及激动性icos结合分子，其包含：(a)至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，以及(c)包含能够彼此稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中根据杵臼结构方法，fc结构域的第一亚基包含杵并且fc结构域的第二亚基包含臼。在一个特定方面中，fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代s354c和t366w(eu编号)而fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代y349c、t366s和y407v(根据kabateu索引编号)。[0275]杵臼结构技术描述于例如us5,731,168；us7,695,936；ridgway等人，proteng9，617-621(1996)和carter，jimmunolmeth248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述突起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。[0276]因此，在一个方面，在本发明的激动性icos结合分子的fc结构域的第一亚基的ch3结构域中，某一氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的ch3结构域内产生突起，所述突起可定位于第二亚基的ch3结构域内的空腔中；而在fc结构域的第二亚基的ch3结构域中，某一氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的ch3结构域内产生空腔，该第一亚基的ch3结构域内的所述突起可定位在该空腔内。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在一个具体方面，在fc结构域的第一亚基的ch3结构域中，366位处的苏氨酸残基被色氨酸残基(t366w)替换，而在fc结构域的第二亚基的ch3结构域中，407位处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(y407v)替换。在一个方面中，另外在fc结构域的第二亚基中，366位处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(t366s)替换，并且368位处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(l368a)替换。[0277]在另一个方面，另外在fc结构域的第一亚基中，354位处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(s354c)替换，并且另外在fc结构域的第二亚基中，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(y349c)替换。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc结构域的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定该二聚体(carter(2001),jimmunolmethods248,7-15)。在一个特定方面中，fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代s354c和t366w(eu编号)而fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代y349c、t366s和y407v(根据kabateu索引编号)。[0278]在一个方面，fc区的第一亚基在392和409位包含天冬氨酸残基(d)，并且fc区的第二亚基在356和399位包含赖氨酸残基(k)。在一些实施例中，在fc区的第一亚基中，392和409位的赖氨酸残基被天冬氨酸残基(k392d,k409d)替换，并且在fc区的第二亚基中，356位的谷氨酸残基和399位的天冬氨酸残基被赖氨酸残基(e356k,d399k)替换。例如，在wo2014/131694a1中描述“ddkk”杵臼结构技术，并且该技术有利于带有提供互补氨基酸残基的亚基的重链的组装。[0279]在另一个方面中，促进fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在pct公开wo2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。idno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0303](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0304](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0305]在一个特定方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:97的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:96的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:94的氨基酸序列。[0306]在另一特定方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:98的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:99的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:100的氨基酸序列。[0307]在另一特定方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:98的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:101的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:100的氨基酸序列。[0308]在另一特定方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:102的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:103的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:104的氨基酸序列。[0309]在再一方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:105的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:106的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:107的氨基酸序列。[0310]在另一方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:108的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:109的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:107的氨基酸序列。[0311]在另一方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:110的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:111的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:107的氨基酸序列。[0312]在进一步的方面，提供包含两个能够与icos特异性结合的fab片段和一个能够与fap特异性结合的fab片段的分子。[0313]在进一步的方面，所述分子包含两个能够与icos特异性结合的fab片段。[0314]在一个特定方面，提供一种分子，其包含[0315](i)能够与fap特异性结合的第一fab片段，其包含：重链可变区(vhfap)，其包含seqidno:42的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlfap)，其包含seqidno:43的氨基酸序列；或者包含重链可变区(vhfap)，其包含seqidno:50的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlfap)，其包含seqidno:51的氨基酸序列，以及[0316](ii)能够与icos特异性结合的两个fab片段，其各自包含[0317](a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0318](b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0319](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0320](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0321]在一个方面，提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:112的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:114的氨基酸序列；两个第一轻链，其包含seqidno:113的氨基酸序列；以及第二轻链，其包含seqidno:115的氨基酸序列。[0322]在另一方面，提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:116的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:118的氨基酸序列；两个第一轻链，其包含seqidno:117的氨基酸序列；以及第二轻链，其包含seqidno:119的氨基酸序列。[0323]在一个方面，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与cea特异性结合的抗原结合结构域，其包含重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列；以及至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，其包含[0324](a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0325](b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0326](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0327](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0328]更具体地，提供一种双特异性抗原结合分子，其中所述分子包含[0329](i)能够与cea特异性结合的第一fab片段，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列，以及[0330](ii)能够与icos特异性结合的第二fab片段，其包含[0331](a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0332](b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0333](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0334](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0335]在一个方面，提供激动性icos结合分子，其包含：一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列；以及至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:18的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:19的氨基酸序列。[0336]更具体地，提供一种双特异性抗原结合分子，其中所述分子包含(i)能够与fap特异性结合的第一fab片段，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列；以及(ii)能够与icos特异性结合的第二fab片段，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:18的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:19的氨基酸序列。[0337]在一个方面，提供一种双特异性抗原结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:202的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:204的氨基酸序列；第一轻链，其包含seqidno:203的氨基酸序列；以及第二轻链，其包含seqidno:205的氨基酸序列。[0338]在一个方面，提供一种双特异性抗原结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:206的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:208的氨基酸序列；第一轻链，其包含seqidno:207的氨基酸序列；以及第二轻链，其包含seqidno:209的氨基酸序列。[0339]在另一方面，提供一种双特异性抗原结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:206的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:210的氨基酸序列；第一轻链，其包含seqidno:207的氨基酸序列；以及第二轻链，其包含seqidno:211的氨基酸序列。[0340]用于本发明的示例性抗cea/抗cd3双特异性抗体[0341]本发明涉及抗cea/抗cd3双特异性抗体及其与激动性icos抗原结合分子联合的用途，特别是其在治疗或延缓癌症进展的方法中的用途，更特别是治疗或延缓实体瘤进展的用途。本文所用的抗cea/抗cd3双特异性抗体是包含结合cd3的第一抗原结合结构域和结合cea的第二抗原结合结构域的双特异性抗体。[0342]因此，本文所用的抗cea/抗cd3双特异性抗体包含含有重链可变区(vhcd3)和轻链可变区(vlcd3)的第一抗原结合结构域，以及含有重链可变区(vhcea)和轻链可变区(vlcea)的第二抗原结合结构域。[0343]在一个特定方面，联合使用的抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(vhcd3)，其包含seqidno:218的cdr-h1序列、seqidno:219的cdr-h2序列和seqidno:220的cdr-h3序列；和/或轻链可变区(vlcd3)，其包含seqidno:221的cdr-l1序列、seqidno:222的cdr-l2序列和seqidno:223的cdr-l3序列。更具体地，所述抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，其包含与seqidno:224的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(vhcd3)和/或与seqidno:225的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(vlcd3)。在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含：重链可变区(vhcd3)，其包含seqidno:224的氨基酸序列；及/或轻链可变区(vlcd3)，其包含seqidno:225的氨基酸序列。[0344]在一个方面，特异性结合cd3的抗体是全长抗体。在一个方面，特异性结合cd3的抗体是人igg类抗体，特别是人igg1类抗体。在一个方面，特异性结合cd3的抗体是抗体片段，特别是fab分子或scfv分子，更特别是fab分子。在一个特定方面，特异性结合cd3的抗体是交叉fab分子，其中fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域被交换(即，被彼此替换)。在一个方面，特异性结合cd3的抗体是人源化抗体。[0345]在另一方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，其包含[0346](a)重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:226的cdr-h1序列、seqidno:227的cdr-h2序列和seqidno:228的cdr-h3序列；和/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:229的cdr-l1序列、seqidno:230的cdr-l2序列和seqidno:231的cdr-l3序列；或者[0347](b)重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:234的cdr-h1序列、seqidno:235的cdr-h2序列和seqidno:236的cdr-h3序列；和/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:237的cdr-l1序列、seqidno:238的cdr-l2序列和seqidno:239的cdr-l3序列。[0348]更具体地，所述抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包含与seqidno:232的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:233的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(vlcea)。在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:232的氨基酸序列；及/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:233的氨基酸序列。在另一方面，所述抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包含与seqidno:240的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:241的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(vlcea)。在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:240的氨基酸序列；及/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:241的氨基酸序列。[0349]在另一特定方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含结合cea的第三抗原结合结构域。特别地，所述抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第三抗原结合结构域，其包含[0350](a)重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:226的cdr-h1序列、seqidno:227的cdr-h2序列和seqidno:228的cdr-h3序列；和/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:229的cdr-l1序列、seqidno:230的cdr-l2序列和seqidno:231的cdr-l3序列；或者[0351](b)重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:234的cdr-h1序列、seqidno:235的cdr-h2序列和seqidno:236的cdr-h3序列；和/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:237的cdr-l1序列、seqidno:238的cdr-l2序列和seqidno:239的cdr-l3序列。[0352]更具体地，所述抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合结构域，其包含与seqidno:232的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:233的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(vlcea)。在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:232的氨基酸序列；及/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:233的氨基酸序列。在另一特定方面，所述抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合结构域，其包含与seqidno:240的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:241的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(vlcea)。在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:240的氨基酸序列；及/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:241的氨基酸序列。[0353]在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体是双特异性抗体，其中第一抗原结合结构域是其中fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域被交换的交叉fab分子，并且第二和第三(如果存在的话)抗原结合结构域是常规fab分子。[0354]在另一方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体是双特异性抗体，其中(i)第二抗原结合结构域在fab重链的c末端与第一抗原结合结构域的fab重链的n末端融合，第一抗原结合结构域在fab重链的c末端与fc结构域的第一亚基的n末端融合，并且第三抗原结合结构域在fab重链的c末端与fc结构域的第二亚基的n末端融合，或(ii)第一抗原结合结构域在fab重链的c末端与第二抗原结合结构域的fab重链的n末端融合，第二抗原结合结构域在fab重链的c末端与fc结构域的第一亚基的n末端融合，并且第三抗原结合结构域在fab重链的c末端与fc结构域的第二亚基的n末端融合。[0355]fab分子可以直接或通过肽接连接基与fc结构域融合，该肽连接基包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽连接基是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽连接基包括例如(g4s)n、(sg4)n、(g4s)n或g4(sg4)n肽连接基。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一个实施例中，所述肽连接基的长度为至少5个氨基酸，在一个实施例中长度为5至100个氨基酸，在另一实施例中为10至50个氨基酸。在一个实施例中，所述肽连接基是(gxs)n或(gxs)ngm，其中g＝甘氨酸，s＝丝氨酸，并且(x＝3、n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4、n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3)，在一个实施例中，x＝4并且n＝2或3，在另一实施例中，x＝4并且n＝2。在一个实施例中，所述肽连接基是(g4s)2。用于使第一fab分子和第二fab分子的fab轻链彼此融合的特别合适的肽连接基是(g4s)2。适于连接第一fab片段和第二fab片段的fab重链的一种示例性肽连接基包含序列(d)-(g4s)2。另一种合适的此类连接基包含序列(g4s)4。另外，连接基可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在fab分子与fc结构域亚基的n末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽连接基的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。[0356]在另一方面中，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含fc结构域，所述fc结构域包含减少与fc受体的结合和/或降低效应子功能的一个或多个氨基酸取代。具体地，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含igg1fc结构域，所述igg1fc结构域包含氨基酸取代l234a、l235a和p329g。[0357]在一个特定方面中，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含与seqidno：242所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与seqidno:243所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与seqidno:244所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，以及与seqidno:245所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗体包含seqidno:242所示的多肽序列、seqidno:243所示的多肽序列、seqidno:244所示的多肽序列和seqidno:245所示的多肽序列(ceacd3tcb)。[0358]在另一个特定方面中，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含与seqidno：246所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与seqidno:247所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与seqidno:248所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，以及与seqidno:249所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗体包含seqidno:246所示的多肽序列、seqidno:247所示的多肽序列、seqidno:248所示的多肽序列和seqidno:249所示的多肽序列(ceacam5cd3tcb)。[0359]具体的双特异性抗体描述于pct公开号wo2014/131712a1中。[0360]在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体还可以包含双特异性t细胞接合物在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体是如wo2007/071426或wo2014/131712中所述的双特异性抗体。在另一方面，双特异性抗体是medi565。[0361]在另一方面，本发明涉及鼠抗cea/抗cd3双特异性抗体，其包含含有重链可变区(vhmucd3)和轻链可变区(vlmucd3)的第一抗原结合结构域，含有重链可变区(vhmucea)和轻链可变区(vlmucea)的第二抗原结合结构域，以及含有重链可变区(vhmucea)和轻链可变区(vlmucea)的第三抗原结合结构域。[0362]在一个特定方面，鼠抗cea/抗cd3双特异性抗体包含与seqidno：250所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，与seqidno:251所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，与seqidno:252所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，与seqidno:253所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在进一步的特定方面，鼠抗cea/抗cd3双特异性抗体包含seqidno:250所示的多肽序列、seqidno:251所示的多肽序列、seqidno:252所示的多肽序列和seqidno:253所示的多肽序列(muceacd3tcb)。[0363]用于本发明的阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂[0364]在本发明的一个方面，激动性icos抗原结合分子与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂联合使用。在另一方面，激动性icos抗原结合分子与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂和cd3双特异性抗体联合使用。在所有这些方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是pd-l1结合拮抗剂或pd-1结合拮抗剂。特别地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为抗pd-l1抗体或抗pd-1抗体。[0365]术语“pd-l1”也称为cd274或b7-h1，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然pd-l1，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，特别是指“人pd-l1”。完整人pd-l1的氨基酸序列示出于uniprot(www.uniprot.org)登录号q9nzq7(seqidno:286)中。术语“pd-l1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l1与其一种或多种结合配偶体(诸如pd-1、b7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一些实施例中，pd-l1结合拮抗剂是抑制pd-l1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，pd-l1结合拮抗剂抑制pd-l1至pd-1和/或b7-1的结合。在一些实施例中，pd-l1结合拮抗剂包括抗pd-l1抗体，其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l1与其一个或多个结合配偶体(诸如pd-1、b7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一个实施例中，pd-l1结合拮抗剂可减少由t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过pd-l1的信号传导所介导的或通过其的负共刺激信号，从而使功能障碍的t细胞功能障碍更少(例如，提高效应子对抗原识别的应答)。特别地，pd-l1结合拮抗剂是抗pd-l1抗体。术语“抗pd-l1抗体”或“与人pd-l1结合的抗体”或“与人pd-l1特异性结合的抗体”或“拮抗性抗pd-l1”是指与人pd-l1抗原特异性结合的抗体，其结合亲和力kd值为1.0×10-8mol/l或更低，并且在一个方面，kd值为1.0×10-9mol/l或更低。使用标准结合测定(诸如表面等离子体共振技术(ge-healthcareuppsala，瑞典))来确定结合亲和力。[0366]在一个特定方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体。在一个特定方面，抗pd-l1抗体选自由阿特珠单抗(mpdl3280a、rg7446)、德瓦鲁单抗(medi4736)、阿维单抗(msb0010718c)和mdx-1105组成的组。在具体方面，抗pd-l1抗体为本文所述的yw243.55.s70。在另一具体方面，抗pd-l1抗体为本文所述的mdx-1105。在仍另一具体方面，抗pd-l1抗体为medi4736(德瓦鲁单抗)。在再进一步的方面，抗pd-l1抗体为msb0010718c(阿维单抗)。更具体地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是阿特珠单抗(mpdl3280a)。在另一方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体，其包含seqidno:288的重链可变结构域vh(pdl-1)和seqidno:289的轻链可变结构域vl(pdl-1)。在另一方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体，其包含seqidno:290的重链可变结构域vh(pdl-1)和seqidno:291的轻链可变结构域vl(pdl-1)。[0367]术语“pd-1”，也称为cd279、pd1或程序性细胞死亡蛋白1，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然pd-l1，该脊椎动物来源包括哺乳动物例如灵长类(如人)、非人灵长类(如biology，greenepublishingassociatesandwileyinterscience，n.y.(1989).表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码抗体或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(tag、tga或taa)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明的抗体或其多肽片段的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mrna的转录，并且如果两个dna片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个dna片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导dna的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。[0376]本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-a)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或ires，也称为cite序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(ltr)，或腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)。[0377]本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗体或其多肽片段，可以将编码信号序列的dna置于本发明的抗体或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的n末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。另选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(tpa)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。[0378]dna编码可用于促进后续纯化的短蛋白序列(例如组氨酸标签)或帮助标记融合蛋白可包含在编码本发明的双特异性抗体或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。[0379]在本发明的另一方面，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如，已转化或转染)载体，该载体包含编码本发明的抗体(的一部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化改造以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(cho)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见gerngross,natbiotech22,1409-1414(2004)和li等人，natbiotech24,210-215(2006)。[0380]用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的plantibodiestm技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚肾系(293或293t细胞，如例如在graham等人，jgenvirol36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(bhk)、小鼠塞尔托利氏细胞(tm4细胞，如例如在mather,biolreprod23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(cv1)、非洲绿猴肾细胞(vero-76)、人宫颈癌细胞(hela)、犬肾细胞(mdck)、布法罗大鼠肝细胞(brl3a)、人肺细胞(w138)、人肝细胞(hepg2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(mmt060562)、tri细胞(如例如在mather等人，annalsn.y.acadsci383,44-68(1982)中所述)、mrc5细胞，以及fs4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub等人，procnatlacadsciusa77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如yo、ns0、p3x63和sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如yazaki和wu，methodsinmolecularbiology，第248卷(b.k.c.lo编辑，humanapress,totowa,nj)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾(hek)细胞或淋巴细胞(例如，y0、ns0、sp20细胞)。用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含免疫球蛋白的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化改造，以便也表达另一条免疫球蛋白链，使得表达的产物为具有重链和轻链的免疫球蛋白。[0381]在一个方面，提供了一种产生本发明的激动性icos结合分子或其多肽片段的方法，其中所述方法包括在适于表达本发明的抗体或其多肽片段的条件下培养包含编码如本文提供的本发明的激动性icos结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收本发明的抗体或其多肽片段。[0382]在某些实施例中，能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域或能够与形成抗原结合分子一部分的icos(例如fab片段或vh和vl)特异性结合的抗原结合结构域包含至少一个能够与抗原结合的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并由其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如harlow和lane，"antibodies,alaboratorymanual",coldspringharborlaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中所述)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如mccafferty的美国专利号5,969,108)。[0383]免疫球蛋白的任何动物物种都可用于本发明。用于本发明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠、灵长类或人来源的免疫球蛋白。如果融合蛋白旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(参见例如winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，所述各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)cdr移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，所述架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(sdr或a-cdr；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如almagroandfransson,frontbiosci13,1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如riechmann等人,nature332,323-329(1988)；queen等人,procnatlacadsciusa86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；jones等人,nature321,522-525(1986)；morrison等人,procnatlacadsci81,6851-6855(1984)；morrisonandoi,advimmunol44,65-92(1988)；verhoeyen等人,science239,1534-1536(1988)；padlan,molecimmun31(3),169-217(1994)；kashmiri等人,methods36,25-34(2005)(描述了sdr(a-cdr)移植)；padlan,molimmunol28,489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；dall’acqua等人,methods36,43-60(2005)(描述了“fr改组”)；以及osbourn等人,methods36,61-68(2005)和klimka等人,brjcancer83,252-260(2000)(描述了用于fr改组的“指导选择”方法)中。根据本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体一般描述于vandijk和vandewinkel,curropinpharmacol5,368-74(2001)和lonberg,curropinimmunol20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并衍生自该抗体(参见，例如monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987))。也可以通过以下方式来制备人抗体和人可变区：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以产生具有对抗原激发作出应答的人可变区的完整人抗体或完整抗体(参见例如lonberg,natbiotech23,1117-1125(2005))。也可通过以下方式来产生人抗体和人可变区：分离选自人来源的噬菌体展示文库的fv克隆可变区序列(参见，例如hoogenboom等人methodsinmolecularbiology178,1-37(o’brien等人,ed.,humanpress,totowa,nj,2001)；以及mccafferty等人,nature348,552-554；clackson等人,nature352,624-628(1991))。噬菌体通常将抗体片段展示为单链fv(scfv)片段或fab片段。[0384]在某些方面，根据例如在pct公开wo2012/020006(参见与亲和力成熟相关的实例)或美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法，抗kgne结合结构域被工程化以具有增强的结合亲和力。本发明的抗原结合分子与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振技术(liljeblad,等人,glycoj17,323-329(2000))以及传统的结合测定(heeley,endocrres28,217-229(2002))来测量。竞争测定可用于鉴定与参考抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施例中，此类竞争抗原结合分子与由参考抗原结合分子结合的同一表位(例如，线性或构象表位)结合。用于定位抗原结合分子结合与之结合的表位的详细示例性方法提供于：morris(1996)，“epitopemappingprotocols”，出自methodsinmolecularbiology第66卷(humanapress,totowa,nj)。在示例性竞争测定中，将固定化抗原在包含与所述抗原结合的第一标记抗原结合分子和正在测试其与第一抗原结合分子竞争结合所述抗原的能力的第二未标记抗原结合分子的溶液中孵育。第二抗原结合分子可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化抗原在包含第一标记抗原结合分子而非第二未标记抗原结合分子的溶液中孵育。在容许第一抗体与抗原结合的条件下孵育之后，去除过量未结合的抗体，并且测量与固定化抗原缔合的标记的量。若与固定化抗原缔合的标记的量相对于对照样品在测试样品中基本上减少，则表明第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合抗原。参见harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanual第14章(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny)。[0385]如本文所述制备的本发明的激动性icos结合分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用双特异性抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明融合蛋白的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白a或蛋白g的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白a或g亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗原结合分子。双特异性抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中任一者来确定，所述熟知的分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。例如，实例中所述的表达的双特异性抗原结合分子被显示为得到完整并且适当组装，如还原和非还原sds-page所示。[0386]测定[0387]本文所提供的抗原结合分子的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域中已知的各种测定法进行鉴定、筛选或表征。[0388]1.亲和力测定[0389]本文提供的抗体与icos或肿瘤相关抗原的亲和力可以使用标准仪器诸如biacore仪器(gehealthcare)以及可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，根据实例中阐述的方法通过表面等离子体共振(spr)来确定。双特异性抗原结合分子对靶细胞抗原的亲和力也可以使用标准仪器诸如biacore仪器(gehealthcare)以及可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，通过表面等离子体共振(spr)来确定。用于测量结合亲和力的特定说明性和示例性实施例描述于实例9中。根据一个方面，在25℃下使用t100仪器(gehealthcare)通过表面等离子体共振来测量kd。[0390]2.结合测定和其他测定[0391]在一个方面，本文所报道的抗体的抗原结合活性通过例如elisa、蛋白质印迹、流式细胞术等已知方法进行测试。[0392]3.活性测定[0393]进行了几项基于细胞的体外测定，以评价包含至少一个结合肿瘤相关抗原的抗原结合结构域的激动性icos结合分子的活性。测定旨在显示在t细胞双特异性(tcb)介导的t细胞活化存在的情况下，抗icos双特异性分子的额外激动性/共刺激活性。例如，在实例7.2中更详细地描述了用具有nfat调节的荧光素酶表达的报告细胞系进行的jurkat测定在cd3/tcr和icos结合时诱导)，其中测量了icosigg分子，板结合的与在溶液中的对比，以及不存在与存在包被的cd3igg刺激的对比。[0394]此外，在实例7.1中测试和描述了原代人pbmc共培养测定，其中在通过同时结合t细胞上的cd3和肿瘤细胞上的人cea而交联的tcb分子存在的情况下，通过同时结合t细胞上的人icos和人fap而交联的fap靶向icos分子在3t3-hfap细胞(亲代细胞系atcc#ccl-92，经修饰以稳定地过表达人fap)上表达。[0395]在某些方面中，测试本文所报道的抗体的此类生物活性。[0396]药物组合物、制剂和施用途径[0397]在进一步的方面，本发明提供了药物组合物，其包含激动性icos结合分子和对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体以及药用赋形剂，所述icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。在一个特定方面，提供一种药物组合物用于治疗癌症，更具体地用于治疗实体瘤，其包含激动性icos结合分子和对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体以及药用赋形剂，所述icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。在一个进一步的方面，提供了一种药物组合物，其包含激动性icos结合分子和对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子和对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体以单一组合物一起施用或以两种或更多种不同组合物分开施用。在另一方面，包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子与对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体同时、在其之前或在其之后施用。[0398]在另一方面，药物组合物包含本文提供的激动性icos结合分子和至少一种药用赋形剂。在另一方面，药物组合物包含本文所提供的激动性icos结合分子以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。[0399]在再一方面，本发明提供了一种药物组合物用于治疗或延缓癌症进展的方法，所述组合物包含激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的所述激动性icos结合分子用于与对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体联合使用，或用于与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂联合使用。在另一方面，包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子用于与对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体联合使用，以及与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂联合使用。特别地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为抗pd-l1抗体或抗pd1抗体。更特别地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂选自由阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗和纳武单抗组成的组。在一个具体方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为阿特珠单抗。在另一个具体方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为派姆单抗或纳武单抗。[0400]本发明的药物组合物包含溶解或分散在药用赋形剂中的治疗有效量的一种或多种抗体。术语“药用”(pharmaceuticalorpharmacologicallyacceptable)是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种抗体和任选的附加活性成分的药物组合物的制备将鉴于本公开而为本领域的技术人员已知，如由remington'spharmaceuticalsciences，第18版，mackprintingcompany,1990所示例的，该文献以引用方式并入本文。具体地，该组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药用赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂及它们的组合，如对本领域的普通技术人员所知。[0401]肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。为了注射，可在水溶液中配制本发明的含tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，优选在生理相容性缓冲剂诸如hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水中配制。溶液可含有配制剂(formulatoryagent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代性地，融合蛋白可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的融合蛋白以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药用赋形剂包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。[0402]活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在remington'spharmaceuticalsciences(第18版，mackprintingcompany,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。[0403]本文的示例性药用赋形剂还包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuph20(baxterinternational,inc.)。某些示例性shasegp和使用方法，包括rhuph20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。[0404]示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和wo2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。[0405]除了先前描述的组合物之外，本文描述的激动性icos结合分子也可以配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，激动性icos结合分子可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。[0406]包含本发明的激动性icos结合分子的药物组合物可通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的配方取决于所选择的施用途径。[0407]本发明的激动性icos结合分子可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药用盐包括酸加成盐，例如用蛋白质性质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。[0408]本文的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。[0409]治疗方法和组合物[0410]在一个方面，本发明提供了一种治疗或延缓受试者的癌症进展的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。[0411]在一个这样的方面，所述方法进一步包括向受试者施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在进一步的实施例中，本文提供了一种用于肿瘤缩小的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。根据上述方面中的任一者的“个体”或“受试者”优选地是人。[0412]在进一步的方面，提供了用于癌症免疫疗法的组合物，其包含激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。在某些实施例中，提供了用于癌症免疫疗法方法中的组合物，其包含激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。[0413]在进一步的方面，本文提供了包含激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体的组合物在制造或制备药物中的用途，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。在一个方面，药物用于治疗癌症。在进一步的方面，所述药物用于肿瘤缩小的方法中，所述方法包括对患有实体瘤的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的方面，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在进一步的实施例中，所述药物用于治疗实体瘤。在某些方面，个体患有cea阳性癌症。在一些方面，cea阳性癌症是结肠癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肾癌、食道癌或前列腺癌。在一些方面，乳腺癌是乳腺上皮癌或乳腺腺癌。在一些方面，乳腺上皮癌是浸润性导管癌。在一些方面，肺癌是肺腺癌。在一些实施例中，结肠癌是结直肠腺癌。根据以上实施例中的任一个的“受试者”或“个体”可以是人。[0414]在另一个方面，本发明提供了一种治疗或延缓受试者的癌症进展的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中所述受试者在用所述激动性icos结合分子治疗之前在t细胞上具有低的icos基线表达。[0415]上述组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，本文报道的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一个方面，施用t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，和施用激动性icos结合分子，以及任选地施用另外的治疗剂发生在彼此约一个月内，或约一周、两周或三周内，或约一天、两天、三天、四天、五天或六天内，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。[0416]本文所报道的t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，和包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子(和任何另外的治疗剂)都可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要进行局部治疗，可以进行病变内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。[0417]本文报道的t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，以及包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子都将以符合良好医学实践的方式进行配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。所述抗体不是必须的，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的制剂共同配制。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。[0418]在另一个方面，本发明提供了一种治疗或延缓受试者的癌症进展的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的激动性icos结合分子，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。[0419]其他药剂和治疗[0420]本发明的包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子可以在治疗中与一种或多种其它试剂联合施用。例如，本发明的激动性icos结合分子可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括可以施用用于治疗需要此类治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，附加治疗剂是另一种抗癌剂。在一个方面，所述另外的治疗剂选自由化疗剂、辐射和用于癌症免疫疗法的其他药剂组成的组。在进一步的方面，提供了如本文所述用于治疗癌症的如前所述的激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域的所述激动性icos结合分子与另一种免疫调节剂联合施用。[0421]术语“免疫调节剂”是指影响免疫系统的任何物质，包括单克隆抗体。本发明的分子可被认为是免疫调节剂。免疫调节剂可用作治疗癌症的抗肿瘤剂。在一个方面，免疫调节剂包括但不限于抗ctla4抗体(例如，伊匹单抗)、抗pd1抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)、pd-l1抗体(例如，阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗)、ox-40抗体、lag3抗体、tim-3抗体、4-1bb抗体和gitr抗体。[0422]在进一步的方面，提供如本文所述用于治疗癌症的如前所述的激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的所述激动性icos结合分子与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂联合施用。在一个方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体或抗pd1抗体。更特别地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂选自由阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗和纳武单抗组成的组。在一个具体方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为阿特珠单抗。在另一个方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为派姆单抗或纳武单抗。此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用激动性icos结合分子的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子通常以与本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。[0423]上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或单独的组合物中)，以及单独施用，在这种情况下，本发明的包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。[0424]制品[0425]在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(iv)溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。容器容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的组合物组合，并且容器可具有无菌入口(例如容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子。[0426]标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)第一容器，所述第一容器中含有组合物，其中所述组合物包含本发明的激动性icos结合分子，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域；以及(b)第二容器，所述第二容器中含有组合物，其中所述组合物包含进一步的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，所述包装插页指示所述组合物可用于治疗特定病症。[0427]可替代地或另外地，所述制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。[0428]表b(序列)：[0429][0430][0431][0432][0433][0434][0435][0436][0437][0438][0439][0440][0441][0442][0443][0444][0445][0446][0447][0448][0449][0450][0451][0452][0453][0454][0455][0456][0457][0458][0459][0460][0461]关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：kabat,e.a.等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中。根据如上所定义的根据kabat(kabat,e.a.等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))的编号系统来对抗体链的氨基酸进行编号和引用。[0462]***[0463]实例[0464]以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。[0465]重组dna技术[0466]使用标准方法来操纵dna，如在sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：kabat,e.a.等人，(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第五版，nihpublicationno91-3242。[0467]dna测序[0468]通过双链测序确定dna序列。[0469]基因合成[0470]通过使用适当模板进行pcr生成所需的基因区段，或由geneartag(regensburg,germany)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和pcr产物合成所需的基因区段。在确切的基因序列不可用的情况下，基于最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过rt-pcr从来源于合适的组织的rna中分离出基因。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒dna，并通过紫外光谱法确定浓度。通过dna测序来确认亚克隆基因片段的dna序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端dna序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。[0471]细胞培养技术[0472]使用如在currentprotocolsincellbiology(2000),bonifacino,j.s.,dasso,m.,harford,j.b.,lippincott-schwartz,j.和yamada,k.m.(编辑)，johnwiley&sons,inc中所述的标准细胞培养技术。[0473]蛋白纯化[0474]参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简而言之，将抗原结合分子应用于蛋白a亲和色谱法(平衡缓冲液:20mm柠檬酸钠，20mm磷酸钠，ph7.5；洗脱缓冲液：20mm柠檬酸钠，ph3.0)从细胞培养上清液中纯化含fc的蛋白质。在ph3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的ph。通过尺寸排阻色谱法(superdex200，gehealthcare)在pbs中或在20mm组氨酸、140mmnacl(ph6.0)中将聚集蛋白质与单体抗体分离。可将单体抗原结合分子级分合并，使用例如milliporeamiconultra(30mwco)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃。可以提供部分样品以例如通过sds-page、尺寸排阻色谱(sec)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。[0475]sds-page[0476]根据制造商的说明使用预制凝胶系统(invitrogen)。具体地，使用10％或4-12％bis-tris预制凝胶(ph6.4)和mes(还原凝胶，具有抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或mops(非还原凝胶)电泳缓冲液。[0477]分析尺寸排阻色谱法[0478]通过hplc色谱法执行用于测定抗体的聚集和寡聚状态的尺寸排阻色谱法(sec)。简而言之，将蛋白a纯化的抗体施加至agilenthplc1100系统上的300mmnacl、50mmkh2po4/k2hpo4，ph7.5中的tosohtskgelg3000sw柱，或施加至dionexhplc系统上的2×pbs中的superdex200柱(gehealthcare)。通过uv吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白。将biorad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。[0479]质谱[0480]本节描述了对具有vh/vl交换(vh/vlcrossmab)的多特异性抗体的表征，重点在于所述多特异性抗体的正确装配。通过对脱糖基化的完整crossmab和脱糖基化/纤溶酶消化或者脱糖基化/限制性lysc消化的crossmab进行电喷雾电离质谱(esi-ms)，来分析预期的一级结构。[0481]在37℃下以1mg/ml的蛋白质浓度将vh/vlcrossmab用磷酸盐或tris缓冲液中的n-糖苷酶f脱糖基化至多17h。纤溶酶消化或有限的lysc(罗氏)消化用ph8的tris缓冲液中的100μg去糖基化的vh/vlcrossmab分别在室温执行120小时和在37℃执行40min。在质谱分析之前，将样品经由hplc在sephadexg25柱(gehealthcare)上脱盐。在配备有triversananomate源(advion)的maxis4guhr-qtofms系统(brukerdaltonik)上经由esi-ms来测定总质量。[0482]使用表面等离子体共振(spr)测定多特异性抗体对相应抗原的结合亲和力(biacore)[0483]通过使用biacore仪器(gehealthcarebiosciencesab，uppsala,sweden)进行表面等离子体共振来研究产生的抗体与相应抗原的结合。简言之，对于亲和力测量，山羊抗人igg、jir109-005-098抗体通过胺偶联固定在cm5芯片上，用于针对相应抗原呈递抗体。在hbs缓冲液(hbs-p(10mmhepes，150mmnacl，0.005％tween20，ph7.4)中、在25℃(或替代性地在37℃)测量结合。在溶液中加入不同浓度的抗原(r&d系统或内部纯化)。通过注射抗原80秒至3分钟来测量关联性；通过用hbs缓冲液洗涤芯片表面3-10分钟来测量解离，并且使用1:1的朗缪尔结合模型来估计kd值。从样品曲线中减去负控制数据(如缓冲曲线)，用于校正系统固有基线漂移和降低噪声信号。使用相应的biacore评估软件来分析传感图和计算亲和力数据。[0484]实例1[0485]icos抗体的产生[0486]1.1用于通过免疫产生新颖icos结合物的抗原的制备、纯化和表征以及筛选工具[0487]1.1.1单体和二聚icos抗原fc(kih)融合分子的制备、纯化和表征[0488]编码人、食蟹猴或小鼠或4-1bb(表1)的胞外域的dna序列与人igg1重链ch2和ch3结构域一起在框架内亚克隆在单体的杵以及二聚icos抗原fc融合分子的臼和杵上(merchant等人,1998)。在抗原fc突起的c末端引入用于定向生物素化的avi标签。包含s354c/t366w突变的抗原fc杵链与包含y349c/t366s/l368a/y407v突变的fc臼链的组合允许产生包含单拷贝的icos异二聚体或包含两个拷贝的含胞外域链的同二聚体，从而产生fc连接抗原的单体或二聚体形式。表2示出抗原fc融合构建体的氨基酸序列。[0489]表1：抗原胞外域(ecd)的氨基酸编号及其来源[0490]seqidno:生物体来源ecd1人icos根据q9y6w8合成aa21-1402食蟹猴icos根据g7pl89合成aa21-1403鼠icos根据q9wvs0合成aa21-144[0491]表2：二聚抗原fc(kih)融合分子的cdna和氨基酸序列[0492][0493][0494][0495]将所有icos-fc融合编码序列克隆到驱动来自嵌合mpsv启动子且含有位于cds3’端的合成polya信号序列的插入物表达的质粒载体中。此外，载体含有ebvorip序列，用于质粒的游离体维持。[0496]为了制备生物素化的抗原/fc融合分子，将指数生长的悬浮hek293ebna细胞与三种编码融合蛋白两种组分(杵和臼链)的载体以及生物素化反应需要的酶bira共转染。相应载体以1:1:0.05的比率(“fc杵”:“fc臼”:“bira”)使用。[0497]为了在500ml摇瓶中产生蛋白质，在转染前24小时播种4亿hek293ebna细胞。对于转染，将细胞以210g离心分离5分钟，并且用预热的cdcho培养基替换上清液。将表达载体重新悬浮于20ml含200μg载体dna的cdcho培养基中。加入540μl聚乙烯亚胺(pei)后，将溶液涡流15秒，并在室温孵育10分钟。然后，将细胞与dna/pei溶液混合，将其转移至500ml摇瓶中，并且在培养箱中，在5％co2的气氛下在37℃孵育3小时。培养后，加入160mlf17培养基，并且将细胞培养24小时。转染后一天，向培养物中加入1mm丙戊酸和7％进料。培养7天后，通过在210g下旋转细胞15min收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至最终浓度0.01％(w/v)，并保持在4℃。[0498]通过亲和色谱法、使用蛋白质a，然后进行尺寸排阻色谱法，从细胞培养上清液中纯化分泌蛋白。对于亲和色谱法，将上清液加载到用40ml20mm磷酸钠、20mm柠檬酸钠ph7.5平衡的hitrapproteinahp柱(cv＝5ml，gehealthcare)上。用至少10个柱体积的含20mm磷酸钠、20mm柠檬酸钠和0.5m氯化钠(ph7.5)的缓冲液洗涤，除去未结合的蛋白质。使用20个柱体积的20mm柠檬酸钠、ph3.0的0.01％(v/v)tween-20产生的氯化钠线性ph梯度(0至500mm)洗脱结合蛋白。然后用10个柱体积的含20mm柠檬酸钠、500mm氯化钠和ph3.0的0.01％(v/v)tween-20的溶液洗涤柱。[0499]通过加入ph8.0的1/40(v/v)的2mtris，调节收集级分的ph。将蛋白浓缩并过滤，然后加载至用2mmmops、150mm氯化钠、ph7.4的0.02％(w/v)叠氮化钠溶液平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)。[0500]1.1.2表达重组icos的稳定细胞系的产生和表征[0501]将编码人或鼠icos的全长cdna亚克隆到哺乳动物表达载体中。使用lipofectamineltx试剂(invitrogen,#15338100)，按照生产商的方案，将质粒转染到cho-k1(atccccl-61)细胞中。将稳定转染的icos阳性cho-k1细胞保持在补充10％胎牛血清(gibco,#16140063)和1％glutamax补充剂(gibco；#31331-028)的dmem/f-12(gibco,#11320033)中。转染后两天，将嘌呤霉素(invivogen；#ant-pr-1)添加至6μg/ml。初始筛选后，使用bdfacsariaiii细胞分选仪(bdbiosciences)对icos细胞表面表达最高的细胞进行分选，并培养以建立稳定的细胞克隆。使用pe抗人/小鼠/大鼠cd278抗体(biolegend；#313508)，为期4周进行facs分析，确认了表达水平及稳定性。[0502]1.1.3用于dna免疫的icos表达载体的产生[0503]将编码人icos的全长cdna亚克隆到标准哺乳动物表达载体中。从转化的细菌中纯化出质粒dna，并通过紫外光谱法确定浓度。通过dna测序来确认亚克隆基因片段的dna序列。[0504]1.2通过兔和小鼠免疫产生icos特异性009、1167、1143和1138抗体[0505]1.2.1免疫接种运动[0506]为了进行免疫，使用从charlesriverlaboratoriesinternational公司获得的nmri小鼠和新西兰白兔(nzw)以及表达人源化抗体谱的罗氏专有转基因兔(使用icos衍生抗原免疫后)。在wo2000/46251、wo2002/12437、wo2005/007696、wo2006/047367、us2007/0033661和wo2008/027986中报道了包含人免疫球蛋白基因座的转基因兔。根据附录a“动物的住宿和照料指南”将动物圈养在aaalac认可的动物设施中。所有动物免疫接种方案和实验均已获得上巴伐利亚行政区政府批准(许可号55.2-1-54-2532-66-16和55.2-1-54-2532-90-14)，并根据德国动物福利法和欧洲议会和理事会指令2010/63进行。[0507]icos抗体009的产生[0508]6-8周龄的nmri小鼠(n＝5)用重组fc融合人icosecd分子(见实例1.1.1)进行了三次免疫，持续1.5个月。首次免疫时，将100μg溶于20mmhis/hiscl、140mmnacl(ph6.0)中的蛋白与等体积的完全freund佐剂(bddifco，#263810)混合，并进行腹膜内施用。除使用不完全freund佐剂(bddifco，#difc263910)外，在第21和42天以类似方式进行强化免疫。最终免疫后四至五周，使小鼠在无菌pbs中腹膜内接受约50μg免疫原，并且一天后在无菌pbs中静脉内接受25μg免疫原。48h后，无菌收获脾并且准备生成杂交瘤。第三次免疫后，通过elisa测试血清中的重组fc融合人icosecd(参见实例1.1.1)。[0509]icos抗体1183、1143(nzw兔)和1167(tg兔)的产生[0510]对12-16周龄的兔(nzw:n＝2，转基因兔:n＝2)以交替方案用编码全长人icos的质粒表达载体(参见实例1.1.3)和人icos表达细胞进行遗传免疫。[0511]所有动物在第0周、4周和12周通过皮内施用接受400μg载体dna，并伴有电穿孔(5个750v/cm的方形脉冲，持续10ms，间隔1s)。此外，在完全freund佐剂(cfa；bddifco，#263810)中乳化或与tlr激动剂的组合混合的3-5x107个人icos表达sr细胞(atcc；crl-2262)或活化人原代t细胞在第2周皮内注射，第8周肌内注射，并且第16周皮下注射。第28天(dna)、第42天(t细胞)、第56天(dna)和第70天(t细胞)以类似方式进行强化免疫，但将cfa用作细胞免疫的佐剂。[0512]从第3次免疫开始，在免疫后第6至8天取回血液(估计总血容量的10％)。制备用于通过elisa进行抗原特异性滴度确定的血清，并且分离外周血单核细胞，所述外周血单核细胞用作b细胞克隆过程中的抗原特异性b细胞的来源(参见实例1.2.2)。[0513]1.2.2兔b细胞克隆[0514]从免疫的野生型兔或人igg转基因兔中采集血液样品。将含有全血的edta用1×pbs稀释两倍，之后使用哺乳动物淋巴细胞(赛达兰实验室)根据制造商的说明书进行密度离心。用1×pbs洗涤pbmc两次。[0515]el-4b5培养基[0516]使用补充有10％fcs、2mm谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液、2mm丙酮酸钠、10mmhepes和0,05mmb-巯基乙醇的rpmi1640培养基。[0517]板的包被[0518]使用无菌6孔板(细胞培养级)以用抗原包被。[0519]包衣1，蛋白质：用碳酸盐包被缓冲液(0,1m碳酸氢钠，34mm碳酸氢二钠，ph9,55)将人icos蛋白抗原(id1486)稀释至最终浓度2μg/ml。将3ml该溶液加入到6孔板的每个孔中，并在室温孵育过夜。使用前，除去上清液，并用pbs洗涤孔3x。[0520]包衣2，细胞：将亲本cho-k1细胞系(包衣2a)或表达鼠icos的cho细胞(包衣2b)接种在6孔板中，并在培养箱中于37℃孵育，直至观察到汇合生长。[0521]从pbmc中去除巨噬细胞/单核细胞[0522]将pbmc接种在普通无菌6孔板(细胞培养级)上或已含有带cho细胞的细胞层的6孔板上，以通过非特异性粘附耗尽巨噬细胞和单核细胞。[0523]每个孔最多装有4ml培养基和至多6x10e6个来自经免疫兔的pbmc，并且使其在培养箱中在37℃结合1h。使用上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(pbl))进行抗原淘筛步骤，并且因此通过以800xg离心分离10min进行浓缩。将沉淀球粒重新悬浮在培养基中。[0524]抗原特异性b细胞的富集[0525]将血样的pbl调节至2x10e6个细胞/ml的细胞密度，并将3ml加入到用包衣1或2包被的6孔板的各孔(每3-4ml培养基中最多6x106个细胞)中。将板在培养箱中在37℃孵育60至90min。移除上清液并且通过用1xpbs小心地洗涤孔1-4次来移除非贴壁细胞。为了取回粘性抗原特异性b细胞，向6孔板的孔中加入1ml胰蛋白酶/edta溶液，并在37℃孵育5至10min。通过加入培养基停止孵育，并将上清液转移至离心瓶。用pbs洗涤孔两次，并将上清液与其他上清液合并。以800xg离心分离10min使细胞沉淀，并保存在冰上，直至免疫荧光染色。[0526]免疫荧光染色和流式细胞术[0527]利用抗iggfitc(abdserotec)和抗huckpe(dianova)抗体进行单细胞筛选。对于表面染色，在暗处在4℃，将来自耗尽和富集步骤的细胞与在pbs中的抗iggfitc和抗huckpe抗体一起孵育45min。在染色之后，将pbmc用冰冷的pbs洗涤两次。最后，将pbmc重悬于冰冷的pbs中并立即进行facs分析。在facs分析之前加入浓度为5μg/ml的碘化丙啶(bdpharmingen)以区分死细胞和活细胞。[0528]利用配备计算机和facsdiva软件的bectondickinsonfacsaria(bdbiosciences)进行单细胞分选。[0529]b细胞培养[0530]利用seeber等人,plosone2014,9(2),e86184所述的方法进行兔b细胞的培养。简言之，将单细胞分选的兔b细胞在96孔板中与200μl/孔的el-4b5培养基一起在培养箱中在37℃孵育7天，所述培养基含有pansorbin细胞(1:100000)(calbiochem)、5％兔胸腺细胞上清液(microcoat)和经γ辐照的鼠el-4b5胸腺瘤细胞(5×10e5个细胞/孔)。移除b细胞培养的上清液以用于筛选，并且立即收集剩余细胞并将其在-80℃冷冻于100μlrlt缓冲液(凯杰公司(qiagen))中。[0531]1.2.3v结构域的pcr扩增[0532]使用nucleospin8/96rna试剂盒(macherey&nagel；740709.4、740698)根据制造商的方案由b细胞裂解物(重悬于rlt缓冲液-qiagen-目录号79216)制备总rna。用60μl无rna酶水洗脱rna。6μl的rna用于使用superscriptiiifirst-strandsynthesissupermix(invitrogen18080-400)和oligodt引物根据制造商的说明通过逆转录酶反应生成cdna。所有步骤在hamiltonmlstarsystem上进行。以50μl的最终体积，利用accuprimesupermix(invitrogen12344-040)，使用4μl的cdna扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(vh和vl)，如wo2015/101588所述,对于野生型兔b细胞的重链使用引物rbhc.up和rbhc.do而对于野生型兔b细胞的轻链使用引物rblc.up和rblc.do,并且对于转基因兔b细胞的轻链使用引物bcpcr_fhlc_leader.fw和bcpcr_huckappa.rev(见表3)。所有正向引物(分别为vh和vl的)对信号肽具有特异性，而所有反向引物(分别为vh和vl的)对恒定区具有特异性。用于rbvh rbvl的pcr条件如下：热启动，94℃，5min；94℃20s、70℃20s、68℃45s的35个循环；以及在68℃最终延伸7min。用于huvl的pcr条件如下：热启动，94℃，5min；94℃20s、52℃20s、68℃45s的40个循环；以及在68℃最终延伸7min。将50μlpcr溶液中的8μl加载到48e-gel2(invitrogeng8008-02)上。阳性pcr反应液使用nucleospinextractii试剂盒(macherey&nagel；740609250)根据制造商的方案进行净化，并且在50μl洗脱缓冲液中洗脱。所有净化步骤在hamiltonmlstarletsystem上进行。[0533]表3：pcr引物的核苷酸序列[0534][0535]1.2.4杂交瘤的产生[0536]机械破坏制备的脾。洗涤细胞，通过离心分离收获细胞，并重新悬浮在10ml裂解缓冲液中。在4℃裂解5min后，加入40ml冷培养基(rpmi1640)，洗涤细胞并重新悬浮在50ml冷rpmi1640中。确定淋巴细胞数量后，加入p3x63-ag8.653细胞(在rpmi1640培养基中洗涤并重新悬浮)。将淋巴细胞与骨髓瘤细胞的比率选择为2:1。通过离心分离收集细胞，取出培养基，并通过加入peg1500(37℃；每108个淋巴细胞1.5mlpeg)开始两种细胞类型的融合。孵育1min后，分三个连续步骤(1ml、3ml、16ml)加入rpmi1640培养基。通过离心分离收集细胞，重新悬浮在1mlrpmi1640中，并置于6孔板的半固体培养基上。添加hat(次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷)用于选择融合的杂交瘤细胞。在37℃孵育9-13天后挑选克隆。[0537]将分离的克隆转移至96孔板并孵育72小时。上清液用于gitr特异性抗体的初步筛选和鉴定。为了进行二次筛选，将选定命中的细胞转移到24孔板中，进行分裂和扩增。为了μ-纯化igg，将上清液转移到2ml96深孔板上，同时将细胞储存在-150℃，直至进一步评价。[0538]1.2.5杂交瘤细胞抗体测序[0539]使用mini试剂盒从杂交瘤细胞沉淀球粒中提取并纯化mrna。然后根据制造商的说明，使用clonetechsmarterrace5′/3′试剂盒将纯化的mrna转录成cdna。使用简并vh和vl正义引物和基因特异性(ch/cl)反义引物，通过pcr从cdna中扩增出编码克隆009重链和轻链可变区的核酸序列。对pcr产物进行凝胶纯化，并且使用hd克隆试剂盒克隆到载体中，然后进行测序。对序列进行分析，以使其具有轻链或重链的抗体可变区。将阳性序列克隆到抗体表达载体中，并进行抗原特异性筛选。[0540]通过上述程序鉴定克隆009、1167、1143和1138为人icos特异性结合物。其可变区的氨基酸序列见下表4。[0541]表4：免疫源性icos抗体可变结构域的氨基酸序列。下划线是互补决定区(cdr)。[0542][0543][0544]1.3抗icos兔igg和小鼠杂交瘤igg抗体的制备、纯化及表征[0545]1.3.1抗icos兔igg抗体的克隆与表达[0546]为了重组表达家兔单克隆二价抗体，通过突出端克隆法(rshaun等人，biotechniques(1992)13,515-518；mzli等人，naturemethods(2007)4,251-256)将编码vh或vl的pcr产物作为cdna克隆到表达载体中。表达载体含有表达盒，所述表达盒由包括内含子a的5'cmv启动子和3'bgh聚腺苷酸化序列组成。除了表达盒之外，质粒还含有源于puc18的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，以用于在大肠杆菌(e.coli)中进行质粒扩增。使用了基本质粒的三种变体，一种质粒含有设计用以接受vh区的家兔igg恒定区，而两种另外的质粒含有用以接受vl区的兔或人κlc恒定区。[0547]使用重叠引物通过pcr扩增编码κ或γ恒定区和vl/vh插入序列的线性化表达质粒。将纯化的pcr产物与t4dna聚合酶一起孵育，这生成单链突出端。通过添加dctp停止反应。将质粒和插入序列合并并且与诱导位点特异性重组的reca一起孵育。将重组质粒转化到大肠杆菌中。第二天，挑取生长菌落并且通过质粒制备、限制性酶切分析和dna测序测试正确重组的质粒。抗icos克隆的氨基酸序列见表5。[0548]表5：兔igg形式的抗icos克隆的氨基酸序列[0549][0550][0551]对于抗体表达，在3l锥形瓶(corning，15l工作体积，37℃，8％v/vco2，80rpm，50mm振幅)中，将hek293f培养物扩增至1l体积(使用1％青霉素/链霉素、2mml-谷氨酰胺和0.1％pluronic的自由式f17)。转染前一天稀释培养物，并在1l培养基中将细胞数调节至106个细胞/ml。[0552]通过共转染分离的hc和lc质粒进行瞬时表达。在纯f17培养基中制备dna/fectopro(fectopro,polyplus)的mastermix，并孵育10分钟(根据polyplus方案)。将该转染混合物滴加到细胞悬液中，并立即加入增强剂。转染后18小时，用3g/l葡萄糖喂养培养物。1周后收获上清液，并通过以4000xg离心分离来清除。向清除的上清液中加入1m甘氨酸和300mmnacl，并通过亲和色谱进行纯化。[0553]初始捕获步骤通过以下方式在室温进行：将1l上清液以0.7ml/min的流速加载到25mlmabselectsure柱(gehealthcare)上，在连接至灌注系统的ph7.4的1xpbs中平衡。以3ml/min的流速用ph7.4的1xpbs洗涤柱，直至280nm的紫外吸收达到稳定的基线。在含有1.2ml0.5m组氨酸/hcl(ph6)的试管中，以3ml/min的流速作为3ml级分用50mm醋酸盐/naoh(ph3.2)洗脱结合的蛋白。[0554]将合并的级分浓缩并分别施加至superdex20016/60或superdex10010/300递增柱，所述柱在ph6.0的20mm组氨酸/hcl、140mmnacl中平衡，且流速为0.5或1ml/min。通过dionexultimate3000系列hplc系统(配备tosohtskgelg5000pwxl10μm7.8x300mm柱，流速为0.75ml/min)上的尺寸排阻色谱法进行蛋白质聚集分析。抗体的纯度和分子量通过sds-page分析，或通过微流控芯片毛细管电泳(labchipgx)使用含或不含dtt的缓冲液分析。[0555]1.3.2杂交瘤单克隆抗体的制备[0556]为了从杂交瘤培养物制备单克隆抗体，以2×105个细胞/ml接种细胞，并在500ml培养基中培养7天。杂交瘤上清液经无菌过滤，并通过蛋白质a亲和色谱和尺寸排阻色谱法纯化。合并根据尺寸排阻色谱法得到的含有单体fc融合蛋白的级分，并根据280nm时计算的消光系数，使用nanodrop系统(peqlabnd-1000)通过紫外法确定蛋白质浓度。通过dionexultimate3000系列hplc系统(配备tosohtskgelg5000pwxl10μm7.8x300mm柱，流速为0.75ml/min)上的尺寸排阻色谱法进行蛋白质聚集分析。抗体的纯度和分子量通过sds-page分析，或通过微流控芯片毛细管电泳(labchipgx)使用含或不含dtt的缓冲液分析。[0557]表6总结抗icosigg1抗体的产量和最终含量。[0558]表6：抗icos兔和小鼠igg克隆的生化分析[0559]分子产率[mg/l]单体[％]asec纯度[％]ce-sds14(009的muigg)1.08》99》988(1167的rbigg)1.07》99》9820(1143的rbigg)1.01》99》9718(1138的rbigg)1.02》99》96[0560]实例2[0561]抗icos抗体的表征[0562]2.1在人icos上的结合[0563]2.1.1表面等离子体共振(亲合力 亲和力)[0564]通过表面等离子体共振(spr)评估免疫源性icos特异性抗体与重组单体icosfc(kih)的结合。所有spr实验均采用biacoret200，在25℃下使用hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta、0.005％表面活性剂p20，biacore，freiburg/germany)。[0565]使用biacoret200评价软件(vaa，biacoreab，乌普萨拉/瑞典)推导动力学常数，以通过数值积分拟合1:1langmuir结合的速率方程，并用于定性估计亲合力。[0566]在同一实验中，确定免疫源性icos特异性抗体分子8、分子14、分子18和分子20与重组人icos之间相互作用的亲和力。为此，使用avi(glndifeaqkiewhe)标签对人icos的胞外域进行了亚克隆(序列参见表7)。[0567]表7：单体人icosfc(kih)avi标签的氨基酸序列[0568][0569][0570]如上所述进行fc融合蛋白的蛋白质生产。通过螯合色谱，然后进行尺寸排阻色谱，从细胞培养上清液中纯化分泌蛋白。[0571]第一个色谱步骤在以20mm磷酸钠、500nm氯化钠(ph7.4)平衡nintasuperflow软片(5ml，qiagen)上进行。通过在12个柱体积上施加从5％至45％的洗脱缓冲液(20mm磷酸钠，500nm氯化钠，500mm咪唑，ph7.4)梯度进行洗脱。[0572]将蛋白质浓缩并过滤，然后加载至用2mmmops、150mm氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠溶液(ph7.4)平衡的hiloadsuperdex75柱(gehealthcare)。[0573]使用两种设置进行亲和力测定。[0574]设置1：使用标准胺偶联试剂盒(biacore，freiburg/germany)，在ph4.5下，在cm5芯片上直接偶联抗兔fc抗体(jacksonimmunoresearch，cambridgeshire/uk)。固定化水平为约9000ru。在5.0nm浓度下捕获兔免疫源性icos抗体(分子8，分子18，分子20)30秒。重组人icosfc(kih)在7.5至600nm浓度范围内以60μl/分钟的流速通过流动池，时间为120秒。再监控解离720秒。通过减去在参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。此处，抗原与固定化抗兔fc抗体一起流过表面，但在表面上注射了hbs-ep而不是抗体。[0575]设置2：使用标准胺偶联试剂盒(biacore，freiburg/germany)，在ph5.0下，在cm5芯片上直接偶联抗小鼠igg抗体(gehealthcare,chicago/us)。固定化水平为约5000ru。在5.0nm浓度下捕获小鼠免疫源性icos抗体(分子14)30秒。重组人icosfc(kih)在7.5至600nm浓度范围内以60μl/分钟的流速通过流动池，时间为120秒。再监控解离720秒。通过减去在参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。此处，抗原与固定化抗小鼠igg抗体一起流过表面，但在表面上注射了hbs-ep而不是抗体。[0576]使用biaeval软件(gehealthcare)拟合1:1langmuir结合，确定抗icos抗体与人icosfc(kih)相互作用的亲和常数。结果表明，分子8、分子14、分子18和分子20与人icos结合(表8)。[0577]表8：抗icos抗体与重组人icos的结合[0578][0579]2.2配体阻断性[0580]进行了基于细胞的受体配体结合测定，以确定抗icos抗体阻断icos与其配体icoslg结合的能力。[0581]生物素化的重组人icos蛋白按照实例2.1中重组人icosfc(kih)的描述制备。[0582]将编码人icos配体的全长cdna亚克隆到哺乳动物表达载体中，并转染到cho-k1(atcc，ccl-61)中，以产生重组icos配体表达细胞(cho-icoslg)。使用lipofectamineltx试剂(invitrogen,#15338100)，按照生产商的方案来转染质粒。将稳定转染的icoslg阳性cho-k1细胞保持在补充10％胎牛血清(gibco,#16140063)和1％glutamax补充剂(gibco；#31331-028)的dmem/f-12(gibco,#11320033)中。转染后两天，将嘌呤霉素(invivogen；#ant-pr-1)添加至6μg/ml。初始筛选后，使用bdfacsariaiii细胞分选仪(bdbiosciences)对icoslg细胞表面表达最高的细胞进行分选，并培养以建立稳定的细胞克隆。使用apc抗人cd275抗体(biolegend；#309407)，为期4周进行facs分析，确认了表达水平及稳定性。[0583]用25μl/1x104个cho-icoslg细胞/孔包被384孔聚-d-赖氨酸板(corning，#356662)，密封并在37℃孵育过夜。最终测定浓度为150ng/ml的生物素化人icosfc(kih)与相应的抗icos抗体预孵育(14个稀释步骤1:2，测定起始浓度4μg/ml)，并在室温孵育1h。[0584]细胞包被的板离心分离后，向细胞中加入25μl/孔的预孵育样品，并在4℃孵育2h。用pbst缓冲液(dpbs,pan,p04-36500 0,1％tween20)洗涤3x90μl/孔后，在1xpbs(50μl/孔，sigmacat.no:g5882)中在室温用0.05％戊二醛将每个孔孵育10min，以固定细胞-样品混合物。[0585]用pbst缓冲液洗涤3x90μl/孔后，通过添加链霉亲和素-pod缀合物(roche,#11089153001,1:4000)并在rt下孵育1h，检测细胞表面上与人icos-l相互作用的人icos。用pbst缓冲液再洗涤3x90μl/孔后，加入25μl/孔的tmb底物(rochediagnosticsgmbh,#11835033001)达5min。测量在370/492nm下进行(表9)。[0586]表9：通过酶联免疫吸附测定法来确定抗icos克隆的配体结合特性[0587]分子来源配体阻断14小鼠免疫是8兔免疫是20兔免疫是18兔免疫是[0588]2.3表位表征[0589]由免疫源性抗icos抗体识别的表位通过表面等离子体共振来表征。[0590]2.3.1竞争结合(表面等离子体共振)[0591]为了分析抗icos抗体的人受体的竞争性结合，将生物素化的人icosfc(kih)直接偶联到链霉亲和素(sa)传感器芯片的不同流动池上。所用的固定化水平高达600共振基(ru)。免疫源性抗icos克隆分子8、分子14、分子18和分子20在2至500nm(3倍稀释)浓度范围内以30μl/分钟的流速通过流动池，历时120秒。省略解离，并且使第二抗icos抗体历时90秒以30μl/min的流速以100nm的浓度通过。通过减去在参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。[0592]spr实验均采用biacoret200，在25℃使用hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta、0.005％表面活性剂p20，biacore，freiburg/germany)。竞争结合实验表明，免疫源性抗icos克隆分子8、分子14和分子20与分子18共享不同的表位结合，因为这两种抗体可以同时结合人icosfc(kih)(表10)。[0593]表10：竞争性结合实验总结[0594][0595]o＝无约束力；1＝结合；x＝未确定，因为第二次注射含有与固定在芯片上的抗体相同的抗体[0596]实例3[0597]靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)的双特异性构建体的产生3.1靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)的双特异性单价抗原结合分子(1 1形式)的产生[0598]通过应用杵臼结构技术允许两个不同重链的组装，制备了具有对icos和对fap单价结合的双特异性激动性icos抗体。如国际专利申请号wo2010/145792a1所述，应用crossmab技术以减少错误配对的轻链的形成。[0599]fap结合物(4b9)的形成和制备描述于wo2012/020006a2中，该专利以引用方式并入本文。[0600]双特异性构建体与icos和fap单价结合(图1a)。它含有fap抗原结合结构域的交叉fab单元(vlch1)，其与抗icoshuigg1(含有y349c/t366s/l368a/y407v突变)的臼重链融合。fc杵重链(含有s354c/t366w突变)与包含抗icos抗原结合结构域的fab融合。通过将靶向的抗fap-fc臼与抗icos-fc杵链结合容许产生异二聚体，其包括特异性结合fap的fab和特异性结合icos的fab。[0601]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0602]得到的双特异性二价构建体类似于图1a中描述的构建体。成熟的双特异性单价抗icos(1167)/抗fap(4b9)huigg1p329glalakih抗体(1 1形式)的氨基酸序列示于表11中。[0603]表11：成熟的双特异性单价抗icos(1167)/抗fap(4b9)huigg1p329glalakih抗体(分子10)的氨基酸序列[0604][0605]双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:1:1:1的比率(“载体杵重链”:“载体轻链1”:“载体臼重链”:“载体轻链2”)来转染细胞。[0606]为了在1l摇瓶中生产，在转染前24小时接种106个细胞/mlhek293f细胞。使用编码感兴趣靶蛋白的质粒进行瞬时转染。在纯f17培养基中制备dna/fectopro的mastermix，并孵育10分钟。将该转染混合物滴加到细胞悬液中，并立即加入增强剂。转染后18小时，用3g/l葡萄糖喂养培养物。[0607]培养7天后，通过在210xg下离心分离15min收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至最终浓度0.01％(w/v)，并保持在4℃。[0608]通过使用蛋白质a-sepharosetm亲和色谱法(gehealthcare,sweden)和superdex200尺寸排阻色谱法的亲和色谱法，分两步从上清液中纯化其中所含的重组抗体。简言之，将含有澄清培养上清液的抗体置于用pbs缓冲液(10mmna2hpo4、1mmkh2po4、137mmnacl和2.7mmkcl，ph7.4)平衡的mabselectsure蛋白质a(5-50ml)柱上。用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白质。用ph3.0的50mm柠檬酸盐缓冲液洗脱抗体。用ph9.0的2mtris缓冲液中和含蛋白级分。然后，合并洗脱的蛋白级分，用amicon超离心过滤装置(mwco：30k，millipore)浓缩，并加载到superdex200hiload26/60凝胶过滤柱(gehealthcare,sweden)上，该凝胶过滤柱用20mm组氨酸、140mmnacl(ph6.0)平衡。通过使用根据pace等人,proteinscience4(1995)2411-2423的基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数确定280nm处的光密度(od)，来确定各种级分的蛋白质浓度，其中320nm处的od作为本底校正。将单体抗体级分混合、速冻并储存在-80℃。提供部分样品用于随后的蛋白质分析和表征。[0609]使用nanodrop分光光度计(thermofisher)对纯化的蛋白质进行量化，并通过在变性和还原条件下进行ce-sds(labchipgx,perkinelmer)和分析性sec(up-sw3000,toshobioscience)进行分析。在还原条件下，使用labchip设备通过比较表观分子尺寸与分子量标准来鉴定与igg相关的多肽链。通过与超高效液相色谱系统(uplc)偶联的最先进的电喷雾-四极杆飞行时间(esi-q-tof)质谱仪(brukermaxis)进行分子同一性确定。[0610]通过蛋白质a分析所有构建体的表达水平。在此类非优化瞬时表达实验中，每升细胞培养物上清液的平均蛋白质产量为25mg至86mg纯化蛋白质(见表12、14、16、18、21、31和33)。[0611]表12：双特异性单价抗icos/抗fapigg1p329glala抗原结合分子(分子10)的生化分析[0612][0613]3.2靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)的双特异性单价抗原结合分子(1 1头至尾形式)的产生[0614]已制备了具有对icos单价结合且对fap单价结合的双特异性激动剂4-1bb抗体，也称为1 1头至尾形式，如图1b所示。[0615]在本实例中，构建体的第一重链hc1包含以下组分：后接fc杵的抗icos结合物的vhch1在其c末端与抗fap结合物的vl融合。第二重链hc2包含fc臼，在其c末端与抗fap结合物的vh融合。fap结合剂4b9的形成和制备描述于wo2012/020006a2中，该专利以引用方式并入本文。按照实例1所述产生抗icos(1167)的结合物。[0616]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0617]双特异性1 1抗icos抗faphuigg1p329glala抗体是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:1:1的比率(“载体杵重链”:“载体轻链”:“载体臼轻链”)转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0618]1 1头至尾抗icos、抗fap构建体的氨基酸序列见表13。[0619]表13：成熟的双特异性1 1头至尾抗icos(1167)/抗fap(4b9)huigg1p329glalakih抗体(分子11)的氨基酸序列[0620][0621]表14：双特异性1 1头至尾抗icos(1167)/抗fap(4b9)igg1p329glala抗原结合分子(分子11)的生化分析[0622][0623]3.3靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)且对于icos为二价而对于fap为单价(2 1形式)的双特异性抗原结合分子的产生[0624]制备了具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性激动性icos抗体(也称为2 1)，如图1c所示。[0625]在本实例中，构建体的第一重链hc1包含以下组分：后接fc杵的抗icos结合物的vhch1在其c末端与抗fap结合物的vl融合。第二重链hc2包含后接fc臼的抗icos的vhch1，在其c末端与抗fap结合物的vh融合。如实例1所述，产生了针对icos(009、1138、1143和1167)的结合物。[0626]兔抗体分子20和分子18的同源性建模表明，vh位置199和251(kabat35a和50)的两个半胱氨酸正在cdr-h1与cdr-h2之间形成二硫键，而vl框架位置726(kabat80)的半胱氨酸是游离的并暴露于溶剂。在这两种情况下，我们都选择最保守的选项，即用丝氨酸替代所有不需要的半胱氨酸，即c199s、c251s和c726s。由于我们预期抗体分子20将需要人源化，我们添加了两个额外的变体，其中进行的取代与最接近的匹配人种系ighv3-23*01，即c199s和c251v一致。相应地改变了位置252、296和297(kabat51、62和63)，以评价cdr-h2中的这些取代是否会被耐受而不损失结合亲和力，并具有增加人性的益处。如果未明确说明，则残留物指数以wolfguy编号给出。表15总结分子20和分子18的氨基酸序列的变化以及变体分子的数量。[0627]表15：分子18和分子20的氨基酸变体[0628][0629]为了验证分子14中框架突变的影响，产生了2 1形式的两种变体(分子15和分子40)。[0630]fap结合物(4b9)的形成和制备描述于wo2012/020006a2中，该专利以引用方式并入本文。根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0631]双特异性2 1抗icos抗faphuigg1p329glala抗体是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:2:1的比率(“载体杵重链”:“载体轻链”:“载体臼轻链”)转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0632]2 1抗icos、抗fap构建体的氨基酸序列可见于表16中。[0633]表16：成熟的双特异性2 1抗icos/抗fap(4b9)huigg1p329glalakih抗体(分子11)的氨基酸序列[0634][0635][0636][0637][0638][0639][0640][0641]表17：具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性构建体(2 1icos/fap人igg1p329glala)的生化分析[0642][0643][0644]3.4靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)且对于icos为二价而对于fap为单价的双特异性抗原结合分子(2 1crossfab-iggp329glala)的产生[0645]制备了具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性激动性icos抗体(也称为2 1iggcrossfab(fap结合物中的vh/vl交换))，如图1d所示。[0646]在本实例中，构建体的第一重链hc1包含以下组分：抗fap抗原结合结构域的vlch1，然后是抗icos抗原结合结构域的vhch1和fc杵。第二重链hc2包含抗icos的vhch1，然后是fc臼。按照实例1所述产生抗icos(1167)的抗体。fap抗体(4b9)的形成和制备描述于wo2012/020006a2中，该专利以引用方式并入本文。[0647]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0648]双特异性2 1抗icos抗faphuigg1p329glala抗体是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:2:1:1的比率(“载体重链(vl-ch1-vh-ch1-ch2-ch3)”:“载体轻链(vl-cl)”:“载体重链(vh-ch1-ch2-ch3)”:“载体轻链(vhcl)”转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0649]这些2 1抗icos、抗fapcrossfab-iggp329glala构建体的氨基酸序列可见于表18中。[0650]表18：成熟双特异性2 1抗icos(1167)/抗fap(4b9)crossfab-iggp329glala的氨基酸序列[0651][0652][0653][0654]表19：具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性构建体(2 1抗icos、抗fapcrossfab-iggp329glala)的生化分析[0655][0656]3.5靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)且对于icos为二价而对于fap为单价的双特异性抗原结合分子(反向2 1crossfab-iggp329glala)的产生[0657]制备了具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性激动性icos抗体(也称为2 1iggcrossfab，反向(fap结合物中的vh/vl交换))，如图1e所示。[0658]在本实例中，构建体的第一重链hc1包含以下组分：抗icos结合物的vhch1，然后是抗fap结合物的vlch1和fc杵。第二重链hc2包含抗icos的vhch1，然后是fc臼。按照实例1所述产生抗icos(1167)结合物。fap结合物(4b9)的形成和制备描述于wo2012/020006a2中，该专利以引用方式并入本文。[0659]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0660]双特异性2 1抗icos抗faphuigg1p329glala反向抗体是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:2:1:1的比率(“载体重链(vh-ch1-vl-ch1-ch2-ch3)”:“载体轻链(vl-cl)”:“载体重链(vh-ch1-ch2-ch3)”:“载体轻链(vh-cl)”转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0661]2 1抗icos、抗fapcrossfab-iggp329glala反向构建体的氨基酸序列可见于表20中。[0662]表20：成熟双特异性2 1抗icos(1167)/抗fap(4b9)crossfab-iggp329glala的氨基酸序列[0663][0664][0665]表21：具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性构建体(反向2 1icos/fap人igg1p329glala)的生化分析[0666][0667]实例4[0668]小鼠和兔抗icos抗体的人源化[0669]4.1方法[0670]通过查询人v区和j区序列的blastp数据库来鉴定鼠输入序列(裁剪至可变部分)的合适的人受体框架。选择人受体框架的选择标准是序列同源性、相同或相似的cdr长度和人种系的估计频率，而且还有vh-vl结构域界面上某些氨基酸的保守性。在种系鉴定步骤之后，将鼠输入序列的cdr移植到人受体框架区上。这些初始cdr移植物和亲本抗体之间的每个氨基酸差异被评估对相应可变区的结构完整性的可能影响，并且在认为适当时引入对亲本序列的“回复突变”。结构评估基于亲代抗体和人源化变体两者的fv区同源性模型，该模型通过内部抗体结构同源性建模方案创建得到，其使用bioviadiscoverystudioenvironment版本17r2实现。在一些人源化变体中，包括“正向突变”，即，将亲本结合物的给定cdr位置上发生的原始氨基酸改变为人受体种系的等效位置上发现的氨基酸的氨基酸交换。目的是增加人源化变体的总体人特征(在框架区之外)，以进一步降低免疫原性风险。[0671]内部开发的经由电脑模拟的工具用于预测配对的vh和vl人源化变体的vh-vl结构域方向(wo2016/062734)。将结果与亲本结合物的预测vh-vl结构域取向进行比较，以选择在几何结构上与原始抗体接近的构架组合。基本原理是检测vh-vl界面区中可能的氨基酸交换，这些交换可能导致两个结构域的配对发生破坏性变化，进而对结合特性产生不利作用。[0672]4.2受体框架的选择及其适应[0673]009的人源化[0674]表1：icos克隆009的受体框架[0675][0676]后cdr3框架区改编自人ighj种系ighj6*01/02(yyyyygmdvwgqgttvtvss,seqidno:120)和人igkj种系igkj2*01(ytfgqgtkleik,seqidno:121)。与受体框架相关的部分以粗体显示。[0677]基于结构考虑，在h40(p》s)、h42(g》e)、h49(g》a)、h94(r》w)、h105(k》a)[vh1]、h40(p》s)、h42(g》e)、h93(a》t)、h94(r》w)、h105(k》a)[vh2]、l38(q》h)、l43(a》g)、l49(y》w)、l100(q》s)[vl1]和l38(q》h)、l43(a》g)、l49(y》w)、l100(q》s)[vl2]位引入了从人受体框架到亲本结合物中的氨基酸的回复突变。[0678]此外，h60(s》a)、h61(d》a)[vh1]、h60(s》a)[vh2]、l24(k》q)[vl1]和l24(k》r)[vl2]位被鉴定为正向突变(kabat编号)有希望的候选者。[0679]1138的人源化[0680]表23：icos克隆1138的受体框架[0681]兔v区种系移植物变体人受体v区种系的选择vhighv1s40*01vhg1ighv3-23*03vligkv1s1*01vlg1igkv1-39*01[0682]后cdr3框架区改编自人ighj种系ighj1*01(aeyfqhwgqgtlvtvss,seqidno:122)和人igkj种系igkj4*01/02(ltfgggtkveik,seqidno:1223)。与受体框架相关的部分以粗体显示。[0683]基于结构考虑，在h71(r》k)、h72(d》t)、h73(n》s)、h76(n》t)、h91(y》f)、h94(k》r)[vh1]和l1(d》a)、l42(k》q)、l43(a》p)[vl1]位引入了从人受体框架到亲本结合物中的氨基酸的回复突变。此外，在vh的一个变体中，n末端被反向突变(从v》q中去除h1和突变h2)，并且在vh的一个变体中，兔框架的h75位的缺口被重新引入。[0684]此外，位置h61(s》d)、h62(w》s)、h63(a》v)[vh1]和l24(q》r)[vl1]被鉴定为前向突变(kabat编号)的有希望的候选者。[0685]1143的人源化[0686]表24：icos克隆1143的受体框架[0687]兔v区种系移植物变体人受体v区种系的选择vhighv1s40*01vhg1ighv3-23*03vligkv1s4*01vlg1igkv1-39*01[0688]后cdr3框架区改编自人ighj种系ighj1*01(aeyfqhwgqgtlvtvss,seqidno:122)和人igkj种系igkj4*01/02(ltfgggtkveik,seqidno:123)。与受体框架相关的部分以粗体显示。[0689]基于结构考虑，在h48(v》i)、h49(s》g)、h71(r》k)、h72(d》t)、h73(n》s)、h76(n》t)、h91(y》f)、h94(k》r)[vh1]和l42(k》q)、l43(a》p)[vl1]位引入了从人受体框架到亲本结合物中的氨基酸的回复突变。此外，在vh的两个变体中，n末端被回复突变(从v》q中去除h1和突变h2)，并且在vh的两个变体中，兔框架的h75位的缺口被重新引入。[0690]此外，位置h61(t》d)[vh1]和l24(q》r)[vl1]被鉴定为前向突变(kabat编号)的有希望的候选者。[0691]4.3人源化变体[0692]回复突变冠以前缀b，正向突变冠以前缀f，例如bm48i是指在48位(kabat编号)上从蛋氨酸到异亮氨酸的回复突变(人种系氨基酸到亲本抗体氨基酸)。[0693]表25：克隆009的变体[0694][0695]表26：克隆1138的变体[0696][0697][0698]表27：克隆1143的变体[0699][0700]人源化变体的氨基酸序列可见下表28。[0701]表28：克隆icos009、1138和1143的人源化变体的氨基酸序列[0702][0703][0704][0705][0706]4.4人源化变体的克隆和表达[0707]重链和轻链dna序列的可变区在框架中亚克隆，恒定重链或恒定轻链预插入各自的受体哺乳动物表达载体。蛋白质表达由mpsv启动子驱动，并且合成的polya信号序列存在于cds的3’端。选定抗icos人源化变体的氨基酸序列示于表29中。[0708]表29：人igg形式的亲本和选定抗icos人源化变体的氨基酸序列[0709][0710][0711][0712][0713][0714][0715]人igg形式的人源化变体是通过使用expifectamine293(thermofisher)将expi293f(thermofisher)细胞与哺乳动物表达载体共转染而产生的。用相应的表达载体以1:1的比率(“载体重链”:“载体轻链”)转染细胞。[0716]为了在48深孔板中产生，在转染当天接种了2.5e6个细胞/ml的expi293f细胞。使用编码感兴趣靶蛋白的质粒进行瞬时转染。在opti-mem培养基(thermofisher)中制备dna/expifectamine293的mastermix，孵育5分钟，并加入细胞悬液中。转染后24小时，向每个孔中加入10μl增强子1(thermofisher)和100μl增强子2(thermofisher)。[0717]培养5天后，通过在1200xg下离心分离50min收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.2μm过滤器)，并保持在4℃。[0718]分泌的蛋白质通过在96孔形式的液体处理平台上使用蛋白质a亲和色谱法的亲和色谱法从细胞培养上清液中纯化。对于亲和色谱法，将上清液加载到proplusphytip柱(mabselectsuretm)(cv＝40μl；尖端体积500μlphynexus)上，所述柱用2倍290μl20mm磷酸钠、20mm柠檬酸钠(ph7.5)来平衡。用4倍300μl20mm磷酸钠、20mm柠檬酸钠(ph7.5)来洗涤除去未结合的蛋白，并且用2倍150μl20mm柠檬酸钠、100mm氯化钠、100mm甘氨酸(ph3.0)洗脱靶标蛋白。通过加入ph8.0的30μl0.5m磷酸钠中和蛋白质溶液。[0719]使用nanodrop分光光度计(thermofisher)对纯化的蛋白质进行量化，并通过在变性和还原条件下进行ce-sds(labchipgx,perkinelmer)和分析性sec(up-sw3000,toshobioscience)进行分析。在还原条件下，使用labchip设备通过比较表观分子尺寸与分子量标准来鉴定与igg相关的多肽链。[0720]实例5[0721]抗cea抗体a5b7的人源化变体的产生[0722]5.1方法[0723]抗cea抗体a5b7由例如m.j.banfield等人(proteins1997,29(2),161-171)公开，并且其结构可参见蛋白质结构数据库(pdb)中的pdbid:1clo(www.rcsb.org，h.m.berman等人，theproteindatabank，nucleicacidsresearch，2000，28，235-242)。该条目包括重链和轻链可变结构域序列。为鉴定抗cea结合剂a5b7的人源化过程中的合适的人受体框架，采用一种经典方法，即寻找具有高序列同源性的受体框架，在该框架上嫁接cdr，并且评估可以设想的回复突变。更明确地说，判断鉴定出的构架与亲代抗体的每个氨基酸差异对结合剂的结构完整性的影响，并且在适当时引入朝向亲代序列的回复突变。结构评估基于亲代抗体及其人源化版本的fv区同源性模型，该模型通过内部抗体结构同源性建模工具创建得到，该工具使用bioviadiscoverystudioenvironment4.5版实现。[0724]5.2受体框架的选择及其适应[0725]受体框架的选择如下表30所示：[0726]表30：受体框架[0727][0728]cdr3后框架区改编自用于重链的人j元件种系igjh6，并且序列类似于用于轻链的kappaj元件igkj2。[0729]基于结构上的考虑，在重链的93位和94位引入从人受体框架到亲代结合剂中的氨基酸的回复突变。[0730]5.3所得人源化cea抗体的vh和vl区[0731]所得人源化cea抗体的vh结构域可参见下表31，并且所得人源化cea抗体的vl结构域可参见下表32。[0732]表31：人源化cea抗体的vh结构域的氨基酸序列(基于人受体框架ighv3-23或ighv3-15)[0733][0734][0735]对于重链，发现初始变体3-23a5-1适用于结合测定(但表现出的结合能力略低于亲代鼠抗体)，并且被选作进一步修饰的起点。与人源化变体3-23a5-1相比，基于ighv3-15的变体表现出更低的结合活性。[0736]为恢复亲代嵌合抗体的全部结合活性，创建了变体3-23a5-1a、3-23a5-1c和3-23a5-1d。还测试了变体3-23a5-1，cdr-h2的长度能否适应人受体序列的，但该构建体完全丧失结合活性。由于cdr-h2(asn53-gly54)中存在假定的脱酰胺基热点，我们将该基序改为asn53-ala54。另一个可能的热点asn73-ser74回复突变为lys73-ser74。因此，创建了变体3-23a5-1e。[0737]表32：人源化cea抗体的vl结构域的氨基酸序列(基于人受体框架igkv3-11)。[0738][0739][0740]轻链基于人igkv3-11受体框架发生人源化。在系列a5-l1至a5-l4中，了解到变体a5-l1表现出良好的结合活性(但略低于亲代抗体)。cdr-l1的部分人源化(变体a5-l2；kabat位置30和31处)完全消除了结合。同样，cdr-h2的人源化(变体a5-l3；kabat位置50至56处)也完全消除了结合。位置90(变体a5-l4)对结合特性具有显著贡献。该位置处的组氨酸对于结合很重要。因此，选择变体a5-l1进行进一步修饰。[0741]系列a5-l1a至a5-l1d解决了恢复亲代嵌合抗体的全部结合潜能所需的回复突变的问题。变体a5-l1a显示，kabat位置1、2、整个框架2以及kabat位置71的回复突变未增加任何更多结合活性。变体a5-l1b和a5-l1c定位了那些位置的子集，并确认它们不改变结合特性。在kabat位置46和47处发生回复突变的变体a5-l1d表现出最佳的结合活性。[0742]5.4人源化a5b7抗体的选择[0743]基于vh和vl的新型人源化变体，根据wo2012/130831a1中所述的方法，将新型cea抗体表达为具有效应子沉默fc(p329g；l234,l235a)的huigg1抗体，以消除与fcγ受体的结合；检测它们与mkn45细胞上表达的cea的结合，并且与相应的亲代鼠a5b7抗体进行比较。[0744]表33：表达为huigg1_lala_pg抗体的vh/vl组合[0745]a5-l1aa5-l1ba5-l1ca5-l1d3-23a5-1ap1ae2164p1ae2165p1ae2166p1ae21673-23a5-1c‑‑p1ae2176p1ae21773-23a5-1dp1ae2179-p1ae2181p1ae2182[0746]mkn45(dsmzacc409)是表达cea的人胃腺癌细胞系。在高级rpmi 2％fcs 1％glutamax中培养细胞。检查mkn-45细胞的活力，并且细胞重悬并调整至密度为1mio细胞/ml。将100μl该细胞悬液(含0.1mio细胞)接种到96孔圆底板中。在400xg下将孔板离心4min，并且除去上清液。然后将40μl稀释的抗体或facs缓冲液加入细胞中，并且在4℃下孵育30分钟。孵育后，用facs缓冲液(每孔150μl)洗涤细胞两次。然后将20μl稀释的二级pe抗人fc特异性二抗(109-116-170,jacksonimmunoresearch)加入细胞中。将细胞在4℃下再孵育30分钟。为去除未结合的抗体，用facs缓冲液(每孔150μl)将细胞再洗涤两次。为固定细胞，将100μlfacs缓冲液(含1％pfa)加入孔中。测量前，将细胞重悬于150μlfacs缓冲液中。使用bd流式细胞仪测量荧光。所有测试的结合剂均能够与mkn45细胞结合，但与亲代a5b7抗体相比，结合能力略有下降。在所有测试的变体中，克隆p1ae2167具有最佳结合力，因此被选择用于进一步开发。[0747]5.5使用表面等离子体共振(biacore)确定鼠cea-抗体a5b7的人源化变体的fab片段对人cea的亲和力[0748]使用biacoret200仪器，通过表面等离子体共振评估鼠cea抗体a5b7的人源化变体的fab片段对人cea的亲和力。在cm5芯片上，通过标准胺偶联将人cea(hun(a2-b2)a-avi-hisb)以40nm的浓度固定化到流通池2上，持续30s，达到约100ru。随后将鼠cea抗体a5b7的人源化变体的fab片段作为分析物(3倍稀释液，浓度范围为500-0.656nm)注入，接触时间为120s，解离时间为250s或1000s，并且流速为30μl/min。通过在60s内2次脉冲注入10mm甘氨酸/hcl(ph2.0)，实现人cea(hun(a2-b2)a-avi-hisb)水平的再生。数据针对未固定化的流通池1和零浓度分析物进行双重参考。将分析物的传感图拟合到简单的1:1langmuir相互作用模型。人cea(a2结构域)的亲和常数[kd]汇总于下表34中。[0749]表34：代表鼠cea抗体a5b7的不同人源化变体的fab片段对人cea(a2结构域)的亲和常数。[0750][0751][0752]鼠cea抗体a5b7的人源化变体的亲和力低于亲代鼠抗体。选择来源于p1ae2167的fab片段p1ae4138(重链包含vh变体3-23a5-1a并且ckappa轻链包含vl变体a5-l1d)作为最终的人源化变体。此外，为去除脱酰胺位点，在vh结构域引入在kabat位置54(g54a)处的甘氨酸到丙氨酸的突变，从而得到vl变体3-23a5-1e。将最终的人源化抗体(重链包含vh变体3-23a5-1e并且ckappa轻链包含vl变体a5-l1d)命名为a5h1el1d或hua5b7。[0753]实例6[0754]靶向icos和癌胚抗原相关细胞粘附分子(cea)的双特异性抗原结合分子的产生[0755]6.1靶向icos和癌胚抗原相关细胞粘附分子(cea)的双特异性单价抗原结合分子(1 1形式)的产生[0756]通过应用杵臼结构技术允许两个不同重链的组装，制备了具有对icos和对cea单价结合的双特异性激动性icos抗体。如国际专利申请号wo2010/145792a1所述，应用crossmab技术以减少错误配对的轻链的形成。图1f至图1h示出单价结合icos和单价结合cea的双特异性抗原结合分子的示意图。[0757]对于cea抗原结合结构域，克隆medi-565的vh和vl序列获自国际专利申请号wo2014/079886al。实例5中描述cea抗体(a5h1el1d)的产生和制备。对于icos抗体jmab136，克隆jmab136的vh和vl序列获自专利us2008/0199466al。[0758]分子37含有cea抗体的交叉fab单元(vlch1)，所述fab单元与huigg1的杵重链(含有s354c/t366w突变)融合。fc臼重链(含有y349c/t366s/l368a/y407v突变)与结合icos的fab单元融合(图1f)。分子41含有cea抗体的交叉fab单元(vlch1)，所述fab单元与huigg1的臼重链(含有y349c/t366s/l368a/y407v突变)融合。fc杵重链(含有s354c/t366w突变)与结合icos的fab片段融合(图1g)。分子42和分子43含有icos抗体的交叉fab单元(vlch1)，所述fab单元与huigg1的臼重链(含有y349c/t366s/l368a/y407v突变)融合。fc杵重链(含有s354c/t366w突变)与结合cea的fab片段融合(图1h)。[0759]通过将fc臼与fc杵链组合容许产生异二聚体，其包括特异性结合cea的fab片段和特异性结合icos的fab片段。[0760]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0761]双特异性单价抗icos和抗ceacamhuigg1p329glala是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:1:1:1的比率(“载体杵重链”:“载体轻链1”:“载体臼重链”:“载体轻链2”)来转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0762]成熟的双特异性单价抗icos/抗ceacamhuigg1p329glalakih抗体序列的氨基酸序列示于表35中。[0763]表35：成熟的双特异性1 1抗icos/抗ceacam人igg1p329glala抗原结合分子的氨基酸序列[0764][0765][0766][0767][0768][0769][0770]表36：单价结合icos且单价结合cea的双特异性抗原结合分子(1 1icos/cea人igg1p329glala抗原结合分子)的生化分析[0771][0772]6.2靶向icos和癌胚抗原相关细胞粘附分子(cea)且二价结合icos并单价结合cea的双特异性抗原结合分子(2 1形式)的产生[0773]与如图1c所示靶向fap者类似，制备了二价结合icos且单价结合cea的双特异性激动性icos抗体(也称为2 1)。[0774]在本实例中，构建体的第一重链hc1包含以下组分：后接fc杵的抗icos抗体的vhch1，在其c末端与cea抗体的vl融合。第二重链hc2包含后接fc臼的抗icos抗体的vhch1，在其c末端与cea抗体的vh融合。对于cea抗原结合结构域，克隆medi-565的vh和vl序列获自国际专利申请号wo2014/079886al。对于icos抗体jmab136，克隆jmab136的vh和vl序列获自专利us2008/0199466al。[0775]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0776]双特异性2 1抗icos抗ceahuigg1p329glala抗体是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:2:1的比率(“载体杵重链”:“载体轻链”:“载体臼轻链”)转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0777]2 1抗icos、抗cea构建体的氨基酸序列可见于表37中。[0778]表37：成熟的双特异性2 1抗icos、抗cea、抗cea人igg1p329glala的氨基酸序列[0779][0780][0781]表38：二价结合icos且单价结合cea的双特异性抗原结合分子(2 1icos/cea人igg1p329glala)的生化分析[0782][0783]实例7[0784]分子的体外功能表征[0785]7.1抗icos抗体与icos表达细胞的结合(流式细胞术分析)[0786]使用表达icos的cho细胞(atcc，ccl-61，转染以稳定过表达人icos)测试实例1中制备的几种icos抗体的结合。[0787]简言之，收获悬浮细胞，计数，检查存活性，并在facs缓冲液(含0.1％bsa的pbs)中以每ml1百万个细胞的速度重新悬浮。将100μl细胞悬液(含10万个细胞)在圆底96孔板中于4℃孵育30min，其中抗icos的浓度增加(fap-icos构建体与t细胞结合的浓度为7pm–120nm)，用0.1％bsa的冷pbs洗涤细胞两次，用标记的二抗(分子1，8与来自jacksonimmunoresearchlab#709-116-149的pe缀合的驴抗人h lpe；分子18和20与来自jacksonimmunoresearchlab#711-116-152的驴抗兔h lpe(稀释度为1:100)，分子14与来自jacksonimmunoresearchlab#715-116-150的驴抗小鼠h lpe)在4℃再孵育30min，并用0.1％bsa的冷pbs洗涤两次。使用每孔75μlfacs缓冲液中的1％pfa将染色在4℃黑暗条件下固定20min。[0788]此外，除了以下修饰外，上述分子与人sr细胞(crl-2262)的结合如上所述进行：将sr细胞以每毫升2百万个细胞的速度重新悬浮在facs缓冲液(bd)中。将100μl细胞悬液(含20万个细胞)在96孔pp板中于4℃孵育1h，抗icos浓度增加(7pm–510nm)，用0.1％bsa的冷pbs洗涤细胞两次，于4℃用上述标记的二抗再孵育30min。[0789]使用facsfortessa(软件facsdiva)通过facs分析荧光。使用graphpadprism7获得了结合曲线和ec50值。[0790]结果表明，icos分子能够以浓度依赖性方式与人icos结合(图2a和图2b)。ec50值示出于表39中。观察到分子20和8的结合最好。[0791]表39：不同抗icosigg与icos cho或sr细胞结合的ec50值[0792][0793]此外，如上所述，测试了实例4中制备的icos抗体009、1143v2和1138的人源化变体(以分子15、28和32的形式)与人icos的结合。[0794]结果表明，这些分子能够以浓度依赖性方式与人icos结合(图3a至图3c)。ec50值示出于表40中。对于抗体009(分子14)，必须使用不同的参考分子进行测定(分子15，fap靶向2 1icos抗原结合分子)，其表现出结合特性发生改变。因此，很难与亲本分子进行比较。这三种变体表现出相当的结合特征(图3a)，与分子25和27相比，分子26表现出轻微受损的结合。[0795]对于分子28，研究表明分子31显示出与亲本抗体(分子28)的相当结合，并且与分子29和30相比显示出更高的绝对结合(图3b)。[0796]与亲本抗体相比，分子35显示出相似的结合行为，而分子33和分子34显示出较高的ec50值，与亲本抗体相比，总体结合较低(分子32)。[0797](图3c)。[0798]表40：不同抗icosigg与icos 结合的ec50值[0799]ec50(pm)max(log10(mfi))分子15516.13.059分子2529196.547分子2652577.804分子2726986.852ꢀꢀꢀ分子2825584.881分子2951952.378分子3022512.747分子3117464.444ꢀꢀꢀ分子3221164.303分子3375783.888分子34101601.914分子3527214.55[0800]7.2活化jurkat-nfat报告细胞(基于发光的分析)[0801]通过使用对nfat核易位作出应答的表达荧光素酶的工程化jurkat细胞系来评估对同时tcr接合的依赖性。[0802]使用包被有1.5μg/mlacd3(biolegend#317304)和2μg/mlacd28(biolegend#302914)或pha-l(sigma#,1μg/ml)和il-2(proleukin,novartis；200u/ml)的细胞培养瓶在jurkatnfat培养基(rpmi1640培养基含有10％fcs、1％glumax、25mmhepes、1xneaa、1％so-丙酮酸盐；选择：200ug/ml潮霉素b)中预活化gloresponsejurkatnfat-re-luc2p(promega#cs176501)报告细胞系以诱导icos表达。[0803]在测定前，细胞被饥饿(无刺激的jurkatnfat培养基)过夜。用比率为1:1的1μg/mlbi《huiggf(ab’)2》(jir,#109-066-097)和1μg/mlbi《miggf(ab’)2》(jir,#115-066-072)的混合物同时包被(4℃过夜)测定板streptawelllhighbind(透明，96孔，roche#11989685001)。第二天洗涤板，并且加入指定浓度(范围为29pm–120000pm)的0.25μg/mlacd3(biolegend#317315)加抗icos分子，并且将板在室温孵育2小时。用dpbs(gibco,#14190136)洗涤该板一次，并加入0.15mio刺激和饥饿的gloresponsejurkatnfat-re-luc2p。根据制造商的说明，在37℃和5％co2下孵育5小时后，使用promegaoneglo测定系统(promega,#e6120)通过发光读数评估nfat介导的信号传导。将板重新格式化为无菌96孔平底白色板(costar,#3917)，并在tecanspark10m板阅读器(发光读数，1000ms积分时间，自动衰减设置)上读取。使用graphpadprism7获得曲线和ec50值。结果表明，所有测试的icos抗体(野生型igg形式)都能够以浓度依赖性方式活化jurkat-nfat报告细胞(图4)。ec50值示出于表41中。观察到分子20的活化最强。[0804]表41：使用不同抗icosigg活化jurkat-nfat报告细胞系的ec50值[0805]分子ec50[nm]分子140.08分子180.09分子200.02分子80.13[0806]此外，如上所述，测试了实例4中制备的icos抗体009、1143v2和1138的人源化变体(以分子15、28和32的形式)活化jurkat-nfat报告细胞的能力。[0807]结果表明，这些分子能够以浓度依赖性方式活化jurkat-nfat报告细胞(图5a至图5c)。ec50值示出于表42中。对于分子14，必须使用不同的参考分子进行测定(分子15)，与变体相比，其总体激动活性较低。因此，很难与亲本分子进行比较。这三种变体表现出非常相似的激动活性，这与之前与人icos结合的情况是一样的。[0808]分子28及其变体表现出相当的ec50值，且在最大激动活性方面只有轻微差异，等级为分子29》分子30》分子28＝分子31，这也与前述与人icos结合的结果一致。[0809]此外，仅观察到分子32及其人源化变体的激动活性存在微小差异：最大激动活性的等级为分子35》分子33》分子34》分子32。就ec50而言，等级为分子34》分子32》分子33》分子35。[0810]表42：使用不同抗icosigg活化jurkat-nfat报告细胞系的ec50值[0811][0812][0813]7.3与icos配体的竞争(流式细胞术分析)[0814]在icos cho转染细胞上测试了实例1中制备的几种抗icos抗体与人icos配体(seqidno:215,uniprotno.o75144)的竞争(见实例2.2)。[0815]简言之，收获细胞，计数，检查存活性，并在facs缓冲液(含0.1％bsa的pbs)中以每ml1百万个细胞的速度重新悬浮。将100μl细胞悬液(含10万个细胞)在圆底96孔板中于4℃与以alexa-fluor647(＝icosl预结合)标记的120nmicosl或以alexa-fluor488(＝icosigg预结合)标记的抗icos分子孵育30min。用0.1％bsa的冷pbs洗涤细胞两次，并在抗icosa488分子(对于icosl预结合的孔)或icosl-a647分子(对于抗icos分子预结合的孔)浓度增加(7pm-120)的情况下孵育。再次用0.1％bsa的冷pbs洗涤细胞两次，然后在4℃黑暗条件下使用每孔75μl1％pfa的facs缓冲液重新孵育并固定20min。使用facsfortessa(软件facsdiva)通过facs分析荧光。使用graphpadprism7分析数据。[0816]表43示出不同条件下抗icos分子在120nm浓度下的中位荧光强度(mfi)和％相对结合(计算方法为mfi(icosl 抗-icos)/mfi(仅抗icos)*100，所有mfi均使用来自具有细胞和二抗的孔的信号作为基线进行基线校正)。显示，除非竞争性对照分子外，所有抗icos抗体仍与huicos结合，即使添加了120nmicosl。[0817]表43：在huicos-配体(icosl)存在/不存在情况下抗icosigg的绝对和相对结合[0818][0819][0820]7.4双特异性肿瘤靶向icos分子与icos、fap或cea过表达细胞的结合(流式细胞术分析)[0821]使用icos表达cho细胞(atcc，ccl-61，转染以稳定过表达人icos)测试实例3或6中制备的几种双特异性肿瘤靶向icos抗原结合分子的结合。[0822]简言之，收获悬浮细胞，计数，检查存活性，并在facs缓冲液(含0.1％bsa的pbs)中以每ml1百万个细胞的速度重新悬浮。将100μl细胞悬液(含10万个细胞)在圆底96孔板中于4℃在抗icos浓度增加(7pm-120nm)的情况下孵育30min，用0.1％bsa的冷pbs洗涤细胞两次，用标记的二抗(fabfcy特异性af647(1:100)，190-606-008jacksonimmunoresearch)于4℃再孵育30min，并用0.1％bsa的冷pbs洗涤两次。使用每孔75μlfacs缓冲液中的1％pfa将染色在4℃黑暗条件下固定20min。[0823]使用facsfortessa(软件facsdiva)通过facs分析荧光。使用graphpadprism7获得了结合曲线和ec50值。[0824]结果表明，双特异性icos抗原结合分子能够以浓度依赖性方式与人icos结合(图6a)。ec50值示出于表44中。观察到分子15的结合最好。此外，结果表明图1a至图1c所示的三种不同形式的结合等级，显示出与1 1形式(图6b)相比，2 1形式(图1c)的结合是优异的，正如预期的那样，这是由于与icos的二价结合优于单价结合。[0825]表44：不同肿瘤靶向抗icos分子与icos cho细胞结合的ec50值[0826]分子ec50[pm]分子151123分子195444分子222186分子92718分子1041710分子114169[0827]此外，相同分子与人nih/3t3-hufap克隆19细胞(亲代细胞系atcc#ccl-92，经修饰以稳定过表达人fap)的结合以与上述相同的方式进行。[0828]结果表明，双特异性肿瘤靶向icos抗原结合分子能够以浓度依赖性方式与人fap结合(图7a)。ec50值示出于表45中。分子9、15、19和22表现出非常相似的结合。另一方面，结果表明，与2 1(图1c)和1 1ht形式(图1b)相比，1 1分子形式(图1a)的结合更好(见图7b)。这可能是由vh-vl与fab融合时fap靶向部分的不同结合亲和力驱动的。[0829]表45：不同肿瘤靶向抗icos分子与fap nih/3t3-hufap克隆19结合的ec50值[0830]分子ec50[pm]分子152967分子196155分子224680分子95730分子101403分子111154[0831]此外，在预活化的食蟹猴pbmc上评估了相同分子与食蟹猴icos的结合。[0832]简言之，根据制造商的说明，使用dynabeadstm人t活化剂cd3/cd28(thermofischer#11131d)将食蟹猴pbmc活化48小时，并在37℃储存在加湿培养箱中的含10％fcs和1％glutamax(gibco35050061)的rpmi1640培养基中，直至进行后续的结合实验，如上所述。[0833]结果显示，肿瘤靶向icos抗原结合分子能够以浓度依赖性方式与食蟹猴icos结合(图8a及图8b)。ec50值示出于表46中。观察到分子15与cd4 和cd8 t细胞亚群的结合最好。[0834]表46：不同双特异性肿瘤靶向抗icos分子与食蟹猴pbmc结合的ec50值[0835][0836][0837]比较图1a、图1b和图1c中描述的形式与食蟹猴icos结合的能力，证明图1c中描述的形式与icos的二价结合优于图1a和图1b中描述的形式的单价结合(图8c和图8d以及表47)。[0838]表47：不同形式的双特异性肿瘤靶向抗icos分子与食蟹猴pbmc结合的ec50值[0839][0840]此外，使用鼠脾细胞评估小鼠交叉反应分子9、10和11与鼠icos的结合，对上述方案进行以下改变：将c57bl/6小鼠或hcea(ho)tg小鼠的brspleen转移到gentlemacsc管(miltenyi)中，并向每个管中加入macs缓冲液(pbs 0.5％bsa 2mmedta)。使用gentlemacs解离仪解离脾，快速旋转试管，并使细胞通过100μm尼龙细胞过滤网。此后，用3mlrpmi1640培养基(sigma,cat.-no.r7388)冲洗试管并在350×g下离心分离8分钟。弃去上清液，使细胞悬液通过70μm尼龙细胞过滤网并用培养基洗涤。再次离心分离(350xg,8min)后，弃去上清液，并加入5mlack裂解缓冲液。室温孵育5分钟后，用rpmi培养基洗涤细胞。然后，将细胞重新悬浮，并将沉淀球粒汇集在测定培养基(rpmi1640,2％fbs,1％glutamax)中，用于细胞计数(vi-细胞设置白细胞，1:10稀释)。然后，用pha-l(sigma#,2μg/ml)和il-2(proleukin,novartis；200u/ml)预活化脾细胞48小时以上调鼠icos的表达，然后用于随后的结合实验，如上所述。[0841]结果表明，这些分子能够以浓度依赖性方式与鼠icos结合(图9a)。ec50值示出于表48中。同样，与2 1和1 1ht形式相比，2 1形式显示出与鼠icos的结合使优异的，而1 1形式显示出优于鼠fap的结合是优异的(图9b)。[0842]表48：不同肿瘤靶向抗icos分子与鼠脾细胞结合的ec50值[0843][0844]在实例3.4和3.5中制备并在图1d和图1e中描述的另一组双特异性肿瘤靶向抗icos分子的形式，除了将预活化的人pbmc用作与人icos结合的靶细胞的修饰之外，如上所述测试了它们与人icos和人fap的结合特性。[0845]简言之，外周血单核细胞(pbmc)是通过对从血沉棕黄层(“blutspendezürich”)获得的肝素化血液的富集淋巴细胞制剂进行histopaque(sigma-aldrich,catno.10771-500mlhistopaque-1077)密度离心制备的。用无菌dpbs以1:2稀释血液，并在histopaque梯度(sigma,#h8889)上分层。离心分离(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含pbmc间期以上的血浆，并将pbmc转移到新的falcon管中，随后用50mlpbs填充。将混合物离心分离(400xg，10分钟，室温)，弃去上清液，并且用无菌pbs洗涤pbmc沉淀球粒两次(离心分离步骤350xg，10分钟)。自动计数(cedexhires)得到的pbmc种群，并将其储存在含有10％fcs和1％glutamax(gibco35050061)的rpmi1640培养基中。使用pha-l(sigma#,2μg/ml)和il-2(proleukin,novartis；200u/ml)预活化pbmc48h，以在37℃、加湿培养箱中上调人icos的表达。孵育后，pbmc用于随后的结合实验，如上所述。[0846]结果显示，双特异性fap靶向icos分子能够以浓度依赖性方式结合人icos和人fap(图10a至图10c)。ec50值示出于表49中。分子12和13在cd4 和cd8 t细胞亚群形式上均表现出与人icos的优异结合(图10a和图10b)。另一方面，分子13与人fap的结合较差(图10c)。[0847]表49：不同fap靶向抗icos分子与fap nih/3t3-hufapcl.19细胞或人pbmc的预活化cd4 和cd8 亚群结合的ec50值[0848][0849]此外，fap靶向icos分子40、15、44、21和22与sr细胞上的icos以及与fap nih/3t3-hufapcl.19细胞结合在进一步的实验中进行了测试(见图12a和图12b)。数据示出于下表49a中。[0850]表49a：不同fap靶向抗icos分子与sr细胞上的icos以及与fap nih/3t3-hufapcl.19细胞结合的ec50值[0851]分子sr细胞上的人icos人fapec50[pm]ec50[pm]分子401.743.85分子151.391.98分子442.174.34分子210.575.01分子221.173.24[0852]在实例6中制备的另一组肿瘤靶向抗icos分子(靶向cea而不是fap)如上所述测试它们与人icos和人cea的结合特性。如前所述，在预活化的人pbmc上测试与人icos的结合。使用mkn-45细胞(人胃腺癌细胞系，dsmzacc409)评估与cea的结合。[0853]结果表明，cea靶向双特异性icos分子能够以浓度依赖性方式结合人icos和人cea(图11a至图11c)。分子42表现出与人icos的优异结合(图11a和图11b)，而所有三种分子都显示出与人cea的相当结合(图13c)。[0854]7.5在肿瘤靶向icos抗原结合分子存在情况下，tcb介导的t细胞活化增加(流式细胞术分析)[0855]在cea阳性的mkn-45和fap表达nih/3t3-hufap克隆19细胞(atcc，ccl-92，转染后稳定过表达人fap)以及人pbmc的共培养测定中，评估了fap靶向或cea靶向双特异性激动性icos分子进一步促进ceacam5-tcb介导的t细胞活化的能力。[0856]简言之，在实验前一天，用细胞解离缓冲液收获贴壁靶细胞，并在平底96孔板中以10000个细胞/孔的密度铺板(gibco,13151014)。由此，使用5000rad(无滤光片照射，5级)x射线照射器rs2000(rad源)，在平板培养前对nih/3t3-hufap克隆19细胞进行额外照射。让靶细胞粘附过夜。通过对来自血沉棕黄层(“blutspendezürich”)的富集淋巴细胞制剂进行histopaque(sigma-aldrich,catno.10771-500mlhistopaque-1077)密度离心分离制备外周血单核细胞(pbmc)，用无菌dpbs以1:2稀释血液，并在histopaque梯度(sigma,#h8889)上分层。离心分离(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含pbmc间期以上的血浆，并将pbmc转移到新的falcon管中，随后用50mlpbs填充。将混合物离心分离(400xg，10分钟，室温)，弃去上清液，并且用无菌pbs洗涤pbmc沉淀球粒两次(离心分离步骤350xg，10分钟)。自动计数得到的pbmc种群(cedexhires)，并在37℃储存在加湿培养箱中的含有10％fcs和1％glutamax(gibco35050061)的rpmi1640培养基中，直至测定开始。[0857]在80pmceacam5-tcb的固定浓度且fap或cea靶向icos分子浓度增加(三份均为0.11pm-5000pm)存在的情况下，向靶细胞和成纤维细胞中加入pbmc，以获得5:1:1的最终e:t比。在37℃、5％co2下孵育48小时后，使用识别t细胞活化标记cd69(早期活化标记)和cd25(晚期活化标记)的抗体，通过流式细胞术分析评估t细胞活化。[0858]简言之，以400xg离心分离pbmc4min，并用含0.1％bsa的pbs(facs缓冲液)洗涤两次。根据供应商的说明对cd8(percp/cy5.5抗人cd8a，biolegend#301032)、cd4(apc/cy7抗人cd4，biolegend#300518)、cd69(bv421抗人cd69，biolegend#310930)、cd25(pe抗人cd25，biolegend#356104)进行表面染色。然后用含0.1％bsa的150μl/孔pbs洗涤细胞两次，并用含1％pfa的75μl/孔facs缓冲液在4℃固定15-30min。离心分离后，将样品重悬于150μlfacs缓冲液中。使用facsfortessa(软件facsdiva)通过facs分析荧光。使用graphpadprism7获得图表。[0859]如上所述，在多达五个pbmc供体上比较了实例3中制备的几种fap-icos分子的激动活性(图12c)。结果表明，分子44及其变体分子21和22的活性相当，并且分子15(分子40的变体)的活性略微降低。[0860]在另一个实例中，在三个如上所述的pbmc供体(图13a和图13b)上比较了选定fap-icos分子的激动活性，除了以下修改：使用5pm的mcsptcb来替换80pmceacam5tcb，结合用mcsp 和fap mv-3细胞(保藏号cvcl_w280)替换细胞系，效应器与靶标比为5:1(每孔50'000个效应器和10'000个靶细胞)。[0861]所有测试的fap-icos分子都能够促进tcb介导的t细胞活化(图13a)。观察到分子19的活化最强。当比较三种不同形式的fap-icos时，图1c中描述的形式诱导了最强的活化(图13b)。[0862]在另一项测定中，对图1a、图1d和图1e中所述的形式进行了比较，如上文对两个健康的pbmc供体所述(图14a至图14c)。[0863]结果表明，与单独tcb治疗相比，所有三种形式均可诱导额外的t细胞活化。在测试的三种形式之间未发现最大激动活性的差异(图14c)。然而，三种形式在不同浓度下达到其最大激动活性，等级(从低到高)为图1a》图1e》图1d。[0864]为了评估将tcb和肿瘤靶向icos分子靶向相同靶细胞(“顺式设置”)或两种不同细胞(“反式设置”)的差异，在上述测定中，在两个健康的pbmc供体上测试了靶向fap(反式设置)或cea(顺式设置)的两种icos分子(图15a至图15c)。[0865]结果表明cea靶向分子41的总体激动活性更高(图15c)。然而，fap靶向分子10似乎在较低浓度下达到其最大激动活性(图15a至图15b)。[0866]此外，如前所述，使用nih/3t3-hufap克隆19、mkn-45细胞作为靶标和80pmceacam5tcb作为第一刺激，在三个pbmc供体上测试了一组cea-icos分子。[0867]结果表明，与单独使用tcb刺激相比，所有三种测试分子都能够进一步促进t细胞活化(图16a至图16c)。分子42表现出最高的附加刺激。[0868]实例8[0869]t细胞双特异性(tcb)抗体的制备、纯化和表征[0870]4.1用人或人源化结合物制备tcb抗体[0871]根据wo2014/131712a1或wo2016/079076a1中描述的方法制备了tcb分子。[0872]在实验中使用的抗cea/抗cd3双特异性抗体(ceacd3tcb或ceatcb)的制备描述于wo2014/131712a1的实例3中。ceacd3tcb是“2 1iggcrossfab”抗体并且包括两条不同的重链和两条不同的轻链。引入ch3结构域中的点突变(“突起入孔”)以促进两条不同重链的组装。进行cd3结合fab中的vh和vl结构域的交换，以便促进两条不同轻链的正确组装。2 1意指分子具有两个对于cea具有特异性的抗原结合结构域和一个对于cd3具有特异性的抗原结合结构域。ceacam5cd3tcb具有相同的形式，但是包含另一cea结合剂并且包含cd3结合剂的ch和cl结构域中的点突变，以便支持轻链的正确配对。[0873]ceacd3tcb包含seqidno:242、seqidno:243、seqidno:244和seqidno:245所示的氨基酸序列。ceacam5cdtcb包含seqidno:246、seqidno:247、seqidno:249和seqidno:249所示的氨基酸序列。[0874]4.22 1形式(对小鼠cea是二价的，而对于小鼠cd3为单价的)的抗cea/抗cd3t细胞双特异性抗体的制备[0875]制备了抗cea(ch1a1a98/992f1)/抗cd3(2c11)t细胞双特异性2 1替代分子，其由一个cd3-fab、以及两个cea-fab和一个fc结构域组成，其中所述两个cea-fab通过其c末端连接到所述fc部分的铰链区，并且其中cd3-fab通过其c末端连接到一个cea-fab的n末端。cd3结合部分是交叉fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变区或恒定区被交换。[0876]鼠替代分子的fc结构域是muigg1fc结构域，其中引入了ddkk突变以增强抗体fc异二聚体的形成，如尤其gunasekaran等人,j.biol.chem.2010,19637-19646所述。第一重链的fc部分包含突变lys392asp和lys409asp(称为fc-dd)，且第二重链的fc部分包含突变glu356lys和asp399lys(称为fc-kk)。根据kabateu索引编号。此外，根据例如baudino等人j.immunol.(2008),181,6664-6669或wo2016/030350a1中描述的方法，在重链的恒定区引入dapg突变以消除与小鼠fcγ受体的结合。简言之，在fc-dd和fc-kk重链的恒定区引入了asp265ala和pro329gly突变，以消除与fcγ受体的结合(根据kabateu索引编号；即d265a、p329g)。[0877]因此，抗cea(ch1a1a98/992f1)/抗cd3(2c11)t细胞双特异性2 1替代分子包含seqidno:250、seqidno:251、seqidno:252和seqidno:253的氨基酸序列。[0878]实例9[0879]肿瘤靶向icos抗原结合分子与ceacam5-tcb联合的体内功能表征9.1在nsg小鼠中单次注射后，双特异性fap-icos(1167)双特异性抗体的药代动力学概况[0880]向nsg小鼠注射单剂量2.5mg/kg的fap-icos分子。向所有小鼠静脉注射200μl适当的溶液。为了获得每200μl适量的化合物，用组氨酸缓冲液稀释贮备溶液(表50)。在10分钟、1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、72小时、96小时、6天、8天、10天和12天对每个时间点和组的三只小鼠进行放血。采用elisa法对血清样品中的注射用化合物进行分析。通过huicoselisa(通过人icos结合进行检测)进行分子检测。在每一步之后，将板洗涤三次，以除去未结合的物质。最后，通过加入abts底物溶液以形成有色反应产物，使过氧化物酶结合的复合物可视化。在405nm(参考波长为490nm)通过光度确定的反应产物的强度与血清样品中的分析物浓度成比例。结果(图17)表明所有分子的pk行为稳定，这表明后续疗效研究的时间表为每周一次。[0881]表50：测试组合物的描述[0882][0883][0884]9.2人源化小鼠中mkn45异种移植物中fap-icos抗体联合ceacam5-tcb的体内疗效研究[0885]此处描述的疗效研究旨在了解在完全人源化的nsg小鼠中，fap-icos分子联合ceacam5-tcb在肿瘤消退和immuno-pd方面的形式依赖性疗效。[0886]人mkn45细胞(人胃癌)最初获自atcc，并且扩增后保藏在glycart内部细胞库。细胞在含有10％fcs的dmem中于37℃、5％co2的水饱和气氛中培养。体外传代12用于皮下注射，存活率为97％。人成纤维细胞nih-3t3最初获自atcc，在rochenutley进行工程改造以表达人fap，并在含10％小牛血清、1x丙酮酸钠和1.5ug/ml嘌呤霉素的dmem中培养。克隆39以体外传代数18和98.2％的存活率使用。[0887]将混合有50微升matrigel的50微升细胞悬液(1x106mkn45细胞 1x1063t3-hufap)用22g至30g针头皮下注射到麻醉小鼠的侧面。[0888]根据规定指南(gv-solas；felasa；tierschg)，将实验开始时为4-5周龄的雌性nsg小鼠(jackson实验室)维持在不含特定病原体的条件下，日循环为12h光照/12h黑暗。实验研究方案经过地方政府的审查和批准(p2011/128)。到达之后，将动物维持一周以适应新环境并进行观察。定期进行连续健康状态监测。[0889]对雌性nsg小鼠i.p.注射15mg/kg的白消安，接着在一天后i.v.注射从脐带血中分离的1x105个人造血干细胞。在干细胞注射后第14-16周，对小鼠进行舌下放血并且通过流式细胞术针对成功的人源化对血液进行分析。将有效移植的小鼠根据它们的人t细胞频率随机化为不同的处理组。当时，小鼠被注射所述的肿瘤细胞和成纤维细胞s.c.(图18)，并且当肿瘤大小达到约250mm3(第23天)时，用化合物或组氨酸缓冲液(媒介物)每周处理一次。向所有小鼠静脉注射200μl适当的溶液。为了获得每200μl适量的化合物，在需要时用组氨酸缓冲液稀释贮备溶液(表51)。根据不同fap-icos分子的分子量(匹配的摩尔浓度，c、d、f组)调整其剂量。对于1 1形式，已使用了三个剂量(e-g组)。对于联合疗法(c-g组，图1)，fap-icos和ceacam5tcb构建体同时注射。使用卡尺每周测量肿瘤生长两次(图18)，并按下式计算肿瘤体积：[0890]tv：(w2/2)×l(w：宽度，l：长度)[0891]终止时(第50天)，处死小鼠，取出肿瘤和脾，称重，并通过胶原酶v和dna酶消化制备单细胞悬液，用于随后的facs分析。对单细胞进行人cd45、cd3、cd8、cd4、cd25、cd19和foxp3染色(细胞内)，并在facsfortessa下进行分析。[0892]将小片(30mg)肿瘤组织速冻，并分离出全蛋白。通过多重分析来分析蛋白质悬液的细胞因子含量。[0893]图19a至图19g示出摩尔浓度匹配的联合治疗组中的肿瘤生长动力学(平均值， sem)，以及每只小鼠的单个肿瘤生长和研究终止时的肿瘤重量。如本文所述，ceacam5tcb作为单一药剂，诱导的初始肿瘤生长抑制很少。然而，与所有fap-icos分子的联合显示出显著改善的肿瘤生长抑制，这也通过研究终止时的肿瘤重量得到反映(图19g)。有趣的是，研究终止时处死的动物的肿瘤immuno-pd数据(图20a至图20f)揭示，所有联合组中肿瘤内t和b细胞频率增加。在联合治疗中，肿瘤中t细胞浸润的增加使cd8/treg比向cd8细胞移动。终止时未在脾中检测到影响。然而，所用不同类型的双特异性fap-icos抗体之间在肿瘤生长和immunopd方面未观察到统计学差异。[0894]图21a至图21g示出1 1fap-icos形式的剂量应答组的肿瘤生长动力学(平均值， sem)，以及每只小鼠的单个肿瘤生长和研究终止时的肿瘤重量。不同剂量的肿瘤生长数据揭示，4和1mg/kg剂量的效应最强，而最高测试剂量10mg/kg的应答较弱。有趣的是，在研究终止时处死的动物的肿瘤immuno-pd数据(图22a至图22f)揭示，所有剂量的fap-icos1 1形式均增加了肿瘤内t和b细胞频率。在联合治疗中，肿瘤中t细胞浸润的增加使cd8/treg比向cd8细胞移动。在测试的最低剂量(1mg/kg)检测到最强的immuno-pd效应。[0895]此外，图23所示的全肿瘤蛋白裂解物的细胞因子/趋化因子分析揭示，与所有其他测试治疗组相比，在1 1形式的双特异性fap-icos抗体的剂量最低时，细胞因子/趋化因子的上调最强。[0896]表51：测试组合物的描述ligandforcd28inhuman.immunity.2011may27；34(5):729-40.[0921]young,m.r.i.,th17cellsinprotectionfromtumororpromotionoftumorprogression.jclincellimmunol.2016jun；7(3):431.[0922]yuraszecketal.,translationandclinicaldevelopmentofbispecifict-cellengagingantibodiesforcancertreatment.clinicalpharmacology&therapeutics2017,101.当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及新颖icos抗体和包含它们的肿瘤靶向激动性icos抗原结合分子，以及其作为免疫调节剂在癌症治疗中的用途。
背景技术：
：：2.调节免疫抑制性途径是近来癌症治疗的重大突破。靶向细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4，yervoy/伊匹单抗(ipilimumab))和程序性细胞死亡蛋白1(pd-1，opdivo/纳武单抗(nivolumab)或keytruda/派姆单抗(pembrolizumab))、相应的pd-l1(阿特珠单抗(atezolizumab))的检查点阻断抗体已展现出可接受的毒性、有希望的临床应答、持久的疾病控制和在多种肿瘤适应症患者中改善的存活。然而，只有少数患者对免疫检查点阻断(icb)疗法产生持久应答，其余患者表现为原发性或继发性抗药性，这表明显然需要调节其他途径，从而为更多患者提供存活益处。因此，需要联合策略来改善治疗效益。3.icos(cd278)是诱导性t细胞共刺激因子，并且属于b7/cd28/ctla-4免疫球蛋白超家族(hutloff,等人,nature1999,397)。其表达似乎主要局限于在nk细胞上仅存在微弱表达的t细胞(ogasawara等人,jimmunol.2002,169和未公布的使用人nk细胞的自有数据)。与在t细胞上进行组成型表达的cd28不同，icos几乎不在幼稚的th1和th2效应t细胞群体上表达(pauloscmetal.,scitranslmed2010,2)，而是在静息th17、t滤泡辅助细胞(tfh)和调节性t(treg)细胞上表达。然而，在先前抗原引发、相应的tcr/cd3-接合时，在所有t细胞亚群上均强烈诱导icos(wakamatsu等人,procnatalacadsciusa,2013,110)。4.通过icos途径进行的信号传导发生在其配体，所谓的icos-l(b7h、b7rp-1、cd275)结合时，其在b细胞、巨噬细胞、树突状细胞和经tnf-α处理的非免疫细胞上表达(simpson等人,currentopinioninimmunology2010,22)。cd28和ctla4的配体b7-1和b7-2两者都不能结合或活化icos。尽管如此，已显示出icos-l与cd28和ctla-4均弱结合(yao等人,immunity2011,34)。激活后，icos(二硫醚连接的同型二聚体)通过pi3k和akt途径来诱导信号。与cd28不同，icos具有独特的ymfmsh2结合基序，其招募与cd28招募的同种型相比脂质激酶活性更高的pi3k变体。因此，可以观察到磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸酯的大量产生以及伴随的akt信号传导的增加，表明icos在t细胞存活中的重要作用(simpson等人,currentopinioninimmunology2010,22)。5.如sharpe(immunolrev.,2009,229)所回顾的，icos/icos配体途径通过控制il-10产生tregs，在刺激效应t细胞应答、t依赖性b细胞应答和调节t细胞耐受性方面发挥关键作用。此外，icos对趋化因子(c-x-c基序)受体5(cxcr5) 滤泡辅助t细胞(tfh)，调节生发中心反应和体液免疫的独特t细胞亚群的产生也非常重要。最近在icos缺陷小鼠中的研究表明，icos可以调节白细胞介素-21(il-21)的产生，从而调节t辅助(th)17型(th17)细胞和tfh的扩增。在此背景下，icos被描述为使cd4t细胞向th1样th17表型双极化，这已表明与几种癌症适应症(包括黑素瘤、早期卵巢癌等)患者存活的改善相关(ritayoung,jclincellimmunol.2016,7)。6.icos缺陷小鼠显示出生发中心形成受损，并且il-10和il-17的产生减少，这在多种疾病模型(例如糖尿病(th1)、气道炎症(th2)和eae神经炎症模型(th17))中表现为自身免疫表型发育受损(warnatz等人,blood2006)。鉴于此，icos突变的人类常见变异型免疫缺陷病患者表现出严重的低丙球蛋白血症和b细胞稳态失调(sharpe,immunolrev.,2009,229)。要注意的是，通过icos受体进行的有效共刺激信号传导仅发生在接受同时发生的tcr激活信号的t细胞中(wakamatsu等人,procnatalacadsciusa,2013,110)。7.t细胞双特异性(tcb)分子是极好的免疫细胞接合物，因为它们绕过了相应t细胞受体识别mhci肽的需要，但会使多克隆t细胞能够对细胞表面肿瘤相关抗原产生应答(yuraszeck等人,clinicalpharmacology&therapeutics2017,101)。ceacd3tcb，抗cea/抗cd3双特异性抗体，是使免疫系统参与抗癌的研究性免疫球蛋白g1(igg1)t细胞双特异性抗体。它旨在通过同时与t细胞上的人cd3ε和各种癌细胞(包括crc(结直肠癌)、gc(胃癌)、nsclc(非小细胞肺癌)和bc(乳腺癌))表达的癌胚抗原(cea)结合，从而将t细胞重定向至肿瘤细胞。t细胞和肿瘤细胞的交联导致cd3/tcr下游信号传导，并且导致免疫突触的形成、t细胞活化、细胞毒性颗粒和其他细胞因子的分泌，从而最终导致肿瘤细胞的剂量和时间依赖性裂解。此外，认为ceacd3tcb用于增加t细胞浸润并产生高度发炎的肿瘤微环境，使其成为免疫检查点阻断疗法(icb)的理想组合伙伴，特别是对于因缺乏足够的内源性自适应和功能性免疫浸润而表现出原发性icb抗药性的肿瘤。然而，考虑到肿瘤微环境(tme)中功能失调的t细胞上存在几种共刺激受体(如4-1bb(cd137)、icos和ox40)的矛盾表达，通过阻断t细胞上的单个或多个抑制途径来关闭制动器可能还不够。已发现，当抗cea/抗cd3双特异性抗体(即ceatcb)与肿瘤靶向激动性icos抗原结合分子组合时，会实现更好的抗肿瘤效果。t细胞双特异性抗体向t细胞提供初始tcr激活信号传导，并且其后与肿瘤靶向激动性icos抗原结合分子的结合会进一步增强抗肿瘤t细胞免疫。8.对于icos，越来越多的文献主体实际上支持使cd278结合在cd4 和cd8 效应t细胞上具有抗肿瘤潜力这种观点。icos-icos-l信号传导的激活作为单一疗法以及在抗clta4治疗的背景下，在几种同系小鼠模型中诱导了有效的抗肿瘤应答，其中icos下游信号传导的激活显著增加了抗ctla4疗法的效力(fut等人,cancerres,2011,71和allison等人,wo2011/041613a2,2009)。来自接受抗ctla4抗体治疗的患者的新数据也表明，cd4和cd8t细胞上icos表达水平持续升高与肿瘤患者(如转移性黑素瘤、尿路上皮癌、乳腺癌或前列腺癌患者)的总体存活率改善相关(giacomo等人,cancerimmunolimmunother.2013,62；carthon等人,clincancerres.2010,16；vonderheide等人,clincancerres.2010,16；liakou等人,procnatlacadsciusa2008,105和vonderheide等人,clincancerres.2010,16)。因此，icos阳性t效应细胞被视为伊匹单抗应答的阳性预测生物标志物。目前在晚期非小细胞肺癌或尿路上皮癌患者中测试人源化抗icosigg1抗体jtx2011(vopratelimab)。其作用机制依赖于fcγ交联。最近，已开始进行ky1044(全人抗icosigg4抗体)与阿特珠单抗联合的临床试验(nct03829501)。然而，目前仍需要特别适合与其他治疗剂联合治疗以治疗疾病，特别是癌症的激动性icos抗原结合分子。技术实现要素：9.本发明涉及新颖icos抗体和激动性icos抗原结合分子，所述激动性icos抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与包含所述新颖icos抗体的icos特异性结合的抗原结合结构域。本发明还涉及这些新的激动性icos抗原结合分子及其与其它治疗剂，特别是t细胞活化抗cd3双特异性抗体联合的用途，特别是用于治疗或延缓癌症进展。已经发现，本文所述的联合疗法在诱导早期t细胞活化、t细胞增殖、诱导t记忆细胞以及最终抑制肿瘤生长和消除肿瘤细胞方面比单独用抗cd3双特异性抗体治疗更有效。10.在一个方面，本发明提供一种激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos抗原结合分子包含11.(a)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列；或者12.(b)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或者13.(c)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:24的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:25的氨基酸序列；或者14.(d)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:28的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:29的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:30的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:31的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:32的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:33的氨基酸序列。15.在进一步的方面，提供一种如上定义的激动性icos抗原结合分子，其进一步包含含有能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，所述fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，激动性icos抗原结合分子包含人igg1亚类的fc结构域，其包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。16.在另一个方面，本发明提供一种激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个能够与如前所定义的肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中所述肿瘤相关抗原选自由成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌胚抗原(cea)、叶酸受体α(folr1)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、表皮生长因子受体(egfr)、人表皮生长因子受体2(her2)和p95her2组成的组。17.在一个方面，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与如上定义的肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中所述能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是能够与癌胚抗原(cea)特异性结合的抗原结合结构域。在一个方面，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含18.(a)重链可变区(vhcea)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:52的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:53的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:54的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:55的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:56的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:57的氨基酸序列；或者(b)重链可变区(vhcea)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:60的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:61的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:62的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:63的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:64的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:65的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:60的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:61的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:62的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:63的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:64的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:65的氨基酸序列。19.在另一方面，提供一种如上定义的激动性icos抗原结合分子，其中能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含与seqidno:58的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含与seqidno:59的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者重链可变区(vhcea)，其包含与seqidno:68的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含与seqidno:69的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:58的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:59的氨基酸序列。更具体地，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列。20.在进一步的方面，提供一种根据权利要求1至3中任一项所述的激动性icos抗原结合分子，其中能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是能够与成纤维细胞活化蛋白(fap)特异性结合的抗原结合结构域。在一个方面，能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：(a)重链可变区(vhfap)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:36的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:37的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:38的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:39的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:40的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:41的氨基酸序列；或者21.(b)重链可变区(vhfap)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:44的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:45的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:46的no:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自小鼠免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:10的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:11的氨基酸序列。29.在另一方面，本发明提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:18的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:19的氨基酸序列。在另一方面，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:26的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:27的氨基酸序列。在再一方面，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:34的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:35的氨基酸序列。30.在一个方面，本发明提供一种如前所定义的激动性icos抗原结合分子，其包含31.(a)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，32.(b)一个能够与icos特异性结合的fab片段，以及33.(c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低所述抗原结合分子与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，激动性icos抗原结合分子包含人igg1亚类的fc结构域，其包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。34.在另一方面，本发明提供一种如前所定义的激动性icos抗原结合分子，其包含35.(a)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，36.(b)两个能够与icos特异性结合的fab片段，以及37.(c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低所述抗原结合分子与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，人igg1亚类的fc结构域包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。38.在特定方面，能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是crossfab片段。39.在进一步的方面，提供一种激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，其包含：(a)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列，或者40.(b)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或者41.(c)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:24的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:25的氨基酸序列；或者42.(d)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:28的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:29的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:30的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:31的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:32的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:33的氨基酸序列。43.在一个方面，激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，源自小鼠免疫并包含：重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列。在另一方面，激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，源自兔免疫，并包含:重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列,(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:24的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:25的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:28的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:29的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:30的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:31的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:32的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:33的氨基酸序列。44.在一个方面，提供一种激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，其包含45.(a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者46.(b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者47.(c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者48.(d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。49.在一个方面，激动性icos抗原结合分子是全长抗体。在另一方面，激动性icos抗原结合分子是fab或crossfab片段。在特定方面，激动性icos抗原结合分子是人源化抗体。50.根据本发明的另一方面，提供一种编码如前所述的激动性icos抗原结合分子或icos抗体的分离的核酸，所述激动性icos抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。本发明进一步提供一种载体，特别是表达载体，其包含本发明的分离的核酸；并且提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸或载体。在一些方面，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。51.在另一方面，提供一种产生如前所述的激动性icos抗原结合分子的方法，所述激动性icos抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，所述方法包括在适合于表达激动性icos抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从宿主细胞中回收抗原结合分子。本发明还包括通过本发明方法产生的本文所述的激动性icos抗原结合分子或icos抗体，所述激动性icos抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。52.本发明还提供一种药物组合物，其包含如前所述的激动性icos抗原结合分子和至少一种药用赋形剂，所述icos抗原结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。特别地，药物组合物用于治疗癌症。53.本发明还包括如前所述的包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子或包含激动性icos结合分子的药物组合物用作药物，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。54.在一个方面，提供一种如前所述的包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子或包含激动性icos结合分子的药物组合物，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，用于55.(i)刺激t细胞应答，56.(ii)支持活化t细胞的存活，57.(iii)治疗感染，58.(iv)治疗癌症，59.(v)延缓癌症进展，或60.(vi)延长癌症患者的存活期，61.在具体方面，提供一种如前所述的包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子或如前所述包含激动性icos结合分子的药物组合物，用于治疗癌症，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。62.在另一个具体方面，本发明提供如前所述如本文所述包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子用于治疗癌症，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的所述激动性icos结合分子用于与化疗剂、放射疗法和/或用于癌症免疫疗法的其他试剂联合施用。63.在一个方面，提供如前所述包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子用于治疗癌症，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的所述激动性icos抗原结合分子用于与t细胞活化抗cd3双特异性抗体联合施用。特别地，t细胞活化抗cd3双特异性抗体是抗cea/抗cd3双特异性抗体。64.在进一步的方面，提供如前所述包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子用于治疗癌症，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的所述激动性icos抗原结合分子用于与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂联合施用。在一个方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体或抗pd1抗体。更特别地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂选自由阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗和纳武单抗组成的组。在一个具体方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为阿特珠单抗。65.在进一步的方面，本发明提供一种抑制个体中的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如前所述的激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域；或如前所述包含激动性icos抗原结合分子的药物组合物，所述激动性icos抗原结合分子包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域，以抑制肿瘤细胞的生长。在另一方面，本发明提供一种治疗个体癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的如前所述的激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域。66.还提供如前所述包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos抗原结合分子在制造用于治疗有需要的个体的疾病的药物中的用途，特别是在制造用于治疗癌症的药物中的用途。在上述方面中的任何方面，个体为哺乳动物，特别是人。附图说明67.图1a–1h：双特异性激动性icos抗原结合分子示意图。在图1a和图1b中，显示1 1形式的不同类型的fap-icos双特异性抗体(1 1表示与icos以及与fap的单价结合)。图1b中显示的形式也被命名为1 1头至尾。图1c示出2 1形式的fap-icos抗体(对于肿瘤相关靶而言是单价的)，其中fap的vh和vl结构域各自结合到每个fc结构域的c末端，并且在图1d和图1e中，示出两种不同类型的2 1形式，其中包含fap抗原结合结构域的fab结构域与icosigg的fab结构域融合(图1d)，或者其中一个icosfab结构域与fapfab结构域的n末端融合(反向，图1e)。图1f、图1g和图1h示出1 1形式的不同类型的cea-icos双特异性抗体。68.图2a和图2b：所有选定亲本前导克隆作为iggsvsjmab136igg(分子1)与在cho-huicos细胞或sr细胞上表达的icos的结合。图2a示出剂量应答曲线，其示出icos抗体与重组cho细胞上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图2b示出剂量应答曲线，其示出icos抗体与sr细胞上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。被测克隆是icos(009)(分子14)、icos1138(分子18)、1143(分子20)和1167(分子8)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。69.图3a、图3b及图3c：前导克隆009v1、1143v2和1138的选定人源化变体分别与人icos的结合。图中示出剂量应答曲线，其示出三种不同的aicos分子的人源化变体与重组cho细胞上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。70.图4：根据所有选定亲本前导克隆作为iggsvsjmab136的jurkat-nfat测定得到的剂量应答曲线。71.图5a至图5c：根据分别针对前导克隆009v1、1143v2和1138(作为igg)的人源化变体的jurkat-nfat报告测定得到的剂量应答曲线。示出剂量应答曲线，其示出用增加剂量的三种不同aicos分子的人源化变体处理的jurkat-nfat细胞的剂量依赖性活化的每秒计数(cps)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。72.图6a和图6b：双特异性fap-icos抗原结合分子与huicos的结合。图6a示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与重组cho上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。比较2 1形式的双特异性抗体与不同的icos克隆009v1(分子15)、1138(分子19)、1143v2(分子22)和1167(分子9)。图6b示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与重组cho细胞上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。比较包含icos克隆1167的不同形式：分子9(2 1，见图1c)、分子10(1 1，见图1a)和分子11(1 1_ht，见图1b)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。73.图7a和图7b：双特异性fap-icos抗原结合分子与hufap(nih3t3-hfap)的结合。图7a示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与重组3t3-hufap克隆19细胞上的人fap的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。比较2 1形式的双特异性抗体与不同的icos克隆009v1(分子15)、1138(分子19)、1143v2(分子22)和1167(分子9)。图7b示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与重组3t3-hufap克隆19细胞上的人fap的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。比较包含icos克隆1167的不同形式：分子9(2 1，见图1c)、分子10(1 1，见图1a)和分子11(1 1_ht，见图1b)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。74.图8a和图8b：双特异性fap-icos抗原结合分子与活化的pbmc上的食蟹猴icos的结合。示出剂量应答曲线，其示出包含不同icos克隆009v1(分子15)、1138(分子19)、1143v2(分子22)、1167(分子9)和jmab136(分子2)的fap-icos分子的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图8a和图8b分别示出cd4 和cd8 亚群上的结合。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。75.图8c及图8d：双特异性fap-icos抗原结合分子与活化的pbmc上的食蟹猴icos的结合。示出剂量应答曲线，其示出包含含有icos克隆1167的以下不同形式的fap-icos分子的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)：分子9(2 1，见图1c)、分子10(1 1，见图1a)和分子11(1 1_ht)。图8c和图8d分别示出cd4 和cd8 亚群上的结合。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。76.图9a和图9b：双特异性fap-icos抗原结合分子与重组cho细胞上的鼠icos的结合。图9a中示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与鼠icos的剂量依赖性结合的icos 细胞(％)的频率。图9b示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与鼠fap的剂量依赖性结合的icos 细胞(％)的频率。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。提供包含icos克隆1167的以下不同形式的fap-icos分子的数据：分子9(2 1，见图1c)、分子10(1 1，见图1a)和分子11(1 1_ht)。77.图10a至图10c：包含克隆1167的双特异性fap-icos抗原结合分子与人icos(预活化的pbmc)和人fap(nih3t3-hfap)的结合。示出图1a的形式(分子10)、图1d(分子12)和图1e(分子13)的数据。图10a和图10b示出分别针对cd4 和cd8 亚群，fap-icos分子与活化的pbmc上的人icos的剂量依赖性结合。图10c示出剂量应答曲线，其示出fap-icos分子与重组3t3-hufap克隆19细胞上的人fap的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。78.图11a至图11c：双特异性cea-icos抗原结合分子与人icos(人pbmc的cd4和cd8亚群)和人cea(mkn-45)的结合。示出cea(a5h1el1d)-icos(1167)1 1(分子41)、cea(a5h1el1d)-icos(h009v1_2)(分子42)和cea(a5h1el1d)-icos(1143v2_1)(分子43)的数据。图11a和图11b示出剂量应答曲线，其示出cea-icos分子与人活化的pbmc(分别为cd4 和cd8 亚群)上的icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图11c示出剂量应答曲线，其示出cea-icos分子与mkn-45细胞上的人cea的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图表示出技术三次重复的平均值，误差条表示sd。79.图12a至图12c：选择双特异性形式的前导结合物的种系变体。测试克隆009和1143的不同种系变体作为2 1形式的双特异性fap-icos抗体(图1c)。图12a示出这些分子与在sr细胞上表达的icos的结合，剂量应答曲线示出icos抗体与sr细胞上的人icos的剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图121b示出双特异性fap-icos抗原结合分子与人fap(nih3t3-hfap)的结合。剂量应答曲线示出与重组3t3-hufap克隆19细胞上的人fap进行剂量依赖性结合的中位荧光强度(mfi)。图12c示出在初级pmbc测定中对前导克隆的种系变体的选择。每个点表示个体捐赠者。值表示在整个浓度范围内cd4 t细胞上mficd69的最大值。80.图13a和图13b：在双特异性fap-icos抗原结合分子存在的情况下，tcb介导的t细胞活化增加。示出在5pmmcsptcb存在且fap-icos的浓度增加的情况下，人pbmc效应子、mv3肿瘤细胞以5:1的e:t共孵育48小时后，cd25阳性cd4 t细胞的中位荧光强度(mfi)。图表示出每个分子的三个供体的最大应答。图13a示出不同icos克隆的比较。图13b示出包括克隆1167的不同形式的比较。81.图14a至图14c：在双特异性fap-icos抗原结合分子存在的情况下，tcb介导的t细胞活化增加。示出在80pmceacam5tcb存在且fap-icos浓度增加的情况下，人pbmc效应子、mkn-45肿瘤细胞和nih/3t3-hufap克隆19以5:1:1的e:t共孵育48小时后，cd69阳性cd4 t细胞的中位荧光强度(mfi)。图14a和图14b示出两个供体的剂量应答图表。点表示技术三次重复的平均值，误差条表示sd。图14c示出每个分子的两个供体的最大应答。每个点表示技术三次重复的平均值。82.图15a至图15c：在双特异性cea-icos抗原结合分子存在的情况下，与fap-icos相比，tcb介导的t细胞活化增加。示出在80pmceacam5tcb存在且fap-icos的浓度增加的情况下，人pbmc效应子、mkn-45肿瘤细胞和nih/3t3-hufap克隆19以5:1:1的e:t共孵育48小时后，cd69阳性cd4 t细胞的中位荧光强度(mfi)。图15a和图15b示出两个供体的剂量应答图表。点表示技术三次重复的平均值，误差条表示sd。图15c图表示出每个分子的两个供体的最大应答。每个点表示技术三次重复的平均值。83.图16a至图16c：在双特异性cea-icos抗原结合分子存在的情况下，tcb介导的t细胞活化增加。示出在80pmceacam5tcb存在且cea-icos的浓度增加的情况下，人pbmc效应子、mkn-45肿瘤细胞和nih/3t3-hufap克隆19以5:1:1的e:t共孵育48小时后，cd69阳性cd4 t细胞的中位荧光强度(mfi)。图16a和图16b示出两个供体的剂量应答图表。点表示技术三次重复的平均值，误差条表示sd。图16c图表示出每个分子的三个供体的最大应答。每个点表示技术三次重复的平均值。84.图17：在nsg小鼠中单次注射后包含icos克隆1167的三种双特异性fap-icos抗原结合分子(不同形式)的药代动力学曲线(实例9.1)85.图18：在人源化小鼠中的mkn45异种移植物中使用三种双特异性fap-icos抗原结合分子联合ceacam5tcb的疗效研究的研究设计和治疗组(实例9.2)。86.图19a至图19g：在人源化小鼠中的mkn45异种移植物中以相同剂量进行不同形式的fap-icos和ceacam5tcb联合用药的疗效研究。示出在y轴上绘制的平均肿瘤体积(图19f)或单个小鼠中的肿瘤生长(图19a至图19e)。图19g总结绘制的单个小鼠第50天的肿瘤重量。可以看出，在所有fap-icos分子存在的情况下，tcb介导的肿瘤消退增加。87.图20a至图20f：在人源化小鼠中的mkn45异种移植物中以相同剂量进行不同形式的fap-icos和ceacam5tcb联合用药的疗效研究。示出肿瘤和脾中的immunopd数据。88.图21a至图21g：在人源化小鼠中的mkn45异种移植物中以不同剂量进行1 1形式的fap-icos分子和ceacam5tcb联合用药的剂量应答研究。示出在y轴上绘制的平均肿瘤体积(图21f)或单个小鼠中的肿瘤生长(图21a至图21e)。图21g总结绘制的单个小鼠第50天的肿瘤重量。可以看出，在最低剂量的fap-icos存在的情况下，tcb介导的肿瘤消退增加。89.图22a至图22f：在人源化小鼠中的mkn45异种移植物中以不同剂量进行的具有1 1形式的fap-icos分子的fap-icos和ceacam5tcb联合用药的剂量应答研究。示出肿瘤和脾中的immunopd数据。90.图23：细胞因子分析。在人源化nsg小鼠中的mkn45和3t3-hfap细胞共移植模型中，用不同剂量的fap-icos和ceacam5-tcb联合疗法后选定趋化因子和细胞因子表达的瘤内变化。具体实施方式91.定义92.除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。93.如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的示例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。94.如本文所用，术语“与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域”或“能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域”或“能够与肿瘤相关抗原特异性结合的部分”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合结构域能够通过其靶细胞抗原活化信号传导。在一个特定方面，抗原结合结构域能够将与其连接的实体(例如icos激动剂)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的抗体及其片段。另外，能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如基于设计的重复序列蛋白或设计的重复序列结构域的结合结构域(参见例如wo2002/020565)。95.关于抗体或其片段，术语“能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域”是指分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并且与之互补的区域。可通过例如一种或多种抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供能够特异性抗原结合的抗原结合结构域。具体地，能够特异性抗原结合的抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。在另一方面，“能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域”也可以是fab片段或交叉fab片段。96.本文的术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。97.如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。98.如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合到至少两种独特的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。99.本技术中所用的术语“价态”表示在对一种独特抗原决定簇具有特异性的抗原结合分子中存在特定数量的对一种独特抗原决定簇具有特异性的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在对特定抗原决定簇具有特异性的两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在本发明的特定方面，根据本发明的双特异性抗原结合分子对特定抗原决定簇可以是单价的，意味着它们对所述抗原决定簇仅具有一个结合位点，或者对特定抗原决定簇可以是二价或四价的，意味着它们对所述抗原决定簇分别具有两个结合位点或四个结合位点。100.术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其包含通过二硫键键合的两条轻链和两条重链。从n-末端到c-末端，每条重链具有可变区(vh)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3)(也称为重链恒定区)。类似地，从n-末端到c-末端，每条轻链具有可变区(vl)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是轻链恒定结构域(cl)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，所述五种类型被称为α(iga)、δ(igd)、ε(ige)、γ(igg)或μ(igm)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(igg1)、γ2(igg2)、γ3(igg3)、γ4(igg4)、α1(iga1)和α2(iga2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。[0101]“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、交叉fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见hudson等人，natmed9,129-134(2003)。关于scfv片段的综述，参见例如plückthun在theharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)中所述；还可参见wo93/16185；以及美国专利5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的fab片段和f(ab')2片段的讨论，参见美国专利5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等人，natmed9,129-134(2003)；以及hollinger等人，procnatlacadsciusa90,6444-6448(1993)。在hudson等人，natmed9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(domantis,inc.，waltham，ma；参见例如美国专利6,248,516b1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。[0102]木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。因此，如本文所用，术语“fab片段”是指包含轻链片段以及重链的vh结构域和第一恒定结构域(ch1)的抗体片段，所述轻链片段包含vl结构域和轻链恒定结构域(cl)。fab'片段与fab片段的不同之处在于fab'片段在重链ch1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab’‑sh是fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点(两个fab片段)和fc区的一部分。[0103]术语“交叉fab片段”或“xfab片段”或“交换型fab片段”是指这样的fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交换型fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一个方面，fab重链和轻链的可变区被交换，即交换型fab分子包含含有轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)的肽链，以及含有重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)的肽链。该交换型fab分子也称为crossfab(vlvh)。在另一个方面，当fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换型fab分子包含含有重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)的肽链，以及含有轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)的肽链。该交换型fab分子也称为crossfab(clch1)。[0104]“单链fab片段”或“scfab”是由抗体重链可变结构域(vh)、抗体恒定结构域1(ch1)、抗体轻链可变结构域(vl)、抗体轻链恒定结构域(cl)和连接基组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述连接基在n-末端至c-末端方向上具有以下顺序中的一种：a)vh-ch1-连接基-vl-cl，b)vl-cl-连接基-vh-ch1，c)vh-cl-连接基-vl-ch1，或d)vl-ch1-连接基-vh-cl；并且其中所述连接基是至少30个氨基酸，优选是32个至50个氨基酸的多肽。所述单链fab片段经由cl结构域与ch1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链fab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。[0105]“交换型单链fab片段”或“x-scfab”是由抗体重链可变结构域(vh)、抗体恒定结构域1(ch1)、抗体轻链可变结构域(vl)、抗体轻链恒定结构域(cl)和连接基组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述连接基在n末端至c末端方向上具有以下顺序中的一种：a)vh-cl-连接基-vl-ch1和b)vl-ch1-连接基-vh-cl；其中vh和vl一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中所述连接基是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scfab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。[0106]“单链可变片段(scfv)”是抗体的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的融合蛋白，通过10至约25个氨基酸的短连接基肽连接。连接基通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将vh的n末端与vl的c末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了连接基，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scfv抗体例如描述于houston,j.s.,methodsinenzymol.203(1991)46-96)中。另外，抗体片段包含单链多肽，所述单链多肽的特征在于具有vh结构域，即能够与vl结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有vl结构域的特征，即能够与vh结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。[0107]“支架抗原结合蛋白”是本领域已知的，例如纤连蛋白和设计的锚蛋白重复序列蛋白(darpin)已被用作抗原结合结构域的替代支架，参见例如gebauer和skerra，engineeredproteinscaffoldsasnext-generationantibodytherapeutics.curropinchembiol13:245-255(2009)和stumpp等人，darpins:anewgenerationofproteintherapeutics.drugdiscoverytoday13:695-701(2008)。在本发明的一个方面中，支架抗原结合蛋白选自由以下项组成的组：ctla-4(evibody)、脂质运载蛋白(anticalin)、蛋白a衍生的分子(诸如蛋白a的z结构域(亲和体))、a结构域(avimer/巨型抗体)、血清转铁蛋白(反式体)；设计的锚蛋白重复序列蛋白(darpin)、抗体轻链或重链的可变结构域(单结构域抗体，sdab)、抗体重链的可变结构域(纳米抗体，avh)、vnar片段、纤连蛋白(adnectin)、c型凝集素结构域(四连接素)；新抗原受体β-内酰胺酶的可变结构域(vnar片段)、人γ-晶体蛋白或泛素蛋白(affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、微型体(诸如来自knottin家族的蛋白质)、肽适体和纤连蛋白(adnectin)。ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4)是主要在cd4 t细胞上表达的cd28家族受体。其细胞外结构域具有可变结构域样ig折叠。对应于抗体cdr的环可以用异源序列取代，以赋予不同的结合性质。经工程化改造以具有不同结合特异性的ctla-4分子也称为evibody(例如us7166697b1)。evibody与抗体(例如结构域抗体)的分离的可变区大小大致相同。关于进一步的细节，参见journalofimmunologicalmethods248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是细胞外蛋白质家族，其运输小的疏水性分子，诸如类固醇、胆素、类维生素a和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端处具有许多环，可以工程化改造成与不同的靶抗原结合。anticalin的大小介于160-180个氨基酸之间，并且来源于脂质运载蛋白。关于进一步的细节，参见biochimbiophysacta1482:337-350(2000)、us7250297b1和us20070224633。亲和体是来源于金黄色酿脓葡萄球菌(staphylococcusaureus)的蛋白a的支架，其可以被工程化改造以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化形成了文库。关于进一步细节，参见proteineng.des.sel.2004,17,455-462和ep1641818a1。avimer是来源于a结构域支架家族的多结构域蛋白质。约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键键合结构。多样性是通过重组a结构域家族表现出的自然变异而形成的。关于进一步的细节，参见naturebiotechnology23(12),1556-1561(2005)和expertopiniononinvestigationaldrugs16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列来工程化改造转铁蛋白，以结合不同的靶抗原。工程化改造的转铁蛋白支架的示例包括反式体。关于进一步的细节，参见j.biol.chem274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复序列蛋白(darpin)来源于锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞支架的附接的蛋白质家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33残基基序。它们可通过随机化每个重复序列中的第一α-螺旋和β-转角中的残基，而工程化改造成结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(亲和力成熟方法)。关于进一步的细节，参见j.mol.biol.332,489-503(2003)、pnas100(4),1700-1705(2003)和j.mol.biol.369,1015-1028(2007)以及us20040132028a1。单结构域抗体是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。第一单结构域来源于骆驼科动物的抗体重链的可变结构域(纳米抗体或vhh片段)。此外，术语单结构域抗体包含自体人重链可变结构域(avh)或来源于鲨鱼的vnar片段。纤连蛋白可以经工程化改造以结合抗原的支架。adnectin由iii型人纤连蛋白(fn3)的15个重复单元的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。β-夹层的一个端部处的三个环可以经工程化改造，以使adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗靶标。关于进一步细节，参见proteineng.des.sel.18,435-444(2005)、us20080139791、wo2005056764和us6818418b1。肽适体是组合的识别分子，该组合的识别分子由恒定的支架蛋白，通常是硫氧还蛋白(trxa)组成，所述恒定的支架蛋白含有在活性位点处插入的受约束的可变肽环。关于进一步细节，参见expertopin.biol.ther.5,783-797(2005)。微型体来源于含有3-4个半胱氨酸桥、长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，所述微蛋白的示例包括kalatabi和芋螺毒素以及knottin。微蛋白具有环，其可以经工程化改造为包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠。关于工程化改造的knottin结构域的进一步细节，参见wo2008098796。[0108]作为参考分子的“结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中所述抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。[0109]术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原很大的情况下，抗原结合分子可以仅与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。[0110]如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ecm)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。[0111]“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(spr)技术(在biacore仪器上分析)(liljeblad等人，glycoj17,323-329(2000))以及传统的结合测定(heeley,endocrres28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过spr所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于所述抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子的解离常数(kd)为≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm或≤0.001nm(例如10-8m或更低，例如10-8m至10-13m，例如10-9m至10-13m)。[0112]“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以用解离常数(kd)表示，解离常数(kd)是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(spr)。[0113]如本文所用的“肿瘤相关抗原”或taa是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。在某些实施例中，靶细胞抗原为肿瘤细胞表面的抗原。在一个实施例中，taa选自由以下项组成的组：成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌胚抗原(cea)、叶酸受体α(folr1)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(mcsp)、表皮生长因子受体(egfr)、人表皮生长因子受体2(her2)和p95her2。特别是，肿瘤相关抗原是成纤维细胞活化蛋白(fap)或癌胚抗原(cea)。[0114]术语“成纤维细胞活化蛋白(fap)”也称为脯氨酰内肽酶fap或seprase(ec3.4.21)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然fap，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工fap，以及通过细胞中加工产生的任何形式的fap。该术语还涵盖fap的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，本发明的抗原结合分子能够特异性结合到人、小鼠和/或食蟹猴fap。人fap的氨基酸序列示出于uniprot(www.uniprot.org)登录号q12884(149版，seqidno:254)或ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov/)refseqnp_004451.2中。人fap的细胞外结构域(ecd)从26位的氨基酸延伸至760位的氨基酸。his标记的人fapecd的氨基酸序列示出于seqidno255中。小鼠fap的氨基酸序列示出于uniprot登录号p97321(126版，seqidno:256)或ncbirefseqnp_032012.1中。小鼠fap的细胞外结构域(ecd)从26位的氨基酸延伸至761位的氨基酸。seqidno257示出his标记的小鼠fapecd的氨基酸序列。seqidno258示出his标记的食蟹猴fapecd的氨基酸序列。优选地，本发明的抗fap结合分子结合到fap的细胞外结构域。[0115]术语“癌胚抗原(cea)”也称为癌胚抗原相关细胞粘附分子5(ceacam5)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然cea，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人cea的氨基酸序列示出于uniprot登录号p06731(151版，seqidno:259)中。长期以来，cea被鉴定为一种肿瘤相关的抗原(gold和freedman，jexpmed.，121:439-462，1965；berinsteinn.l.，jclinoncol.，20:2197-2207，2002)。cea最初被归类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现已在多种正常成人组织中鉴定出来。这些组织主要来源于上皮，包括胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的细胞以及结肠、子宫颈、汗腺和前列腺的细胞(nap等人，tumourbiol.，9(2-3):145-53，1988；nap等人，cancerres.，52(8):2329-23339，1992)。上皮来源的肿瘤及其转移均包含cea作为肿瘤相关抗原。cea本身的存在并不表示已转化为癌细胞，但cea的分布具有指示性。在正常组织中，cea通常在细胞顶面上表达(s.,semincancerbiol.9(2):67-81(1999))，使其无法被血流中的抗体吸收。与正常组织相比，cea倾向于在癌细胞的整个表面表达(s.,semincancerbiol.9(2):67-81(1999))。表达模式的这一变化使cea易于与癌细胞中的抗体结合。此外，cea在癌细胞中的表达增加。此外，cea表达的增加促进细胞间粘附的增加，其可能导致转移(marshallj.,seminoncol.,30(asuppl.8):30-6,2003)。cea在各种肿瘤实体中的表达普遍非常高。根据已发表的数据，自己在组织样品中实施的分析证实了cea的高发性，其中在大肠癌(crc)中的发生率为约95％，在胰腺癌中的发生率为90％，在胃癌中的发生率为80％，在非小细胞肺癌(nsclc，与her3共表达)中的发生率为60％，在乳腺癌中的发生率为40％；并且发现在小细胞肺癌和胶质母细胞瘤中的表达水平低。[0116]cea易于从细胞表面裂解，并且直接或通过淋巴管从肿瘤中流入血流中。由于这种特性，血清cea水平已被用作诊断癌症和筛查癌症(尤其是结直肠癌)复发的临床指标(goldenbergdm.，theinternationaljournalofbiologicalmarkers，7:183-188，1992；chaui.等人，jclinoncol.，22:1420-1429，2004；flamini等人，clincancerres；12(23):6985-6988，2006)。[0117]术语“folr1”是指叶酸受体α，并且已被确定为许多癌症的潜在预后和治疗靶点。除非另有说明，否则它是指来自任何脊椎动物来源的任何天然folr1，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人folr1的氨基酸序列如uniprot保藏号p15328(seqidno:260)所示，鼠folr1具有uniprot保藏号p35846(seqidno:261)的氨基酸序列，且食蟹猴folr1具有uniprot保藏号g7pr14(seqidno:262)的氨基酸序列。folr1是一种在细胞质膜上表达的n-糖基化蛋白。folr1对叶酸和几种还原的叶酸衍生物有很高的亲和力，并且介导生理性叶酸(5-甲基四氢叶酸)向细胞内部的递送。folr1是folr1引导的癌症治疗的理想靶点，因为它在绝大多数卵巢癌以及许多子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌和乳腺癌中过表达，而folr1在正常组织上的表达仅限于肾近端小管上皮细胞的顶端膜、肺的肺泡肺细胞、膀胱、睾丸、脉络丛和甲状腺。最近的研究发现，folr1在三阴性乳腺癌中的表达特别高(necela等人plosone2015,10(3),e0127133)。[0118]术语“黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(mcsp)”也称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然mcsp，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人mcsp的氨基酸序列示出于uniprot登录号q6uvk1(103版，seqidno:263)中。mcsp是一种高度糖基化的完整膜硫酸软骨素蛋白聚糖，由细胞膜上表达的n-连接的280kda糖蛋白组分和450kda硫酸软骨素蛋白聚糖组分组成(ross等人,arch.biochem.biophys.1983,225:370-38)。mcsp更广泛地分布在许多正常和转化的细胞中。特别是，mcsp几乎存在于表皮的所有基底细胞中。mcsp在黑素瘤细胞中被差异表达，并且在所分析的90％以上的良性痣和黑素瘤病变中均被表达。还发现mcsp在非黑素细胞来源的肿瘤(包括基底细胞癌、各种神经嵴来源的肿瘤)和乳腺癌中被表达。[0119]术语“表皮生长因子受体(egfr)”也称为原癌基因c-erbb-1或受体酪氨酸蛋白激酶erbb-1，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然egfr，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人egfr的氨基酸序列示出于uniprot登录号p00533(211版，seqidno:264)中。原癌基因“her2”(人表皮生长因子受体2)编码蛋白酪氨酸激酶(p185her2)，其与人表皮生长因子受体相关且有些同源。her2在本领域也称为c-erbb-2，并且有时称为大鼠同源物neu。her2的扩增和/或过表达与多种人类恶性肿瘤有关，并且似乎完整地参与25％-30％的人类乳腺癌和卵巢癌的进展。此外，扩增程度与观察到的中位患者存活期呈负相关(slamon,d.j.等人,science244:707-712(1989))。人her2的氨基酸序列示出于uniprot登录号p04626(230版，seqidno:265)中。本文使用的术语“p95her2”是指her2受体蛋白的羧基末端片段(ctf)，其也称为“611-ctf”或“100-115kdap95her2”。通过启动全长her2分子的密码子位置611处的her2mrna翻译，在细胞中产生p95her2片段(anido电容,emboj25；3234-44(2006))。它的分子量为100至115kda，并且在细胞膜上表达，其中它可形成由分子间二硫键维持的同型二聚体(pedersen等人,molcellbiol29,3319-31(2009))。人p95her2的示例性序列在seqidno:266中给出。[0120]除非另有说明，否则术语“icos”(诱导性t细胞共刺激因子)是指来自任何脊椎动物来源的任何诱导性t细胞共刺激蛋白，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。icos，也称为ailim或cd278，是cd28超家族(cd28/ctla-4细胞表面受体家族)的成员，并且在t细胞初始活化后在t细胞上被特异性表达。icos还在其他t细胞亚群(包括th1、th2和th17)的发育和功能中发挥作用。值得注意的是，icos共同刺激与th1和th2细胞相关联的t细胞增殖和细胞因子分泌。因此，icosko小鼠在各种疾病模型(包括糖尿病(th1)、气道炎症(th2)和eae神经炎症模型(th17))中表现出自身免疫表型发育受损。除了调节t效应(teff)细胞功能外，icos还调节t调节细胞(tregs)。icos在treg上高水平表达，并且与treg稳态和功能有关。激活后，icos(二硫醚连接的同型二聚体)通过pi3k和akt途径来诱导信号。随后的信号传导事件导致谱系特异性转录因子(如t-bet、gata-3)的表达，并且继而影响t细胞增殖和存活。该术语还涵盖icos的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。人icos的氨基酸序列示出于uniprot(www.uniprot.org)登录号q9y6w8(seqidno:1)中。[0121]如前所述，icosl配体(icos-l；b7-h2；b7rp-1；cd275；gl50)，也是b7超家族的成员，是icos的膜结合天然配体，并且在b细胞、巨噬细胞和树突状细胞的细胞表面上被表达。在它与icos相互作用时，icos-l在细胞表面上起非共价连接的同型二聚体的作用。还报告了人icos-l与人cd28和ctla-4结合(yao等人,2011,immunity,34:729-740)。huicos-l的胞外结构域的示例性氨基酸序列在seqidno:215中给出。[0122]术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为vh和vl)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(fr)和三个高变区(hvr)。参见例如，kindt等人，kubyimmunology，第6版，w.h.freemanandco.，第91页(2007)。单个vh或vl结构域可足以赋予抗原结合特异性。[0123]如本文所用的术语“高变区”或“hvr”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“cdr”)。[0124]通常，抗体包含六个cdr；三个在vh中(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)，并且三个在vl中的(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)。本文中的示例性cdr包括：[0125](a)在氨基酸残基26-32(l1)、50-52(l2)、91-96(l3)、26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)处发生的高可变环(chothia和lesk，j.mol.biol.196:901-917(1987))；[0126](b)存在于氨基酸残基24-34(l1)、50-56(l2)、89-97(l3)、31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)处的cdr(kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))；以及[0127](c)存在于氨基酸残基27c-36(l1)、46-55(l2)、89-96(l3)、30-35b(h1)、47-58(h2)和93-101(h3)处的抗原接触点(maccallum等人，j.mol.biol.262:732-745(1996))。[0128]除非另有说明，否则cdr根据kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域技术人员将理解，也可以根据chothia(同上)、mccallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定cdr名称。[0129]kabat等人定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将该“kabat编号”系统分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的ntkvdkkv(seqidno:267)的氨基酸序列。通常，具有epksc的氨基酸序列(seqidno:268)的片段跟随以连接ch1结构域与铰链区。[0138]术语“铰链区”表示抗体重链多肽的在野生型抗体重链中连接ch1结构域和ch2结构域的部分，例如根据kabat的eu编号系统从约216位至约230位，或根据kabat的eu编号系统从约226位至约230位。其他igg亚类的铰链区可以通过与igg1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定。铰链区通常是由两种氨基酸序列相同的多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含多达25个氨基酸残基，并且是柔性的，允许相关联靶结合位点独立移动。铰链区可细分为三个结构域：上铰链区、中铰链区和下铰链区(例如，参见roux,等人,j.immunol.161(1998)4083)。[0139]本文中的术语“fc结构域”或“fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链c末端区域。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。在一个方面，人igg重链fc结构域从cys226或从pro230或从ala231延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的c末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者所述抗体可以包括全长重链的切割变体。这可能是重链的最后两个c末端氨基酸为甘氨酸(g446)和赖氨酸(k447，根据eu索引)的情况。因此，fc区的c末端赖氨酸(lys447)或c末端甘氨酸(gly446)和赖氨酸(lys447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含fc区的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有c末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个方面，包括如本文所指定的fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的c末端甘氨酸-赖氨酸二肽(g446和k447，根据eu索引编号)。在一个方面，包括如本文所指定的fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，所述重链包含另外的c末端甘氨酸残基(g446，根据eu索引编号)。iggfc区包含iggch2结构域和iggch3结构域。[0140]人iggfc区的“ch2结构域”通常从约eu231位的氨基酸残基延伸至约eu340位的氨基酸残基(根据kabat的eu编号系统)。在一个方面，ch2结构域具有apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqestyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskak(seqidno:269)的氨基酸序列。ch2结构域的独特之处在于它与另一个结构域的配对不紧密。相反，两个n连接的支链碳水化合物链介于完整天然fc区的两个ch2结构域之间。据推测，碳水化合物可能为结构域-结构域配对提供替代物，并有助于稳定ch2结构域。burton,mol.immunol.22(1985)161-206。在一个方面中，碳水化合物链连接至ch2结构域。本文的ch2结构域可以是天然序列ch2结构域或变体ch2结构域。[0141]“ch3结构域”包括fc区中残基c末端至ch2结构域的延伸部分，表示大致从eu341位延伸至eu446位(根据kabat的eu编号系统)的抗体重链多肽部分。在一个方面，ch3结构域具有gqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seqidno:270)的氨基酸序列。本文的ch3区可以是天然序列ch3结构域或变体ch3结构域(例如在一条链中具有引入的“突起”(“杵”)而在另一条链中具有相应的引入的“空腔”(“臼”)的ch3结构域；参见以引用方式明确并入本文的美国专利号5,821,333)。此类变体ch3结构域可用于促进如本文所述的两条不相同的抗体重链的异二聚化。在一个实施例中，人igg重链fc区从cys226或从pro230延伸至重链的羧基末端。然而，fc区的c末端赖氨酸(lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据eu编号系统，eu编号系统也称为eu索引，如在kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中所述。[0142]“杵臼结构(knob-into-hole)”技术描述于例如us5,731,168；us7,695,936；ridgway等人，proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述突起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在一个具体实施例中，突起修饰包含fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代t366w，而孔修饰包含fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代t366s、l368a和y407v。在另一个具体实施例中，包含突起修饰的fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代s354c，而包含孔修饰的fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代y349c。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc区的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定化二聚体(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。[0143]“与免疫球蛋白的fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。例如，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的fc区的n-末端或c-末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。可以根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见例如bowie,j.u.等人，science247:1306-10(1990))。[0144]术语“效应子功能”是指可归因于抗体的fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)、fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如b细胞受体)，以及b细胞活化。[0145]fc受体结合依赖性效应子功能可通过抗体的fc区与fc受体(fcr)的相互作用来介导，fc受体是造血细胞上的特异性细胞表面受体。fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已被证明可通过吞噬免疫复合物来介导去除抗体包被的病原体，并且通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)来裂解涂有相应抗体的红细胞及其他各种细胞靶点(例如，肿瘤细胞)(参见例如vandewinkel,j.g.和anderson,c.l.，j.leukoc.biol.49(1991)511-524)。fcrs由其对免疫球蛋白同种型的特异性来限定：igg抗体的fc受体称为fcγr。fc受体结合描述于例如：ravetch,j.v.和kinet,j.p.，annu.修订版，immunol.9(1991)457-492；capel,p.j.等人，immunomethods4(1994)25-34；dehaas,m.等人，j.lab.clin.med.126(1995)330-341；以及gessner,j.e.等人，ann.hematol.76(1998)231-248。[0146]igg抗体(fcγr)fc区受体的交联触发多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞细胞毒性、炎症介质的释放以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。已在人体中鉴no:281)、ggsg(seqidno:282)、ggsgngsg(seqidno:283)、ggngsgsg(seqidno:284)和ggngsg(seqidno:285)。特定目标肽连接基为(g4s)(seqidno:271)、(g4s)2或ggggsggggs(seqidno:272)、(g4s)3(seqidno:276)和(g4s)4(seqidno:277)。[0155]如本技术中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、蛋氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)，以及缬氨酸(val，v)。[0156]“融合”或“连接”意指组分(例如多肽和所述tnf配体家族成员的胞外域)通过肽键、直接或经由一个或多个肽连接基连接。[0157]相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基并引入缺口(如果需要的话)以实现最大的序列同一性百分比后，并且在不将任何保守取代考虑为所述序列同一性的一部分的情况下，与所述参考多肽序列中的氨基酸残基相同的所述候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如blast、blast-2、align.sawi或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序align-2来生成氨基酸序列同一性％的值。align-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(genentech,inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到u.s.copyrightoffice,washingtond.c.,20559，在那里以美国版权登记号txu510087注册。align-2程序可从基因泰克公司(genentech,inc.,southsanfrancisco,california)公开获得，或者可以从所述源代码编译。align-2程序应经编译以在unix操作系统上使用，所述unix操作系统包括数字unixv4.0d。所有序列比较参数均由align-2程序设置并且不变。在采用align-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列a与给定氨基酸序列b的氨基酸序列同一性％(其可以另选地表达为给定氨基酸序列a具有或包含与给定氨基酸序列b的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：[0158]100乘以分数x/y[0159]其中x是由序列比对程序align-2在该程序对a和b的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中y是b中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，a与b的氨基酸序列同一性％将不等于b与a的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用align-2计算机程序获得的。[0160]在某些实施例中，考虑了本文提供的激动性icos结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善激动性icos结合分子的结合亲和力和/或其他生物特性。激动性icos结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码分子的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。用于取代诱变的感兴趣的位点包括hvr和框架(fr)。保守性取代在表b中表头“优选的取代”下提供，并在下文中参考氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可以将氨基酸取代引入感兴趣的分子中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的adcc或cdc)筛选。[0161]表a[0162][0163][0164]可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：[0165](1)疏水性；正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；[0166](2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；[0167](3)酸性：asp、glu；[0168](4)碱性：his、lys、arg；[0169](5)影响链取向的残基：gly，pro；[0170](6)芳族：trp、tyr、phe。[0171]非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。[0172]术语“氨基酸序列变体”包括实质性变体，其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸取代。通常，相对于亲本抗原结合分子，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简而言之，将一个或多个hvr残基突变并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个hvr内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的抗原结合能力即可。例如，可在hvr中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。另选地或另外地，利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。[0173]氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入的实例包括激动性icos结合分子，其n或c末端与多肽融合，这会增加激动性icos结合分子的血清半衰期。[0174]在某些实施例中，改变本文提供的激动性icos结合分子以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，从而便利地获得分子的糖基化变体。当激动性icos结合分子包含fc结构域时，与其连接的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过n-连接连接于fc区的ch2结构域的asn297。参见，例如，wright等人tibtech15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、n-乙酰基葡糖胺(glcnac)、半乳糖和唾液酸，以及连接于双触角寡糖结构的“茎”中的glcnac的岩藻糖。在一些实施例中，可以对激动性icos结合分子中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的变体。在一个方面，提供了激动性icos结合分子的变体，其具有缺乏连接(直接或间接)于fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。此类岩藻糖基化变体可具有改善的adcc功能，参见例如美国专利公开号us2003/0157108(presta,l.)或us2004/0093621(协和发酵工业株式会社(kyowahakkokogyoco.,ltd))。本发明的激动性icos结合分子的其他变体包括具有两分型寡糖的变体，例如其中与fc区连接的双触角寡糖是通过glcnac两分的。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能，参见例如wo2003/011878(jean-mairet等人)；美国专利号6,602,684(umana等人)；以及us2005/0123546(umana等人)。还提供了在附接于fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的cdc功能并描述于例如wo1997/30087(patel等人)；wo1998/58964(raju,s.)；以及wo1999/22764(raju,s.)中。[0175]在某些实施例中，可期望产生本发明的激动性icos结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体，例如“thiomab”，其中分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于分子的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或连接基-药物部分缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的v205(kabat编号)；重链的a118(eu编号)；以及重链fc区的s400(eu编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述形成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。[0176]在某些方面，可进一步修饰本文提供的激动性icos结合分子以使其含有本领域已知且易于获得的另外的非蛋白质性部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接于抗体的聚合物的数目可变化，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、双特异性抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。在另一方面，提供可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质性部分是碳纳米管(kam,n.w.等人，proc.natl.acad.sci.usa102(2005)11600-11605)。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害，但是将非蛋白质性部分加热至抗体-非蛋白质性部分附近的细胞被杀死的温度的波长。在另一方面，可以获得本文提供的激动性icos结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒性剂缀合的抗体。[0177]术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使rna(mrna)、病毒来源的rna或质粒dna(pdna)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(pna)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如dna或rna片段。[0178]关于“分离的”核酸分子或多核苷酸，是指已经从其天然环境中移除的核酸分子，dna或rna。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实施例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含在通常包含多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。分离的rna分子包括本发明的体内或体外rna转录物，以及正链和负链形式和双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。[0179]关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如align-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。[0180]术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体dna、质体dna、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。[0181]术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导所述基因的表达的dna分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mrna的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。[0182]术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如cho细胞、bhk细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、yo骨髓瘤细胞、p3x63小鼠骨髓瘤细胞、per细胞、per.c6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。[0183]药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。[0184]药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。[0185]“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。[0186]术语“药物组合物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用配制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。[0187]“药用赋形剂”是指药物组合物中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药用赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。[0188]术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。[0189]如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。[0190]如本文所用的术语“癌症”是指增生性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(nscl)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomachcancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括以上癌症中的任一种的难治性型式，或一种或多种以上癌症的组合。[0191]本发明的激动性icos结合分子[0192]本发明提供了新型双特异性抗原结合分子，其具有特别有利的性质，诸如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物学活性、靶向效率、降低的毒性、可以给予患者的扩展剂量范围以及从而可能增强的功效。[0193]包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域的示例性激动性icos结合分子[0194]在一个方面，本发明提供激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos抗原结合分子包含(a)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列；或者[0195](b)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或者[0196](c)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨idno:65的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:60的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:61的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:62的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:63的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:64的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:65的氨基酸序列。[0208]在另一方面，提供一种如上定义的激动性icos抗原结合分子，其中能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含与seqidno:58的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含与seqidno:59的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者重链可变区(vhcea)，其包含与seqidno:68的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含与seqidno:69的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:58的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:59的氨基酸序列。更具体地，能够与cea特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列。[0209]在进一步的方面，提供一种根据权利要求1至3中任一项所述的激动性icos抗原结合分子，其中能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是能够与成纤维细胞活化蛋白(fap)特异性结合的抗原结合结构域。在一个方面，能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：(a)重链可变区(vhfap)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:36的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:37的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:38的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:39的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:40的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:41的氨基酸序列；或者[0210](b)重链可变区(vhfap)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:44的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:45的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:46的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:47的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:48的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:49的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：(a)重链可变区(vhfap)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:36的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:37的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:38的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:39的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:40的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:41的氨基酸序列。[0211]在另一方面，提供一种激动性icos抗原结合分子，其包含至少一个能够与fap特异性结合的抗原结合结构域，其中能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：(a)重链可变区(vhfap)，其包含与seqidno:42的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含与seqidno:43的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(b)重链可变区(vhfap)，其包含与seqidno:50的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含与seqidno:51的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在特定方面，能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhfap)，其包含seqidno:42的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含seqidno:43的氨基酸序列。在进一步的方面，能够与fap特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhfap)，其包含seqidno:50的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlfap)，其包含seqidno:51的氨基酸序列。[0212]此外，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中能够与icos特异性结合的抗原结合结构域包含[0213](a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0214](b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0215](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0216](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0217]因此，在一个方面，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自小鼠免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自小鼠免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:10的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:11的氨基酸序列。[0218]在一个特定方面，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自小鼠免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:296的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:297的氨基酸序列。在另一个方面，提供其人源化变体，即能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，其包含重链no:26的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:27的氨基酸序列。在进一步的方面，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:298的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:299的氨基酸序列。在另一方面，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:300的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:301的氨基酸序列。在一个方面，提供其人源化变体，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含选自由seqidno:144、seqidno:145、seqidno:146、seqidno:147、seqidno:148、seqidno:149、seqidno:150和seqidno:151组成的组的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含选自由seqidno:152和seqidno:153组成的组的氨基酸序列。[0223]在一个方面，本发明提供一种如前所定义的激动性icos抗原结合分子，其包含[0224](a)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，[0225](b)一个能够与icos特异性结合的fab片段，以及[0226](c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低所述抗原结合分子与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，激动性icos抗原结合分子包含人igg1亚类的fc结构域，其包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。[0227]在另一方面，本发明提供一种如前所定义的激动性icos抗原结合分子，其包含[0228](a)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，[0229](b)两个能够与icos特异性结合的fab片段，以及[0230](c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低所述抗原结合分子与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。特别地，人igg1亚类的fc结构域包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。[0231]在特定方面，能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是crossfab片段。[0232]本发明的示例性激动性icos抗体[0233]在进一步的方面，提供一种激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，其包含：(a)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列，或者[0234](b)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或者[0235](c)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:24的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:25的氨基酸序列；或者[0236](d)重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:28的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:29的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:30的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:31的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:32的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:33的氨基酸序列。[0237]在一个方面，激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，源自小鼠免疫并包含：重链可变区(vhicos)，其包含：(i)cdr-h1，其包含seqidno:4的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:5的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:6的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含：(iv)cdr-l1，其包含seqidno:7的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:8的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:9的氨基酸序列。在另一方面，激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，源自兔免疫，并包含:重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:12的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:13的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:14的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:15的氨基酸序列,(v)cdr-l2，其包含seqidno:16的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:17的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:20的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:21的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:22的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:23的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:24的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:25的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含(i)cdr-h1，其包含seqidno:28的氨基酸序列，(ii)cdr-h2，其包含seqidno:29的氨基酸序列，和(iii)cdr-h3，其包含seqidno:30的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含(iv)cdr-l1，其包含seqidno:31的氨基酸序列，(v)cdr-l2，其包含seqidno:32的氨基酸序列，和(vi)cdr-l3，其包含seqidno:33的氨基酸序列。[0238]在一个方面，提供一种激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，其包含[0239](a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0240](b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0241](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0242](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0243]因此，在一个方面，提供源自小鼠免疫的激动性icos抗原结合分子，特别是抗体，其包含重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和至少一个能够与源自小鼠免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域，所述激动性icos结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:10的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:11的氨基酸序列。[0244]在一个特定方面，提供源自小鼠免疫的激动性icos抗原结合分子，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:296的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:297的氨基酸序列。在另一个方面，提供其人源化变体，即能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，其包含重链可变区(vhicos)，其包含选自由seqidno:124、seqidno:125、seqidno:126、seqidno:127、seqidno:128、seqidno:129、seqidno:130和seqidno:131组成的组的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含选自由seqidno:132、seqidno:133、seqidno:134和seqidno:135组成的组的氨基酸序列。[0245]在另一方面，本发明提供源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0246]在一个方面，本发明提供源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子，其包含重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:18的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:19的氨基酸序列。[0247]在进一步的方面，源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子包含重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，能够与源自兔免疫的icos特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:34的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:35的氨基酸序列。在一个方面，提供其人源化变体，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含选自由seqidno:136、seqidno:137、seqidno:138、seqidno:139和seqidno:140组成的组的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含选自由seqidno:141、seqidno:142和seqidno:143组成的组的氨基酸序列。[0248]在进一步的方面，激动性icos抗原结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个特定方面，源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:26的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:27的氨基酸序列。在进一步的方面，源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:298的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:299的氨基酸序列。在另一方面，源自兔免疫的激动性icos抗原结合分子包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:300的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:301的氨基酸序列。在一个方面，提供其人源化变体，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含选自由seqidno:144、seqidno:145、seqidno:146、seqidno:147、seqidno:148、seqidno:149、seqidno:150和seqidno:151组成的组的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含选自由seqidno:152和seqidno:153组成的组的氨基酸序列。[0249]在一个方面，激动性icos抗原结合分子是全长抗体。在另一方面，激动性icos抗原结合分子是fab或crossfab片段。在特定方面，激动性icos抗原结合分子是人源化抗体。[0250]本发明的示例性双特异性激动性icos抗原结合分子[0251]在一个方面，本发明提供双特异性激动性icos结合分子，其包含(a)一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，和(b)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，和(c)fc结构域。因此，在这种情况下，激动性icos结合分子对于与icos的结合是单价的，并且对于与肿瘤相关抗原的结合是单价的(1 1形式)。[0252]在一个特定方面，提供激动性icos结合分子，其中所述分子包含：(a)能够与icos特异性结合的第一fab片段，(b)能够与肿瘤相关抗原特异性结合的第二fab片段，和(c)包含能够彼此稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域。[0253]在一个方面，提供激动性icos结合分子，其中所述分子包含：(a)能够与icos特异性结合的第一fab片段；(b)能够与肿瘤相关抗原特异性结合的第二抗原结合结构域，包括vh和vl结构域；和(c)包含能够彼此稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，并且其中能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的vh和vl结构域之一与fc结构域的第一亚基的c末端融合，并且vh和vl中的另一个与fc结构域的第二亚基的c末端融合。这种分子被称为1 1头至尾。[0254]在另一方面，本发明提供双特异性激动性icos结合分子，其包含(a)两个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，和(b)一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，和(c)fc结构域。因此，在这种情况下，激动性icos结合分子对于与icos的结合是二价的，并且对于与肿瘤相关抗原的结合是单价的(2 1形式)。[0255]在一个方面，提供激动性icos结合分子，其中所述分子包含：(a)两个能够与icos特异性结合的fab片段；(b)能够与肿瘤相关抗原特异性结合的第二抗原结合结构域，包括vh和vl结构域；和(c)包含能够彼此稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，并且其中能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的vh和vl结构域之一与fc结构域的第一亚基的c末端融合，并且vh和vl中的另一个与fc结构域的第二亚基的c末端融合。这种分子被称为2 1。[0256]在另一方面，本发明提供激动性icos结合分子，其包含(a)能够与icos特异性结合的第一fab片段，(b)能够与肿瘤相关抗原特异性结合的第二fab片段，(c)能够与icos特异性结合的第三fab片段，和(d)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中第二fab片段(b)在fab重链的c末端与第一fab片段(a)的fab重链的n末端融合，所述第一fab片段(a)又在其c末端与第一fc结构域亚基的n末端融合，并且第三fab片段(c)在fab重链的c末端与第二fc结构域亚基的n末端融合，并且其中在能够与靶细胞抗原(i)特异性结合的第二fab片段中，fab轻链和fab重链的可变区vl和vh被彼此替换。[0257]在再一方面，本发明提供激动性icos结合分子，其包含(a)能够与icos特异性结合的第一fab片段，(b)能够与肿瘤相关抗原特异性结合的第二fab片段，(c)能够与icos特异性结合的第三fab片段，和(d)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中第一fab片段(a)在fab重链的c末端与第二fab片段(b)的fab重链的n末端融合，所述第二fab片段(b)又在其c末端与第一fc结构域亚基的n末端融合，并且第三fab片段(c)在fab重链的c末端与第二fc结构域亚基的n末端融合，并且其中在能够与靶细胞抗原(i)特异性结合的第二fab片段中，fab轻链和fab重链的可变区vl和vh被彼此替换。[0258]减少fc受体结合和/或效应子功能的fc结构域修饰[0259]本发明的激动性icos结合分子的fc结构域由一对包含免疫球蛋白分子重链结构域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白g(igg)分子的fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含ch2和ch3igg重链恒定结构域。fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。[0260]因此，包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子包含iggfc结构域，特别是igg1fc结构域或igg4fc结构域。更具体地，包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子包含igg1fc结构域。[0261]fc结构域为本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定方面，与天然igg1fc结构域相比，本发明的激动性icos结合分子的fc结构域表现出降低的与fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个方面，fc结构域基本上不结合fc受体和/或不诱导效应子功能。在一个特定方面，fc受体是fcγ受体。在一个方面，fc受体是人fc受体。在一个具体方面，fc受体是活化人fcγ受体，更具体地是人fcγriiia、fcγri或fcγriia，最具体地是人fcγriiia。在一个方面，fc结构域不诱导效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(cdc)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(adcp)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与nk细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的t细胞引发。[0262]在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的fc结构域中，从而生成fc区变体。fc区变体可包含人fc区序列(例如人igg1、igg2、igg3或igg4fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。[0263]在一个特定方面，本发明提供一种抗体，其中fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与fc受体的结合，特别是与fcγ受体的结合。[0264]在一个方面，本发明抗体的fc结构域包含降低fc结构域与fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于fc结构域的两个亚基中的每一个中。特别地，fc结构域在e233、l234、l235、n297、p331和p329位(eu编号)处包含氨基酸取代。特别地，fc结构域包含igg重链234和235位(eu编号)和/或329位(eu编号)的氨基酸取代。更具体地，提供根据本发明的抗体，其包含在igg重链中具有氨基酸取代l234a、l235a和p329g(“p329glala”，kabateu编号)的fc结构域。氨基酸取代l234a和l235a是指所谓的lala突变。氨基酸取代的“p329glala”组合几乎完全消除人igg1fc结构域的fcγ受体结合，如国际专利申请公开号wo2012/130831a1所述，所述专利申请公开还描述制备这种突变fc结构域的方法和用于确定其特性(诸如fc受体结合或效应子功能)的方法。[0265]具有降低的fc受体结合和/或效应子功能的fc结构域还包括具有fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的fc突变体，包括所谓的“dana”fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。[0266]在另一方面，fc结构域为igg4fc结构域。与igg1抗体相比，igg4抗体表现出降低的与fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。在一个更具体的方面，fc结构域是在s228位处(kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代s228p的igg4fc结构域。在一个更具体的方面，fc结构域是包含氨基酸取代l235e和s228p以及p329g(eu编号)的igg4fc结构域。wo2012/130831中也描述了此类igg4fc结构域突变体及其fcγ受体结合特性。[0267]具有延长的半衰期和改善的新生儿fc受体(fcrn)结合、负责将母体igg转移至胎儿(guyer,r.l.等人，j.immunol.117(1976)587-593，以及kim,j.k.等人，j.immunol.24(1994)2429-2434)的抗体描述于us2005/0014934中。那些抗体包含这样的fc区，所述fc区中具有改善fc区与fcrn的结合的一个或多个取代。此类fc变体包括在以下fc区残基中的一处或多处具有取代的fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。关于fc区变体的其他示例，还参见duncan,a.r.和winter,g.,nature322(1988)738-740；us5,648,260；us5,624,821；以及wo94/29351。[0268]与fc受体的结合可以例如通过elisa或通过表面等离子体共振(spr)使用标准仪器(诸如biacore仪器(gehealthcare))容易地确定，并且fc受体诸如可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。另选地，可以使用已知表达特定fc受体的细胞系(诸如表达fcγiiia受体的人nk细胞)来评估fc结构域或包含fc结构域的细胞活化双特异性抗原结合分子对fc受体的结合亲和力。fc结构域的效应子功能，或本发明的包含fc结构域的双特异性抗原结合分子，可以通过本领域已知的方法来测量。本文描述了用于测量adcc的合适的测定法。用于评定感兴趣的分子的adcc活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；hellstrom等人，procnatlacadsciusa83,7059-7063(1986)和hellstrom等人，procnatlacadsciusa82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；bruggemann等人，jexpmed166,1351-1361(1987)。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的actitm非放射性细胞毒性测定(celltechnology,inc.mountainview,ca)；以及cytotox非放射性细胞毒性测定(promega,madison,wi))。用于此类测定的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。另选地或另外地，可例如在诸如在clynes等人，procnatlacadsciusa95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的adcc活性。[0269]以下部分描述了包含降低fc受体结合和/或效应子功能的fc结构域修饰的本发明激动性icos结合分子的优选方面。在一个方面，本发明涉及双特异性抗原结合分子，(a)至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，以及(c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该氨基酸取代降低抗体与fc受体的结合亲和力，特别是与fcγ受体的结合亲和力。在另一方面，本发明涉及激动性icos结合分子，其包含：(a)至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域，以及(c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该氨基酸取代降低效应子功能。在特定方面，fc结构域属于人igg1亚类，其具有氨基酸突变l234a、l235a和p329g(根据kabateu索引编号)。[0270]在本发明的一个方面，fc区在d265和p329位处包含氨基酸取代。在一些方面，fc区包含ch2结构域中的氨基酸取代d265a和p329g(“dapg”)。在一个此类实施例中，fc区是igg1fc区，特别是小鼠igg1fc区。dapg突变在例如wo2016/030350a1中有描述，并且可以被引入重链的ch2区以消除抗原结合分子与鼠fcγ受体的结合。[0271]促进异源二聚化的fc结构域修饰[0272]本发明的激动性icos结合分子包含与fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合位点，因此所述fc结构域的所述两个亚基可包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的激动性icos结合分子的产率和纯度，因此在本发明的双特异性抗原结合分子的fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。[0273]因此，在特定方面，本发明涉及激动性icos结合分子，其包含：(a)至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，以及(c)包含能够彼此稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中fc结构域包含促进fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人iggfc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在fc结构域的ch3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在fc结构域的ch3结构域中。[0274]在一个具体方面，所述修饰是所谓的“杵进入臼”修饰，所述修饰包括fc结构域的两个亚基中的一个中的“杵”修饰和fc结构域的两个亚基中的另一个中的“臼”修饰。因此，本发明涉及激动性icos结合分子，其包含：(a)至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，以及(c)包含能够彼此稳定缔合的第一亚基和第二亚基的fc结构域，其中根据杵臼结构方法，fc结构域的第一亚基包含杵并且fc结构域的第二亚基包含臼。在一个特定方面中，fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代s354c和t366w(eu编号)而fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代y349c、t366s和y407v(根据kabateu索引编号)。[0275]杵臼结构技术描述于例如us5,731,168；us7,695,936；ridgway等人，proteng9，617-621(1996)和carter，jimmunolmeth248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述突起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。[0276]因此，在一个方面，在本发明的激动性icos结合分子的fc结构域的第一亚基的ch3结构域中，某一氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的ch3结构域内产生突起，所述突起可定位于第二亚基的ch3结构域内的空腔中；而在fc结构域的第二亚基的ch3结构域中，某一氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的ch3结构域内产生空腔，该第一亚基的ch3结构域内的所述突起可定位在该空腔内。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在一个具体方面，在fc结构域的第一亚基的ch3结构域中，366位处的苏氨酸残基被色氨酸残基(t366w)替换，而在fc结构域的第二亚基的ch3结构域中，407位处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(y407v)替换。在一个方面中，另外在fc结构域的第二亚基中，366位处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(t366s)替换，并且368位处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(l368a)替换。[0277]在另一个方面，另外在fc结构域的第一亚基中，354位处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(s354c)替换，并且另外在fc结构域的第二亚基中，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(y349c)替换。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc结构域的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定该二聚体(carter(2001),jimmunolmethods248,7-15)。在一个特定方面中，fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代s354c和t366w(eu编号)而fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代y349c、t366s和y407v(根据kabateu索引编号)。[0278]在一个方面，fc区的第一亚基在392和409位包含天冬氨酸残基(d)，并且fc区的第二亚基在356和399位包含赖氨酸残基(k)。在一些实施例中，在fc区的第一亚基中，392和409位的赖氨酸残基被天冬氨酸残基(k392d,k409d)替换，并且在fc区的第二亚基中，356位的谷氨酸残基和399位的天冬氨酸残基被赖氨酸残基(e356k,d399k)替换。例如，在wo2014/131694a1中描述“ddkk”杵臼结构技术，并且该技术有利于带有提供互补氨基酸残基的亚基的重链的组装。[0279]在另一个方面中，促进fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在pct公开wo2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。idno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0303](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0304](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0305]在一个特定方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:97的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:96的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:94的氨基酸序列。[0306]在另一特定方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:98的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:99的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:100的氨基酸序列。[0307]在另一特定方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:98的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:101的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:100的氨基酸序列。[0308]在另一特定方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:102的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:103的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:104的氨基酸序列。[0309]在再一方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:105的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:106的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:107的氨基酸序列。[0310]在另一方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:108的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:109的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:107的氨基酸序列。[0311]在另一方面，本发明提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:110的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:111的氨基酸序列；以及两个轻链，其包含seqidno:107的氨基酸序列。[0312]在进一步的方面，提供包含两个能够与icos特异性结合的fab片段和一个能够与fap特异性结合的fab片段的分子。[0313]在进一步的方面，所述分子包含两个能够与icos特异性结合的fab片段。[0314]在一个特定方面，提供一种分子，其包含[0315](i)能够与fap特异性结合的第一fab片段，其包含：重链可变区(vhfap)，其包含seqidno:42的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlfap)，其包含seqidno:43的氨基酸序列；或者包含重链可变区(vhfap)，其包含seqidno:50的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlfap)，其包含seqidno:51的氨基酸序列，以及[0316](ii)能够与icos特异性结合的两个fab片段，其各自包含[0317](a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0318](b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0319](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0320](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0321]在一个方面，提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:112的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:114的氨基酸序列；两个第一轻链，其包含seqidno:113的氨基酸序列；以及第二轻链，其包含seqidno:115的氨基酸序列。[0322]在另一方面，提供一种双特异性激动性icos结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:116的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:118的氨基酸序列；两个第一轻链，其包含seqidno:117的氨基酸序列；以及第二轻链，其包含seqidno:119的氨基酸序列。[0323]在一个方面，提供一种激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与cea特异性结合的抗原结合结构域，其包含重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列；以及至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，其包含[0324](a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0325](b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0326](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0327](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0328]更具体地，提供一种双特异性抗原结合分子，其中所述分子包含[0329](i)能够与cea特异性结合的第一fab片段，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列，以及[0330](ii)能够与icos特异性结合的第二fab片段，其包含[0331](a)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:10的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0332](b)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0333](c)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者[0334](d)重链可变区(vhicos)，其包含与seqidno:34的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(vlicos)，其包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0335]在一个方面，提供激动性icos结合分子，其包含：一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列；以及至少一个能够与icos特异性结合的抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:18的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:19的氨基酸序列。[0336]更具体地，提供一种双特异性抗原结合分子，其中所述分子包含(i)能够与fap特异性结合的第一fab片段，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:68的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:69的氨基酸序列；以及(ii)能够与icos特异性结合的第二fab片段，其包含：重链可变区(vhicos)，其包含seqidno:18的氨基酸序列，以及轻链可变区(vlicos)，其包含seqidno:19的氨基酸序列。[0337]在一个方面，提供一种双特异性抗原结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:202的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:204的氨基酸序列；第一轻链，其包含seqidno:203的氨基酸序列；以及第二轻链，其包含seqidno:205的氨基酸序列。[0338]在一个方面，提供一种双特异性抗原结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:206的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:208的氨基酸序列；第一轻链，其包含seqidno:207的氨基酸序列；以及第二轻链，其包含seqidno:209的氨基酸序列。[0339]在另一方面，提供一种双特异性抗原结合分子，其包含：第一重链(hc1)，其包含seqidno:206的氨基酸序列；第二重链(hc2)，其包含seqidno:210的氨基酸序列；第一轻链，其包含seqidno:207的氨基酸序列；以及第二轻链，其包含seqidno:211的氨基酸序列。[0340]用于本发明的示例性抗cea/抗cd3双特异性抗体[0341]本发明涉及抗cea/抗cd3双特异性抗体及其与激动性icos抗原结合分子联合的用途，特别是其在治疗或延缓癌症进展的方法中的用途，更特别是治疗或延缓实体瘤进展的用途。本文所用的抗cea/抗cd3双特异性抗体是包含结合cd3的第一抗原结合结构域和结合cea的第二抗原结合结构域的双特异性抗体。[0342]因此，本文所用的抗cea/抗cd3双特异性抗体包含含有重链可变区(vhcd3)和轻链可变区(vlcd3)的第一抗原结合结构域，以及含有重链可变区(vhcea)和轻链可变区(vlcea)的第二抗原结合结构域。[0343]在一个特定方面，联合使用的抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(vhcd3)，其包含seqidno:218的cdr-h1序列、seqidno:219的cdr-h2序列和seqidno:220的cdr-h3序列；和/或轻链可变区(vlcd3)，其包含seqidno:221的cdr-l1序列、seqidno:222的cdr-l2序列和seqidno:223的cdr-l3序列。更具体地，所述抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，其包含与seqidno:224的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(vhcd3)和/或与seqidno:225的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(vlcd3)。在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含：重链可变区(vhcd3)，其包含seqidno:224的氨基酸序列；及/或轻链可变区(vlcd3)，其包含seqidno:225的氨基酸序列。[0344]在一个方面，特异性结合cd3的抗体是全长抗体。在一个方面，特异性结合cd3的抗体是人igg类抗体，特别是人igg1类抗体。在一个方面，特异性结合cd3的抗体是抗体片段，特别是fab分子或scfv分子，更特别是fab分子。在一个特定方面，特异性结合cd3的抗体是交叉fab分子，其中fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域被交换(即，被彼此替换)。在一个方面，特异性结合cd3的抗体是人源化抗体。[0345]在另一方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，其包含[0346](a)重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:226的cdr-h1序列、seqidno:227的cdr-h2序列和seqidno:228的cdr-h3序列；和/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:229的cdr-l1序列、seqidno:230的cdr-l2序列和seqidno:231的cdr-l3序列；或者[0347](b)重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:234的cdr-h1序列、seqidno:235的cdr-h2序列和seqidno:236的cdr-h3序列；和/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:237的cdr-l1序列、seqidno:238的cdr-l2序列和seqidno:239的cdr-l3序列。[0348]更具体地，所述抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包含与seqidno:232的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:233的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(vlcea)。在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:232的氨基酸序列；及/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:233的氨基酸序列。在另一方面，所述抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包含与seqidno:240的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:241的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(vlcea)。在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:240的氨基酸序列；及/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:241的氨基酸序列。[0349]在另一特定方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含结合cea的第三抗原结合结构域。特别地，所述抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第三抗原结合结构域，其包含[0350](a)重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:226的cdr-h1序列、seqidno:227的cdr-h2序列和seqidno:228的cdr-h3序列；和/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:229的cdr-l1序列、seqidno:230的cdr-l2序列和seqidno:231的cdr-l3序列；或者[0351](b)重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:234的cdr-h1序列、seqidno:235的cdr-h2序列和seqidno:236的cdr-h3序列；和/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:237的cdr-l1序列、seqidno:238的cdr-l2序列和seqidno:239的cdr-l3序列。[0352]更具体地，所述抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合结构域，其包含与seqidno:232的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:233的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(vlcea)。在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:232的氨基酸序列；及/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:233的氨基酸序列。在另一特定方面，所述抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合结构域，其包含与seqidno:240的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:241的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(vlcea)。在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合结构域，其包含：重链可变区(vhcea)，其包含seqidno:240的氨基酸序列；及/或轻链可变区(vlcea)，其包含seqidno:241的氨基酸序列。[0353]在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体是双特异性抗体，其中第一抗原结合结构域是其中fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域被交换的交叉fab分子，并且第二和第三(如果存在的话)抗原结合结构域是常规fab分子。[0354]在另一方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体是双特异性抗体，其中(i)第二抗原结合结构域在fab重链的c末端与第一抗原结合结构域的fab重链的n末端融合，第一抗原结合结构域在fab重链的c末端与fc结构域的第一亚基的n末端融合，并且第三抗原结合结构域在fab重链的c末端与fc结构域的第二亚基的n末端融合，或(ii)第一抗原结合结构域在fab重链的c末端与第二抗原结合结构域的fab重链的n末端融合，第二抗原结合结构域在fab重链的c末端与fc结构域的第一亚基的n末端融合，并且第三抗原结合结构域在fab重链的c末端与fc结构域的第二亚基的n末端融合。[0355]fab分子可以直接或通过肽接连接基与fc结构域融合，该肽连接基包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽连接基是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽连接基包括例如(g4s)n、(sg4)n、(g4s)n或g4(sg4)n肽连接基。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一个实施例中，所述肽连接基的长度为至少5个氨基酸，在一个实施例中长度为5至100个氨基酸，在另一实施例中为10至50个氨基酸。在一个实施例中，所述肽连接基是(gxs)n或(gxs)ngm，其中g＝甘氨酸，s＝丝氨酸，并且(x＝3、n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4、n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3)，在一个实施例中，x＝4并且n＝2或3，在另一实施例中，x＝4并且n＝2。在一个实施例中，所述肽连接基是(g4s)2。用于使第一fab分子和第二fab分子的fab轻链彼此融合的特别合适的肽连接基是(g4s)2。适于连接第一fab片段和第二fab片段的fab重链的一种示例性肽连接基包含序列(d)-(g4s)2。另一种合适的此类连接基包含序列(g4s)4。另外，连接基可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在fab分子与fc结构域亚基的n末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽连接基的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。[0356]在另一方面中，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含fc结构域，所述fc结构域包含减少与fc受体的结合和/或降低效应子功能的一个或多个氨基酸取代。具体地，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含igg1fc结构域，所述igg1fc结构域包含氨基酸取代l234a、l235a和p329g。[0357]在一个特定方面中，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含与seqidno：242所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与seqidno:243所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与seqidno:244所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，以及与seqidno:245所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗体包含seqidno:242所示的多肽序列、seqidno:243所示的多肽序列、seqidno:244所示的多肽序列和seqidno:245所示的多肽序列(ceacd3tcb)。[0358]在另一个特定方面中，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含与seqidno：246所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与seqidno:247所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与seqidno:248所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，以及与seqidno:249所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗体包含seqidno:246所示的多肽序列、seqidno:247所示的多肽序列、seqidno:248所示的多肽序列和seqidno:249所示的多肽序列(ceacam5cd3tcb)。[0359]具体的双特异性抗体描述于pct公开号wo2014/131712a1中。[0360]在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体还可以包含双特异性t细胞接合物在进一步的方面，抗cea/抗cd3双特异性抗体是如wo2007/071426或wo2014/131712中所述的双特异性抗体。在另一方面，双特异性抗体是medi565。[0361]在另一方面，本发明涉及鼠抗cea/抗cd3双特异性抗体，其包含含有重链可变区(vhmucd3)和轻链可变区(vlmucd3)的第一抗原结合结构域，含有重链可变区(vhmucea)和轻链可变区(vlmucea)的第二抗原结合结构域，以及含有重链可变区(vhmucea)和轻链可变区(vlmucea)的第三抗原结合结构域。[0362]在一个特定方面，鼠抗cea/抗cd3双特异性抗体包含与seqidno：250所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，与seqidno:251所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，与seqidno:252所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，与seqidno:253所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在进一步的特定方面，鼠抗cea/抗cd3双特异性抗体包含seqidno:250所示的多肽序列、seqidno:251所示的多肽序列、seqidno:252所示的多肽序列和seqidno:253所示的多肽序列(muceacd3tcb)。[0363]用于本发明的阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂[0364]在本发明的一个方面，激动性icos抗原结合分子与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂联合使用。在另一方面，激动性icos抗原结合分子与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂和cd3双特异性抗体联合使用。在所有这些方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是pd-l1结合拮抗剂或pd-1结合拮抗剂。特别地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为抗pd-l1抗体或抗pd-1抗体。[0365]术语“pd-l1”也称为cd274或b7-h1，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然pd-l1，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，特别是指“人pd-l1”。完整人pd-l1的氨基酸序列示出于uniprot(www.uniprot.org)登录号q9nzq7(seqidno:286)中。术语“pd-l1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l1与其一种或多种结合配偶体(诸如pd-1、b7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一些实施例中，pd-l1结合拮抗剂是抑制pd-l1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，pd-l1结合拮抗剂抑制pd-l1至pd-1和/或b7-1的结合。在一些实施例中，pd-l1结合拮抗剂包括抗pd-l1抗体，其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l1与其一个或多个结合配偶体(诸如pd-1、b7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一个实施例中，pd-l1结合拮抗剂可减少由t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过pd-l1的信号传导所介导的或通过其的负共刺激信号，从而使功能障碍的t细胞功能障碍更少(例如，提高效应子对抗原识别的应答)。特别地，pd-l1结合拮抗剂是抗pd-l1抗体。术语“抗pd-l1抗体”或“与人pd-l1结合的抗体”或“与人pd-l1特异性结合的抗体”或“拮抗性抗pd-l1”是指与人pd-l1抗原特异性结合的抗体，其结合亲和力kd值为1.0×10-8mol/l或更低，并且在一个方面，kd值为1.0×10-9mol/l或更低。使用标准结合测定(诸如表面等离子体共振技术(ge-healthcareuppsala，瑞典))来确定结合亲和力。[0366]在一个特定方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体。在一个特定方面，抗pd-l1抗体选自由阿特珠单抗(mpdl3280a、rg7446)、德瓦鲁单抗(medi4736)、阿维单抗(msb0010718c)和mdx-1105组成的组。在具体方面，抗pd-l1抗体为本文所述的yw243.55.s70。在另一具体方面，抗pd-l1抗体为本文所述的mdx-1105。在仍另一具体方面，抗pd-l1抗体为medi4736(德瓦鲁单抗)。在再进一步的方面，抗pd-l1抗体为msb0010718c(阿维单抗)。更具体地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是阿特珠单抗(mpdl3280a)。在另一方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体，其包含seqidno:288的重链可变结构域vh(pdl-1)和seqidno:289的轻链可变结构域vl(pdl-1)。在另一方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体，其包含seqidno:290的重链可变结构域vh(pdl-1)和seqidno:291的轻链可变结构域vl(pdl-1)。[0367]术语“pd-1”，也称为cd279、pd1或程序性细胞死亡蛋白1，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然pd-l1，该脊椎动物来源包括哺乳动物例如灵长类(如人)、非人灵长类(如biology，greenepublishingassociatesandwileyinterscience，n.y.(1989).表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码抗体或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(tag、tga或taa)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明的抗体或其多肽片段的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mrna的转录，并且如果两个dna片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个dna片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导dna的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。[0376]本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-a)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或ires，也称为cite序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(ltr)，或腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)。[0377]本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗体或其多肽片段，可以将编码信号序列的dna置于本发明的抗体或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的n末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。另选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(tpa)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。[0378]dna编码可用于促进后续纯化的短蛋白序列(例如组氨酸标签)或帮助标记融合蛋白可包含在编码本发明的双特异性抗体或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。[0379]在本发明的另一方面，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如，已转化或转染)载体，该载体包含编码本发明的抗体(的一部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化改造以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(cho)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见gerngross,natbiotech22,1409-1414(2004)和li等人，natbiotech24,210-215(2006)。[0380]用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的plantibodiestm技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚肾系(293或293t细胞，如例如在graham等人，jgenvirol36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(bhk)、小鼠塞尔托利氏细胞(tm4细胞，如例如在mather,biolreprod23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(cv1)、非洲绿猴肾细胞(vero-76)、人宫颈癌细胞(hela)、犬肾细胞(mdck)、布法罗大鼠肝细胞(brl3a)、人肺细胞(w138)、人肝细胞(hepg2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(mmt060562)、tri细胞(如例如在mather等人，annalsn.y.acadsci383,44-68(1982)中所述)、mrc5细胞，以及fs4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub等人，procnatlacadsciusa77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如yo、ns0、p3x63和sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如yazaki和wu，methodsinmolecularbiology，第248卷(b.k.c.lo编辑，humanapress,totowa,nj)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾(hek)细胞或淋巴细胞(例如，y0、ns0、sp20细胞)。用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含免疫球蛋白的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化改造，以便也表达另一条免疫球蛋白链，使得表达的产物为具有重链和轻链的免疫球蛋白。[0381]在一个方面，提供了一种产生本发明的激动性icos结合分子或其多肽片段的方法，其中所述方法包括在适于表达本发明的抗体或其多肽片段的条件下培养包含编码如本文提供的本发明的激动性icos结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收本发明的抗体或其多肽片段。[0382]在某些实施例中，能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域或能够与形成抗原结合分子一部分的icos(例如fab片段或vh和vl)特异性结合的抗原结合结构域包含至少一个能够与抗原结合的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并由其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如harlow和lane，"antibodies,alaboratorymanual",coldspringharborlaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中所述)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如mccafferty的美国专利号5,969,108)。[0383]免疫球蛋白的任何动物物种都可用于本发明。用于本发明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠、灵长类或人来源的免疫球蛋白。如果融合蛋白旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(参见例如winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，所述各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)cdr移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，所述架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(sdr或a-cdr；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如almagroandfransson,frontbiosci13,1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如riechmann等人,nature332,323-329(1988)；queen等人,procnatlacadsciusa86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；jones等人,nature321,522-525(1986)；morrison等人,procnatlacadsci81,6851-6855(1984)；morrisonandoi,advimmunol44,65-92(1988)；verhoeyen等人,science239,1534-1536(1988)；padlan,molecimmun31(3),169-217(1994)；kashmiri等人,methods36,25-34(2005)(描述了sdr(a-cdr)移植)；padlan,molimmunol28,489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；dall’acqua等人,methods36,43-60(2005)(描述了“fr改组”)；以及osbourn等人,methods36,61-68(2005)和klimka等人,brjcancer83,252-260(2000)(描述了用于fr改组的“指导选择”方法)中。根据本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体一般描述于vandijk和vandewinkel,curropinpharmacol5,368-74(2001)和lonberg,curropinimmunol20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并衍生自该抗体(参见，例如monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987))。也可以通过以下方式来制备人抗体和人可变区：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以产生具有对抗原激发作出应答的人可变区的完整人抗体或完整抗体(参见例如lonberg,natbiotech23,1117-1125(2005))。也可通过以下方式来产生人抗体和人可变区：分离选自人来源的噬菌体展示文库的fv克隆可变区序列(参见，例如hoogenboom等人methodsinmolecularbiology178,1-37(o’brien等人,ed.,humanpress,totowa,nj,2001)；以及mccafferty等人,nature348,552-554；clackson等人,nature352,624-628(1991))。噬菌体通常将抗体片段展示为单链fv(scfv)片段或fab片段。[0384]在某些方面，根据例如在pct公开wo2012/020006(参见与亲和力成熟相关的实例)或美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法，抗kgne结合结构域被工程化以具有增强的结合亲和力。本发明的抗原结合分子与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振技术(liljeblad,等人,glycoj17,323-329(2000))以及传统的结合测定(heeley,endocrres28,217-229(2002))来测量。竞争测定可用于鉴定与参考抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施例中，此类竞争抗原结合分子与由参考抗原结合分子结合的同一表位(例如，线性或构象表位)结合。用于定位抗原结合分子结合与之结合的表位的详细示例性方法提供于：morris(1996)，“epitopemappingprotocols”，出自methodsinmolecularbiology第66卷(humanapress,totowa,nj)。在示例性竞争测定中，将固定化抗原在包含与所述抗原结合的第一标记抗原结合分子和正在测试其与第一抗原结合分子竞争结合所述抗原的能力的第二未标记抗原结合分子的溶液中孵育。第二抗原结合分子可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化抗原在包含第一标记抗原结合分子而非第二未标记抗原结合分子的溶液中孵育。在容许第一抗体与抗原结合的条件下孵育之后，去除过量未结合的抗体，并且测量与固定化抗原缔合的标记的量。若与固定化抗原缔合的标记的量相对于对照样品在测试样品中基本上减少，则表明第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合抗原。参见harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanual第14章(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny)。[0385]如本文所述制备的本发明的激动性icos结合分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用双特异性抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明融合蛋白的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白a或蛋白g的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白a或g亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗原结合分子。双特异性抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中任一者来确定，所述熟知的分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。例如，实例中所述的表达的双特异性抗原结合分子被显示为得到完整并且适当组装，如还原和非还原sds-page所示。[0386]测定[0387]本文所提供的抗原结合分子的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域中已知的各种测定法进行鉴定、筛选或表征。[0388]1.亲和力测定[0389]本文提供的抗体与icos或肿瘤相关抗原的亲和力可以使用标准仪器诸如biacore仪器(gehealthcare)以及可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，根据实例中阐述的方法通过表面等离子体共振(spr)来确定。双特异性抗原结合分子对靶细胞抗原的亲和力也可以使用标准仪器诸如biacore仪器(gehealthcare)以及可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，通过表面等离子体共振(spr)来确定。用于测量结合亲和力的特定说明性和示例性实施例描述于实例9中。根据一个方面，在25℃下使用t100仪器(gehealthcare)通过表面等离子体共振来测量kd。[0390]2.结合测定和其他测定[0391]在一个方面，本文所报道的抗体的抗原结合活性通过例如elisa、蛋白质印迹、流式细胞术等已知方法进行测试。[0392]3.活性测定[0393]进行了几项基于细胞的体外测定，以评价包含至少一个结合肿瘤相关抗原的抗原结合结构域的激动性icos结合分子的活性。测定旨在显示在t细胞双特异性(tcb)介导的t细胞活化存在的情况下，抗icos双特异性分子的额外激动性/共刺激活性。例如，在实例7.2中更详细地描述了用具有nfat调节的荧光素酶表达的报告细胞系进行的jurkat测定在cd3/tcr和icos结合时诱导)，其中测量了icosigg分子，板结合的与在溶液中的对比，以及不存在与存在包被的cd3igg刺激的对比。[0394]此外，在实例7.1中测试和描述了原代人pbmc共培养测定，其中在通过同时结合t细胞上的cd3和肿瘤细胞上的人cea而交联的tcb分子存在的情况下，通过同时结合t细胞上的人icos和人fap而交联的fap靶向icos分子在3t3-hfap细胞(亲代细胞系atcc#ccl-92，经修饰以稳定地过表达人fap)上表达。[0395]在某些方面中，测试本文所报道的抗体的此类生物活性。[0396]药物组合物、制剂和施用途径[0397]在进一步的方面，本发明提供了药物组合物，其包含激动性icos结合分子和对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体以及药用赋形剂，所述icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。在一个特定方面，提供一种药物组合物用于治疗癌症，更具体地用于治疗实体瘤，其包含激动性icos结合分子和对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体以及药用赋形剂，所述icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。在一个进一步的方面，提供了一种药物组合物，其包含激动性icos结合分子和对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子和对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体以单一组合物一起施用或以两种或更多种不同组合物分开施用。在另一方面，包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子与对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体同时、在其之前或在其之后施用。[0398]在另一方面，药物组合物包含本文提供的激动性icos结合分子和至少一种药用赋形剂。在另一方面，药物组合物包含本文所提供的激动性icos结合分子以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。[0399]在再一方面，本发明提供了一种药物组合物用于治疗或延缓癌症进展的方法，所述组合物包含激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的所述激动性icos结合分子用于与对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体联合使用，或用于与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂联合使用。在另一方面，包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子用于与对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞活化抗cd3双特异性抗体联合使用，以及与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂联合使用。特别地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为抗pd-l1抗体或抗pd1抗体。更特别地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂选自由阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗和纳武单抗组成的组。在一个具体方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为阿特珠单抗。在另一个具体方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为派姆单抗或纳武单抗。[0400]本发明的药物组合物包含溶解或分散在药用赋形剂中的治疗有效量的一种或多种抗体。术语“药用”(pharmaceuticalorpharmacologicallyacceptable)是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种抗体和任选的附加活性成分的药物组合物的制备将鉴于本公开而为本领域的技术人员已知，如由remington'spharmaceuticalsciences，第18版，mackprintingcompany,1990所示例的，该文献以引用方式并入本文。具体地，该组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药用赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂及它们的组合，如对本领域的普通技术人员所知。[0401]肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。为了注射，可在水溶液中配制本发明的含tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，优选在生理相容性缓冲剂诸如hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水中配制。溶液可含有配制剂(formulatoryagent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代性地，融合蛋白可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的融合蛋白以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药用赋形剂包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。[0402]活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在remington'spharmaceuticalsciences(第18版，mackprintingcompany,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。[0403]本文的示例性药用赋形剂还包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuph20(baxterinternational,inc.)。某些示例性shasegp和使用方法，包括rhuph20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。[0404]示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和wo2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。[0405]除了先前描述的组合物之外，本文描述的激动性icos结合分子也可以配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，激动性icos结合分子可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。[0406]包含本发明的激动性icos结合分子的药物组合物可通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的配方取决于所选择的施用途径。[0407]本发明的激动性icos结合分子可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药用盐包括酸加成盐，例如用蛋白质性质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。[0408]本文的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。[0409]治疗方法和组合物[0410]在一个方面，本发明提供了一种治疗或延缓受试者的癌症进展的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。[0411]在一个这样的方面，所述方法进一步包括向受试者施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在进一步的实施例中，本文提供了一种用于肿瘤缩小的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。根据上述方面中的任一者的“个体”或“受试者”优选地是人。[0412]在进一步的方面，提供了用于癌症免疫疗法的组合物，其包含激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。在某些实施例中，提供了用于癌症免疫疗法方法中的组合物，其包含激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。[0413]在进一步的方面，本文提供了包含激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体的组合物在制造或制备药物中的用途，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。在一个方面，药物用于治疗癌症。在进一步的方面，所述药物用于肿瘤缩小的方法中，所述方法包括对患有实体瘤的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的方面，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在进一步的实施例中，所述药物用于治疗实体瘤。在某些方面，个体患有cea阳性癌症。在一些方面，cea阳性癌症是结肠癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肾癌、食道癌或前列腺癌。在一些方面，乳腺癌是乳腺上皮癌或乳腺腺癌。在一些方面，乳腺上皮癌是浸润性导管癌。在一些方面，肺癌是肺腺癌。在一些实施例中，结肠癌是结直肠腺癌。根据以上实施例中的任一个的“受试者”或“个体”可以是人。[0414]在另一个方面，本发明提供了一种治疗或延缓受试者的癌症进展的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的激动性icos结合分子和t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中所述受试者在用所述激动性icos结合分子治疗之前在t细胞上具有低的icos基线表达。[0415]上述组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，本文报道的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一个方面，施用t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，和施用激动性icos结合分子，以及任选地施用另外的治疗剂发生在彼此约一个月内，或约一周、两周或三周内，或约一天、两天、三天、四天、五天或六天内，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。[0416]本文所报道的t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，和包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子(和任何另外的治疗剂)都可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要进行局部治疗，可以进行病变内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。[0417]本文报道的t细胞活化抗cd3双特异性抗体，特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体，以及包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子都将以符合良好医学实践的方式进行配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。所述抗体不是必须的，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的制剂共同配制。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。[0418]在另一个方面，本发明提供了一种治疗或延缓受试者的癌症进展的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的激动性icos结合分子，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域。[0419]其他药剂和治疗[0420]本发明的包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子可以在治疗中与一种或多种其它试剂联合施用。例如，本发明的激动性icos结合分子可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括可以施用用于治疗需要此类治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，附加治疗剂是另一种抗癌剂。在一个方面，所述另外的治疗剂选自由化疗剂、辐射和用于癌症免疫疗法的其他药剂组成的组。在进一步的方面，提供了如本文所述用于治疗癌症的如前所述的激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中包含至少一个与肿瘤相关抗原结合的抗原结合结构域的所述激动性icos结合分子与另一种免疫调节剂联合施用。[0421]术语“免疫调节剂”是指影响免疫系统的任何物质，包括单克隆抗体。本发明的分子可被认为是免疫调节剂。免疫调节剂可用作治疗癌症的抗肿瘤剂。在一个方面，免疫调节剂包括但不限于抗ctla4抗体(例如，伊匹单抗)、抗pd1抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)、pd-l1抗体(例如，阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗)、ox-40抗体、lag3抗体、tim-3抗体、4-1bb抗体和gitr抗体。[0422]在进一步的方面，提供如本文所述用于治疗癌症的如前所述的激动性icos结合分子，其包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域，其中包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的所述激动性icos结合分子与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂联合施用。在一个方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体或抗pd1抗体。更特别地，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂选自由阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗和纳武单抗组成的组。在一个具体方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为阿特珠单抗。在另一个方面，阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂为派姆单抗或纳武单抗。此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用激动性icos结合分子的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子通常以与本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。[0423]上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或单独的组合物中)，以及单独施用，在这种情况下，本发明的包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。[0424]制品[0425]在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(iv)溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。容器容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的组合物组合，并且容器可具有无菌入口(例如容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域的激动性icos结合分子。[0426]标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)第一容器，所述第一容器中含有组合物，其中所述组合物包含本发明的激动性icos结合分子，所述激动性icos结合分子包含至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域；以及(b)第二容器，所述第二容器中含有组合物，其中所述组合物包含进一步的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，所述包装插页指示所述组合物可用于治疗特定病症。[0427]可替代地或另外地，所述制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。[0428]表b(序列)：[0429][0430][0431][0432][0433][0434][0435][0436][0437][0438][0439][0440][0441][0442][0443][0444][0445][0446][0447][0448][0449][0450][0451][0452][0453][0454][0455][0456][0457][0458][0459][0460][0461]关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：kabat,e.a.等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中。根据如上所定义的根据kabat(kabat,e.a.等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))的编号系统来对抗体链的氨基酸进行编号和引用。[0462]***[0463]实例[0464]以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。[0465]重组dna技术[0466]使用标准方法来操纵dna，如在sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：kabat,e.a.等人，(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第五版，nihpublicationno91-3242。[0467]dna测序[0468]通过双链测序确定dna序列。[0469]基因合成[0470]通过使用适当模板进行pcr生成所需的基因区段，或由geneartag(regensburg,germany)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和pcr产物合成所需的基因区段。在确切的基因序列不可用的情况下，基于最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过rt-pcr从来源于合适的组织的rna中分离出基因。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒dna，并通过紫外光谱法确定浓度。通过dna测序来确认亚克隆基因片段的dna序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端dna序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。[0471]细胞培养技术[0472]使用如在currentprotocolsincellbiology(2000),bonifacino,j.s.,dasso,m.,harford,j.b.,lippincott-schwartz,j.和yamada,k.m.(编辑)，johnwiley&sons,inc中所述的标准细胞培养技术。[0473]蛋白纯化[0474]参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简而言之，将抗原结合分子应用于蛋白a亲和色谱法(平衡缓冲液:20mm柠檬酸钠，20mm磷酸钠，ph7.5；洗脱缓冲液：20mm柠檬酸钠，ph3.0)从细胞培养上清液中纯化含fc的蛋白质。在ph3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的ph。通过尺寸排阻色谱法(superdex200，gehealthcare)在pbs中或在20mm组氨酸、140mmnacl(ph6.0)中将聚集蛋白质与单体抗体分离。可将单体抗原结合分子级分合并，使用例如milliporeamiconultra(30mwco)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃。可以提供部分样品以例如通过sds-page、尺寸排阻色谱(sec)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。[0475]sds-page[0476]根据制造商的说明使用预制凝胶系统(invitrogen)。具体地，使用10％或4-12％bis-tris预制凝胶(ph6.4)和mes(还原凝胶，具有抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或mops(非还原凝胶)电泳缓冲液。[0477]分析尺寸排阻色谱法[0478]通过hplc色谱法执行用于测定抗体的聚集和寡聚状态的尺寸排阻色谱法(sec)。简而言之，将蛋白a纯化的抗体施加至agilenthplc1100系统上的300mmnacl、50mmkh2po4/k2hpo4，ph7.5中的tosohtskgelg3000sw柱，或施加至dionexhplc系统上的2×pbs中的superdex200柱(gehealthcare)。通过uv吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白。将biorad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。[0479]质谱[0480]本节描述了对具有vh/vl交换(vh/vlcrossmab)的多特异性抗体的表征，重点在于所述多特异性抗体的正确装配。通过对脱糖基化的完整crossmab和脱糖基化/纤溶酶消化或者脱糖基化/限制性lysc消化的crossmab进行电喷雾电离质谱(esi-ms)，来分析预期的一级结构。[0481]在37℃下以1mg/ml的蛋白质浓度将vh/vlcrossmab用磷酸盐或tris缓冲液中的n-糖苷酶f脱糖基化至多17h。纤溶酶消化或有限的lysc(罗氏)消化用ph8的tris缓冲液中的100μg去糖基化的vh/vlcrossmab分别在室温执行120小时和在37℃执行40min。在质谱分析之前，将样品经由hplc在sephadexg25柱(gehealthcare)上脱盐。在配备有triversananomate源(advion)的maxis4guhr-qtofms系统(brukerdaltonik)上经由esi-ms来测定总质量。[0482]使用表面等离子体共振(spr)测定多特异性抗体对相应抗原的结合亲和力(biacore)[0483]通过使用biacore仪器(gehealthcarebiosciencesab，uppsala,sweden)进行表面等离子体共振来研究产生的抗体与相应抗原的结合。简言之，对于亲和力测量，山羊抗人igg、jir109-005-098抗体通过胺偶联固定在cm5芯片上，用于针对相应抗原呈递抗体。在hbs缓冲液(hbs-p(10mmhepes，150mmnacl，0.005％tween20，ph7.4)中、在25℃(或替代性地在37℃)测量结合。在溶液中加入不同浓度的抗原(r&d系统或内部纯化)。通过注射抗原80秒至3分钟来测量关联性；通过用hbs缓冲液洗涤芯片表面3-10分钟来测量解离，并且使用1:1的朗缪尔结合模型来估计kd值。从样品曲线中减去负控制数据(如缓冲曲线)，用于校正系统固有基线漂移和降低噪声信号。使用相应的biacore评估软件来分析传感图和计算亲和力数据。[0484]实例1[0485]icos抗体的产生[0486]1.1用于通过免疫产生新颖icos结合物的抗原的制备、纯化和表征以及筛选工具[0487]1.1.1单体和二聚icos抗原fc(kih)融合分子的制备、纯化和表征[0488]编码人、食蟹猴或小鼠或4-1bb(表1)的胞外域的dna序列与人igg1重链ch2和ch3结构域一起在框架内亚克隆在单体的杵以及二聚icos抗原fc融合分子的臼和杵上(merchant等人,1998)。在抗原fc突起的c末端引入用于定向生物素化的avi标签。包含s354c/t366w突变的抗原fc杵链与包含y349c/t366s/l368a/y407v突变的fc臼链的组合允许产生包含单拷贝的icos异二聚体或包含两个拷贝的含胞外域链的同二聚体，从而产生fc连接抗原的单体或二聚体形式。表2示出抗原fc融合构建体的氨基酸序列。[0489]表1：抗原胞外域(ecd)的氨基酸编号及其来源[0490]seqidno:生物体来源ecd1人icos根据q9y6w8合成aa21-1402食蟹猴icos根据g7pl89合成aa21-1403鼠icos根据q9wvs0合成aa21-144[0491]表2：二聚抗原fc(kih)融合分子的cdna和氨基酸序列[0492][0493][0494][0495]将所有icos-fc融合编码序列克隆到驱动来自嵌合mpsv启动子且含有位于cds3’端的合成polya信号序列的插入物表达的质粒载体中。此外，载体含有ebvorip序列，用于质粒的游离体维持。[0496]为了制备生物素化的抗原/fc融合分子，将指数生长的悬浮hek293ebna细胞与三种编码融合蛋白两种组分(杵和臼链)的载体以及生物素化反应需要的酶bira共转染。相应载体以1:1:0.05的比率(“fc杵”:“fc臼”:“bira”)使用。[0497]为了在500ml摇瓶中产生蛋白质，在转染前24小时播种4亿hek293ebna细胞。对于转染，将细胞以210g离心分离5分钟，并且用预热的cdcho培养基替换上清液。将表达载体重新悬浮于20ml含200μg载体dna的cdcho培养基中。加入540μl聚乙烯亚胺(pei)后，将溶液涡流15秒，并在室温孵育10分钟。然后，将细胞与dna/pei溶液混合，将其转移至500ml摇瓶中，并且在培养箱中，在5％co2的气氛下在37℃孵育3小时。培养后，加入160mlf17培养基，并且将细胞培养24小时。转染后一天，向培养物中加入1mm丙戊酸和7％进料。培养7天后，通过在210g下旋转细胞15min收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至最终浓度0.01％(w/v)，并保持在4℃。[0498]通过亲和色谱法、使用蛋白质a，然后进行尺寸排阻色谱法，从细胞培养上清液中纯化分泌蛋白。对于亲和色谱法，将上清液加载到用40ml20mm磷酸钠、20mm柠檬酸钠ph7.5平衡的hitrapproteinahp柱(cv＝5ml，gehealthcare)上。用至少10个柱体积的含20mm磷酸钠、20mm柠檬酸钠和0.5m氯化钠(ph7.5)的缓冲液洗涤，除去未结合的蛋白质。使用20个柱体积的20mm柠檬酸钠、ph3.0的0.01％(v/v)tween-20产生的氯化钠线性ph梯度(0至500mm)洗脱结合蛋白。然后用10个柱体积的含20mm柠檬酸钠、500mm氯化钠和ph3.0的0.01％(v/v)tween-20的溶液洗涤柱。[0499]通过加入ph8.0的1/40(v/v)的2mtris，调节收集级分的ph。将蛋白浓缩并过滤，然后加载至用2mmmops、150mm氯化钠、ph7.4的0.02％(w/v)叠氮化钠溶液平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)。[0500]1.1.2表达重组icos的稳定细胞系的产生和表征[0501]将编码人或鼠icos的全长cdna亚克隆到哺乳动物表达载体中。使用lipofectamineltx试剂(invitrogen,#15338100)，按照生产商的方案，将质粒转染到cho-k1(atccccl-61)细胞中。将稳定转染的icos阳性cho-k1细胞保持在补充10％胎牛血清(gibco,#16140063)和1％glutamax补充剂(gibco；#31331-028)的dmem/f-12(gibco,#11320033)中。转染后两天，将嘌呤霉素(invivogen；#ant-pr-1)添加至6μg/ml。初始筛选后，使用bdfacsariaiii细胞分选仪(bdbiosciences)对icos细胞表面表达最高的细胞进行分选，并培养以建立稳定的细胞克隆。使用pe抗人/小鼠/大鼠cd278抗体(biolegend；#313508)，为期4周进行facs分析，确认了表达水平及稳定性。[0502]1.1.3用于dna免疫的icos表达载体的产生[0503]将编码人icos的全长cdna亚克隆到标准哺乳动物表达载体中。从转化的细菌中纯化出质粒dna，并通过紫外光谱法确定浓度。通过dna测序来确认亚克隆基因片段的dna序列。[0504]1.2通过兔和小鼠免疫产生icos特异性009、1167、1143和1138抗体[0505]1.2.1免疫接种运动[0506]为了进行免疫，使用从charlesriverlaboratoriesinternational公司获得的nmri小鼠和新西兰白兔(nzw)以及表达人源化抗体谱的罗氏专有转基因兔(使用icos衍生抗原免疫后)。在wo2000/46251、wo2002/12437、wo2005/007696、wo2006/047367、us2007/0033661和wo2008/027986中报道了包含人免疫球蛋白基因座的转基因兔。根据附录a“动物的住宿和照料指南”将动物圈养在aaalac认可的动物设施中。所有动物免疫接种方案和实验均已获得上巴伐利亚行政区政府批准(许可号55.2-1-54-2532-66-16和55.2-1-54-2532-90-14)，并根据德国动物福利法和欧洲议会和理事会指令2010/63进行。[0507]icos抗体009的产生[0508]6-8周龄的nmri小鼠(n＝5)用重组fc融合人icosecd分子(见实例1.1.1)进行了三次免疫，持续1.5个月。首次免疫时，将100μg溶于20mmhis/hiscl、140mmnacl(ph6.0)中的蛋白与等体积的完全freund佐剂(bddifco，#263810)混合，并进行腹膜内施用。除使用不完全freund佐剂(bddifco，#difc263910)外，在第21和42天以类似方式进行强化免疫。最终免疫后四至五周，使小鼠在无菌pbs中腹膜内接受约50μg免疫原，并且一天后在无菌pbs中静脉内接受25μg免疫原。48h后，无菌收获脾并且准备生成杂交瘤。第三次免疫后，通过elisa测试血清中的重组fc融合人icosecd(参见实例1.1.1)。[0509]icos抗体1183、1143(nzw兔)和1167(tg兔)的产生[0510]对12-16周龄的兔(nzw:n＝2，转基因兔:n＝2)以交替方案用编码全长人icos的质粒表达载体(参见实例1.1.3)和人icos表达细胞进行遗传免疫。[0511]所有动物在第0周、4周和12周通过皮内施用接受400μg载体dna，并伴有电穿孔(5个750v/cm的方形脉冲，持续10ms，间隔1s)。此外，在完全freund佐剂(cfa；bddifco，#263810)中乳化或与tlr激动剂的组合混合的3-5x107个人icos表达sr细胞(atcc；crl-2262)或活化人原代t细胞在第2周皮内注射，第8周肌内注射，并且第16周皮下注射。第28天(dna)、第42天(t细胞)、第56天(dna)和第70天(t细胞)以类似方式进行强化免疫，但将cfa用作细胞免疫的佐剂。[0512]从第3次免疫开始，在免疫后第6至8天取回血液(估计总血容量的10％)。制备用于通过elisa进行抗原特异性滴度确定的血清，并且分离外周血单核细胞，所述外周血单核细胞用作b细胞克隆过程中的抗原特异性b细胞的来源(参见实例1.2.2)。[0513]1.2.2兔b细胞克隆[0514]从免疫的野生型兔或人igg转基因兔中采集血液样品。将含有全血的edta用1×pbs稀释两倍，之后使用哺乳动物淋巴细胞(赛达兰实验室)根据制造商的说明书进行密度离心。用1×pbs洗涤pbmc两次。[0515]el-4b5培养基[0516]使用补充有10％fcs、2mm谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液、2mm丙酮酸钠、10mmhepes和0,05mmb-巯基乙醇的rpmi1640培养基。[0517]板的包被[0518]使用无菌6孔板(细胞培养级)以用抗原包被。[0519]包衣1，蛋白质：用碳酸盐包被缓冲液(0,1m碳酸氢钠，34mm碳酸氢二钠，ph9,55)将人icos蛋白抗原(id1486)稀释至最终浓度2μg/ml。将3ml该溶液加入到6孔板的每个孔中，并在室温孵育过夜。使用前，除去上清液，并用pbs洗涤孔3x。[0520]包衣2，细胞：将亲本cho-k1细胞系(包衣2a)或表达鼠icos的cho细胞(包衣2b)接种在6孔板中，并在培养箱中于37℃孵育，直至观察到汇合生长。[0521]从pbmc中去除巨噬细胞/单核细胞[0522]将pbmc接种在普通无菌6孔板(细胞培养级)上或已含有带cho细胞的细胞层的6孔板上，以通过非特异性粘附耗尽巨噬细胞和单核细胞。[0523]每个孔最多装有4ml培养基和至多6x10e6个来自经免疫兔的pbmc，并且使其在培养箱中在37℃结合1h。使用上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(pbl))进行抗原淘筛步骤，并且因此通过以800xg离心分离10min进行浓缩。将沉淀球粒重新悬浮在培养基中。[0524]抗原特异性b细胞的富集[0525]将血样的pbl调节至2x10e6个细胞/ml的细胞密度，并将3ml加入到用包衣1或2包被的6孔板的各孔(每3-4ml培养基中最多6x106个细胞)中。将板在培养箱中在37℃孵育60至90min。移除上清液并且通过用1xpbs小心地洗涤孔1-4次来移除非贴壁细胞。为了取回粘性抗原特异性b细胞，向6孔板的孔中加入1ml胰蛋白酶/edta溶液，并在37℃孵育5至10min。通过加入培养基停止孵育，并将上清液转移至离心瓶。用pbs洗涤孔两次，并将上清液与其他上清液合并。以800xg离心分离10min使细胞沉淀，并保存在冰上，直至免疫荧光染色。[0526]免疫荧光染色和流式细胞术[0527]利用抗iggfitc(abdserotec)和抗huckpe(dianova)抗体进行单细胞筛选。对于表面染色，在暗处在4℃，将来自耗尽和富集步骤的细胞与在pbs中的抗iggfitc和抗huckpe抗体一起孵育45min。在染色之后，将pbmc用冰冷的pbs洗涤两次。最后，将pbmc重悬于冰冷的pbs中并立即进行facs分析。在facs分析之前加入浓度为5μg/ml的碘化丙啶(bdpharmingen)以区分死细胞和活细胞。[0528]利用配备计算机和facsdiva软件的bectondickinsonfacsaria(bdbiosciences)进行单细胞分选。[0529]b细胞培养[0530]利用seeber等人,plosone2014,9(2),e86184所述的方法进行兔b细胞的培养。简言之，将单细胞分选的兔b细胞在96孔板中与200μl/孔的el-4b5培养基一起在培养箱中在37℃孵育7天，所述培养基含有pansorbin细胞(1:100000)(calbiochem)、5％兔胸腺细胞上清液(microcoat)和经γ辐照的鼠el-4b5胸腺瘤细胞(5×10e5个细胞/孔)。移除b细胞培养的上清液以用于筛选，并且立即收集剩余细胞并将其在-80℃冷冻于100μlrlt缓冲液(凯杰公司(qiagen))中。[0531]1.2.3v结构域的pcr扩增[0532]使用nucleospin8/96rna试剂盒(macherey&nagel；740709.4、740698)根据制造商的方案由b细胞裂解物(重悬于rlt缓冲液-qiagen-目录号79216)制备总rna。用60μl无rna酶水洗脱rna。6μl的rna用于使用superscriptiiifirst-strandsynthesissupermix(invitrogen18080-400)和oligodt引物根据制造商的说明通过逆转录酶反应生成cdna。所有步骤在hamiltonmlstarsystem上进行。以50μl的最终体积，利用accuprimesupermix(invitrogen12344-040)，使用4μl的cdna扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(vh和vl)，如wo2015/101588所述,对于野生型兔b细胞的重链使用引物rbhc.up和rbhc.do而对于野生型兔b细胞的轻链使用引物rblc.up和rblc.do,并且对于转基因兔b细胞的轻链使用引物bcpcr_fhlc_leader.fw和bcpcr_huckappa.rev(见表3)。所有正向引物(分别为vh和vl的)对信号肽具有特异性，而所有反向引物(分别为vh和vl的)对恒定区具有特异性。用于rbvh rbvl的pcr条件如下：热启动，94℃，5min；94℃20s、70℃20s、68℃45s的35个循环；以及在68℃最终延伸7min。用于huvl的pcr条件如下：热启动，94℃，5min；94℃20s、52℃20s、68℃45s的40个循环；以及在68℃最终延伸7min。将50μlpcr溶液中的8μl加载到48e-gel2(invitrogeng8008-02)上。阳性pcr反应液使用nucleospinextractii试剂盒(macherey&nagel；740609250)根据制造商的方案进行净化，并且在50μl洗脱缓冲液中洗脱。所有净化步骤在hamiltonmlstarletsystem上进行。[0533]表3：pcr引物的核苷酸序列[0534][0535]1.2.4杂交瘤的产生[0536]机械破坏制备的脾。洗涤细胞，通过离心分离收获细胞，并重新悬浮在10ml裂解缓冲液中。在4℃裂解5min后，加入40ml冷培养基(rpmi1640)，洗涤细胞并重新悬浮在50ml冷rpmi1640中。确定淋巴细胞数量后，加入p3x63-ag8.653细胞(在rpmi1640培养基中洗涤并重新悬浮)。将淋巴细胞与骨髓瘤细胞的比率选择为2:1。通过离心分离收集细胞，取出培养基，并通过加入peg1500(37℃；每108个淋巴细胞1.5mlpeg)开始两种细胞类型的融合。孵育1min后，分三个连续步骤(1ml、3ml、16ml)加入rpmi1640培养基。通过离心分离收集细胞，重新悬浮在1mlrpmi1640中，并置于6孔板的半固体培养基上。添加hat(次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷)用于选择融合的杂交瘤细胞。在37℃孵育9-13天后挑选克隆。[0537]将分离的克隆转移至96孔板并孵育72小时。上清液用于gitr特异性抗体的初步筛选和鉴定。为了进行二次筛选，将选定命中的细胞转移到24孔板中，进行分裂和扩增。为了μ-纯化igg，将上清液转移到2ml96深孔板上，同时将细胞储存在-150℃，直至进一步评价。[0538]1.2.5杂交瘤细胞抗体测序[0539]使用mini试剂盒从杂交瘤细胞沉淀球粒中提取并纯化mrna。然后根据制造商的说明，使用clonetechsmarterrace5′/3′试剂盒将纯化的mrna转录成cdna。使用简并vh和vl正义引物和基因特异性(ch/cl)反义引物，通过pcr从cdna中扩增出编码克隆009重链和轻链可变区的核酸序列。对pcr产物进行凝胶纯化，并且使用hd克隆试剂盒克隆到载体中，然后进行测序。对序列进行分析，以使其具有轻链或重链的抗体可变区。将阳性序列克隆到抗体表达载体中，并进行抗原特异性筛选。[0540]通过上述程序鉴定克隆009、1167、1143和1138为人icos特异性结合物。其可变区的氨基酸序列见下表4。[0541]表4：免疫源性icos抗体可变结构域的氨基酸序列。下划线是互补决定区(cdr)。[0542][0543][0544]1.3抗icos兔igg和小鼠杂交瘤igg抗体的制备、纯化及表征[0545]1.3.1抗icos兔igg抗体的克隆与表达[0546]为了重组表达家兔单克隆二价抗体，通过突出端克隆法(rshaun等人，biotechniques(1992)13,515-518；mzli等人，naturemethods(2007)4,251-256)将编码vh或vl的pcr产物作为cdna克隆到表达载体中。表达载体含有表达盒，所述表达盒由包括内含子a的5'cmv启动子和3'bgh聚腺苷酸化序列组成。除了表达盒之外，质粒还含有源于puc18的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，以用于在大肠杆菌(e.coli)中进行质粒扩增。使用了基本质粒的三种变体，一种质粒含有设计用以接受vh区的家兔igg恒定区，而两种另外的质粒含有用以接受vl区的兔或人κlc恒定区。[0547]使用重叠引物通过pcr扩增编码κ或γ恒定区和vl/vh插入序列的线性化表达质粒。将纯化的pcr产物与t4dna聚合酶一起孵育，这生成单链突出端。通过添加dctp停止反应。将质粒和插入序列合并并且与诱导位点特异性重组的reca一起孵育。将重组质粒转化到大肠杆菌中。第二天，挑取生长菌落并且通过质粒制备、限制性酶切分析和dna测序测试正确重组的质粒。抗icos克隆的氨基酸序列见表5。[0548]表5：兔igg形式的抗icos克隆的氨基酸序列[0549][0550][0551]对于抗体表达，在3l锥形瓶(corning，15l工作体积，37℃，8％v/vco2，80rpm，50mm振幅)中，将hek293f培养物扩增至1l体积(使用1％青霉素/链霉素、2mml-谷氨酰胺和0.1％pluronic的自由式f17)。转染前一天稀释培养物，并在1l培养基中将细胞数调节至106个细胞/ml。[0552]通过共转染分离的hc和lc质粒进行瞬时表达。在纯f17培养基中制备dna/fectopro(fectopro,polyplus)的mastermix，并孵育10分钟(根据polyplus方案)。将该转染混合物滴加到细胞悬液中，并立即加入增强剂。转染后18小时，用3g/l葡萄糖喂养培养物。1周后收获上清液，并通过以4000xg离心分离来清除。向清除的上清液中加入1m甘氨酸和300mmnacl，并通过亲和色谱进行纯化。[0553]初始捕获步骤通过以下方式在室温进行：将1l上清液以0.7ml/min的流速加载到25mlmabselectsure柱(gehealthcare)上，在连接至灌注系统的ph7.4的1xpbs中平衡。以3ml/min的流速用ph7.4的1xpbs洗涤柱，直至280nm的紫外吸收达到稳定的基线。在含有1.2ml0.5m组氨酸/hcl(ph6)的试管中，以3ml/min的流速作为3ml级分用50mm醋酸盐/naoh(ph3.2)洗脱结合的蛋白。[0554]将合并的级分浓缩并分别施加至superdex20016/60或superdex10010/300递增柱，所述柱在ph6.0的20mm组氨酸/hcl、140mmnacl中平衡，且流速为0.5或1ml/min。通过dionexultimate3000系列hplc系统(配备tosohtskgelg5000pwxl10μm7.8x300mm柱，流速为0.75ml/min)上的尺寸排阻色谱法进行蛋白质聚集分析。抗体的纯度和分子量通过sds-page分析，或通过微流控芯片毛细管电泳(labchipgx)使用含或不含dtt的缓冲液分析。[0555]1.3.2杂交瘤单克隆抗体的制备[0556]为了从杂交瘤培养物制备单克隆抗体，以2×105个细胞/ml接种细胞，并在500ml培养基中培养7天。杂交瘤上清液经无菌过滤，并通过蛋白质a亲和色谱和尺寸排阻色谱法纯化。合并根据尺寸排阻色谱法得到的含有单体fc融合蛋白的级分，并根据280nm时计算的消光系数，使用nanodrop系统(peqlabnd-1000)通过紫外法确定蛋白质浓度。通过dionexultimate3000系列hplc系统(配备tosohtskgelg5000pwxl10μm7.8x300mm柱，流速为0.75ml/min)上的尺寸排阻色谱法进行蛋白质聚集分析。抗体的纯度和分子量通过sds-page分析，或通过微流控芯片毛细管电泳(labchipgx)使用含或不含dtt的缓冲液分析。[0557]表6总结抗icosigg1抗体的产量和最终含量。[0558]表6：抗icos兔和小鼠igg克隆的生化分析[0559]分子产率[mg/l]单体[％]asec纯度[％]ce-sds14(009的muigg)1.08》99》988(1167的rbigg)1.07》99》9820(1143的rbigg)1.01》99》9718(1138的rbigg)1.02》99》96[0560]实例2[0561]抗icos抗体的表征[0562]2.1在人icos上的结合[0563]2.1.1表面等离子体共振(亲合力 亲和力)[0564]通过表面等离子体共振(spr)评估免疫源性icos特异性抗体与重组单体icosfc(kih)的结合。所有spr实验均采用biacoret200，在25℃下使用hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta、0.005％表面活性剂p20，biacore，freiburg/germany)。[0565]使用biacoret200评价软件(vaa，biacoreab，乌普萨拉/瑞典)推导动力学常数，以通过数值积分拟合1:1langmuir结合的速率方程，并用于定性估计亲合力。[0566]在同一实验中，确定免疫源性icos特异性抗体分子8、分子14、分子18和分子20与重组人icos之间相互作用的亲和力。为此，使用avi(glndifeaqkiewhe)标签对人icos的胞外域进行了亚克隆(序列参见表7)。[0567]表7：单体人icosfc(kih)avi标签的氨基酸序列[0568][0569][0570]如上所述进行fc融合蛋白的蛋白质生产。通过螯合色谱，然后进行尺寸排阻色谱，从细胞培养上清液中纯化分泌蛋白。[0571]第一个色谱步骤在以20mm磷酸钠、500nm氯化钠(ph7.4)平衡nintasuperflow软片(5ml，qiagen)上进行。通过在12个柱体积上施加从5％至45％的洗脱缓冲液(20mm磷酸钠，500nm氯化钠，500mm咪唑，ph7.4)梯度进行洗脱。[0572]将蛋白质浓缩并过滤，然后加载至用2mmmops、150mm氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠溶液(ph7.4)平衡的hiloadsuperdex75柱(gehealthcare)。[0573]使用两种设置进行亲和力测定。[0574]设置1：使用标准胺偶联试剂盒(biacore，freiburg/germany)，在ph4.5下，在cm5芯片上直接偶联抗兔fc抗体(jacksonimmunoresearch，cambridgeshire/uk)。固定化水平为约9000ru。在5.0nm浓度下捕获兔免疫源性icos抗体(分子8，分子18，分子20)30秒。重组人icosfc(kih)在7.5至600nm浓度范围内以60μl/分钟的流速通过流动池，时间为120秒。再监控解离720秒。通过减去在参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。此处，抗原与固定化抗兔fc抗体一起流过表面，但在表面上注射了hbs-ep而不是抗体。[0575]设置2：使用标准胺偶联试剂盒(biacore，freiburg/germany)，在ph5.0下，在cm5芯片上直接偶联抗小鼠igg抗体(gehealthcare,chicago/us)。固定化水平为约5000ru。在5.0nm浓度下捕获小鼠免疫源性icos抗体(分子14)30秒。重组人icosfc(kih)在7.5至600nm浓度范围内以60μl/分钟的流速通过流动池，时间为120秒。再监控解离720秒。通过减去在参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。此处，抗原与固定化抗小鼠igg抗体一起流过表面，但在表面上注射了hbs-ep而不是抗体。[0576]使用biaeval软件(gehealthcare)拟合1:1langmuir结合，确定抗icos抗体与人icosfc(kih)相互作用的亲和常数。结果表明，分子8、分子14、分子18和分子20与人icos结合(表8)。[0577]表8：抗icos抗体与重组人icos的结合[0578][0579]2.2配体阻断性[0580]进行了基于细胞的受体配体结合测定，以确定抗icos抗体阻断icos与其配体icoslg结合的能力。[0581]生物素化的重组人icos蛋白按照实例2.1中重组人icosfc(kih)的描述制备。[0582]将编码人icos配体的全长cdna亚克隆到哺乳动物表达载体中，并转染到cho-k1(atcc，ccl-61)中，以产生重组icos配体表达细胞(cho-icoslg)。使用lipofectamineltx试剂(invitrogen,#15338100)，按照生产商的方案来转染质粒。将稳定转染的icoslg阳性cho-k1细胞保持在补充10％胎牛血清(gibco,#16140063)和1％glutamax补充剂(gibco；#31331-028)的dmem/f-12(gibco,#11320033)中。转染后两天，将嘌呤霉素(invivogen；#ant-pr-1)添加至6μg/ml。初始筛选后，使用bdfacsariaiii细胞分选仪(bdbiosciences)对icoslg细胞表面表达最高的细胞进行分选，并培养以建立稳定的细胞克隆。使用apc抗人cd275抗体(biolegend；#309407)，为期4周进行facs分析，确认了表达水平及稳定性。[0583]用25μl/1x104个cho-icoslg细胞/孔包被384孔聚-d-赖氨酸板(corning，#356662)，密封并在37℃孵育过夜。最终测定浓度为150ng/ml的生物素化人icosfc(kih)与相应的抗icos抗体预孵育(14个稀释步骤1:2，测定起始浓度4μg/ml)，并在室温孵育1h。[0584]细胞包被的板离心分离后，向细胞中加入25μl/孔的预孵育样品，并在4℃孵育2h。用pbst缓冲液(dpbs,pan,p04-36500 0,1％tween20)洗涤3x90μl/孔后，在1xpbs(50μl/孔，sigmacat.no:g5882)中在室温用0.05％戊二醛将每个孔孵育10min，以固定细胞-样品混合物。[0585]用pbst缓冲液洗涤3x90μl/孔后，通过添加链霉亲和素-pod缀合物(roche,#11089153001,1:4000)并在rt下孵育1h，检测细胞表面上与人icos-l相互作用的人icos。用pbst缓冲液再洗涤3x90μl/孔后，加入25μl/孔的tmb底物(rochediagnosticsgmbh,#11835033001)达5min。测量在370/492nm下进行(表9)。[0586]表9：通过酶联免疫吸附测定法来确定抗icos克隆的配体结合特性[0587]分子来源配体阻断14小鼠免疫是8兔免疫是20兔免疫是18兔免疫是[0588]2.3表位表征[0589]由免疫源性抗icos抗体识别的表位通过表面等离子体共振来表征。[0590]2.3.1竞争结合(表面等离子体共振)[0591]为了分析抗icos抗体的人受体的竞争性结合，将生物素化的人icosfc(kih)直接偶联到链霉亲和素(sa)传感器芯片的不同流动池上。所用的固定化水平高达600共振基(ru)。免疫源性抗icos克隆分子8、分子14、分子18和分子20在2至500nm(3倍稀释)浓度范围内以30μl/分钟的流速通过流动池，历时120秒。省略解离，并且使第二抗icos抗体历时90秒以30μl/min的流速以100nm的浓度通过。通过减去在参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。[0592]spr实验均采用biacoret200，在25℃使用hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta、0.005％表面活性剂p20，biacore，freiburg/germany)。竞争结合实验表明，免疫源性抗icos克隆分子8、分子14和分子20与分子18共享不同的表位结合，因为这两种抗体可以同时结合人icosfc(kih)(表10)。[0593]表10：竞争性结合实验总结[0594][0595]o＝无约束力；1＝结合；x＝未确定，因为第二次注射含有与固定在芯片上的抗体相同的抗体[0596]实例3[0597]靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)的双特异性构建体的产生3.1靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)的双特异性单价抗原结合分子(1 1形式)的产生[0598]通过应用杵臼结构技术允许两个不同重链的组装，制备了具有对icos和对fap单价结合的双特异性激动性icos抗体。如国际专利申请号wo2010/145792a1所述，应用crossmab技术以减少错误配对的轻链的形成。[0599]fap结合物(4b9)的形成和制备描述于wo2012/020006a2中，该专利以引用方式并入本文。[0600]双特异性构建体与icos和fap单价结合(图1a)。它含有fap抗原结合结构域的交叉fab单元(vlch1)，其与抗icoshuigg1(含有y349c/t366s/l368a/y407v突变)的臼重链融合。fc杵重链(含有s354c/t366w突变)与包含抗icos抗原结合结构域的fab融合。通过将靶向的抗fap-fc臼与抗icos-fc杵链结合容许产生异二聚体，其包括特异性结合fap的fab和特异性结合icos的fab。[0601]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0602]得到的双特异性二价构建体类似于图1a中描述的构建体。成熟的双特异性单价抗icos(1167)/抗fap(4b9)huigg1p329glalakih抗体(1 1形式)的氨基酸序列示于表11中。[0603]表11：成熟的双特异性单价抗icos(1167)/抗fap(4b9)huigg1p329glalakih抗体(分子10)的氨基酸序列[0604][0605]双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:1:1:1的比率(“载体杵重链”:“载体轻链1”:“载体臼重链”:“载体轻链2”)来转染细胞。[0606]为了在1l摇瓶中生产，在转染前24小时接种106个细胞/mlhek293f细胞。使用编码感兴趣靶蛋白的质粒进行瞬时转染。在纯f17培养基中制备dna/fectopro的mastermix，并孵育10分钟。将该转染混合物滴加到细胞悬液中，并立即加入增强剂。转染后18小时，用3g/l葡萄糖喂养培养物。[0607]培养7天后，通过在210xg下离心分离15min收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至最终浓度0.01％(w/v)，并保持在4℃。[0608]通过使用蛋白质a-sepharosetm亲和色谱法(gehealthcare,sweden)和superdex200尺寸排阻色谱法的亲和色谱法，分两步从上清液中纯化其中所含的重组抗体。简言之，将含有澄清培养上清液的抗体置于用pbs缓冲液(10mmna2hpo4、1mmkh2po4、137mmnacl和2.7mmkcl，ph7.4)平衡的mabselectsure蛋白质a(5-50ml)柱上。用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白质。用ph3.0的50mm柠檬酸盐缓冲液洗脱抗体。用ph9.0的2mtris缓冲液中和含蛋白级分。然后，合并洗脱的蛋白级分，用amicon超离心过滤装置(mwco：30k，millipore)浓缩，并加载到superdex200hiload26/60凝胶过滤柱(gehealthcare,sweden)上，该凝胶过滤柱用20mm组氨酸、140mmnacl(ph6.0)平衡。通过使用根据pace等人,proteinscience4(1995)2411-2423的基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数确定280nm处的光密度(od)，来确定各种级分的蛋白质浓度，其中320nm处的od作为本底校正。将单体抗体级分混合、速冻并储存在-80℃。提供部分样品用于随后的蛋白质分析和表征。[0609]使用nanodrop分光光度计(thermofisher)对纯化的蛋白质进行量化，并通过在变性和还原条件下进行ce-sds(labchipgx,perkinelmer)和分析性sec(up-sw3000,toshobioscience)进行分析。在还原条件下，使用labchip设备通过比较表观分子尺寸与分子量标准来鉴定与igg相关的多肽链。通过与超高效液相色谱系统(uplc)偶联的最先进的电喷雾-四极杆飞行时间(esi-q-tof)质谱仪(brukermaxis)进行分子同一性确定。[0610]通过蛋白质a分析所有构建体的表达水平。在此类非优化瞬时表达实验中，每升细胞培养物上清液的平均蛋白质产量为25mg至86mg纯化蛋白质(见表12、14、16、18、21、31和33)。[0611]表12：双特异性单价抗icos/抗fapigg1p329glala抗原结合分子(分子10)的生化分析[0612][0613]3.2靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)的双特异性单价抗原结合分子(1 1头至尾形式)的产生[0614]已制备了具有对icos单价结合且对fap单价结合的双特异性激动剂4-1bb抗体，也称为1 1头至尾形式，如图1b所示。[0615]在本实例中，构建体的第一重链hc1包含以下组分：后接fc杵的抗icos结合物的vhch1在其c末端与抗fap结合物的vl融合。第二重链hc2包含fc臼，在其c末端与抗fap结合物的vh融合。fap结合剂4b9的形成和制备描述于wo2012/020006a2中，该专利以引用方式并入本文。按照实例1所述产生抗icos(1167)的结合物。[0616]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0617]双特异性1 1抗icos抗faphuigg1p329glala抗体是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:1:1的比率(“载体杵重链”:“载体轻链”:“载体臼轻链”)转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0618]1 1头至尾抗icos、抗fap构建体的氨基酸序列见表13。[0619]表13：成熟的双特异性1 1头至尾抗icos(1167)/抗fap(4b9)huigg1p329glalakih抗体(分子11)的氨基酸序列[0620][0621]表14：双特异性1 1头至尾抗icos(1167)/抗fap(4b9)igg1p329glala抗原结合分子(分子11)的生化分析[0622][0623]3.3靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)且对于icos为二价而对于fap为单价(2 1形式)的双特异性抗原结合分子的产生[0624]制备了具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性激动性icos抗体(也称为2 1)，如图1c所示。[0625]在本实例中，构建体的第一重链hc1包含以下组分：后接fc杵的抗icos结合物的vhch1在其c末端与抗fap结合物的vl融合。第二重链hc2包含后接fc臼的抗icos的vhch1，在其c末端与抗fap结合物的vh融合。如实例1所述，产生了针对icos(009、1138、1143和1167)的结合物。[0626]兔抗体分子20和分子18的同源性建模表明，vh位置199和251(kabat35a和50)的两个半胱氨酸正在cdr-h1与cdr-h2之间形成二硫键，而vl框架位置726(kabat80)的半胱氨酸是游离的并暴露于溶剂。在这两种情况下，我们都选择最保守的选项，即用丝氨酸替代所有不需要的半胱氨酸，即c199s、c251s和c726s。由于我们预期抗体分子20将需要人源化，我们添加了两个额外的变体，其中进行的取代与最接近的匹配人种系ighv3-23*01，即c199s和c251v一致。相应地改变了位置252、296和297(kabat51、62和63)，以评价cdr-h2中的这些取代是否会被耐受而不损失结合亲和力，并具有增加人性的益处。如果未明确说明，则残留物指数以wolfguy编号给出。表15总结分子20和分子18的氨基酸序列的变化以及变体分子的数量。[0627]表15：分子18和分子20的氨基酸变体[0628][0629]为了验证分子14中框架突变的影响，产生了2 1形式的两种变体(分子15和分子40)。[0630]fap结合物(4b9)的形成和制备描述于wo2012/020006a2中，该专利以引用方式并入本文。根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0631]双特异性2 1抗icos抗faphuigg1p329glala抗体是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:2:1的比率(“载体杵重链”:“载体轻链”:“载体臼轻链”)转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0632]2 1抗icos、抗fap构建体的氨基酸序列可见于表16中。[0633]表16：成熟的双特异性2 1抗icos/抗fap(4b9)huigg1p329glalakih抗体(分子11)的氨基酸序列[0634][0635][0636][0637][0638][0639][0640][0641]表17：具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性构建体(2 1icos/fap人igg1p329glala)的生化分析[0642][0643][0644]3.4靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)且对于icos为二价而对于fap为单价的双特异性抗原结合分子(2 1crossfab-iggp329glala)的产生[0645]制备了具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性激动性icos抗体(也称为2 1iggcrossfab(fap结合物中的vh/vl交换))，如图1d所示。[0646]在本实例中，构建体的第一重链hc1包含以下组分：抗fap抗原结合结构域的vlch1，然后是抗icos抗原结合结构域的vhch1和fc杵。第二重链hc2包含抗icos的vhch1，然后是fc臼。按照实例1所述产生抗icos(1167)的抗体。fap抗体(4b9)的形成和制备描述于wo2012/020006a2中，该专利以引用方式并入本文。[0647]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0648]双特异性2 1抗icos抗faphuigg1p329glala抗体是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:2:1:1的比率(“载体重链(vl-ch1-vh-ch1-ch2-ch3)”:“载体轻链(vl-cl)”:“载体重链(vh-ch1-ch2-ch3)”:“载体轻链(vhcl)”转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0649]这些2 1抗icos、抗fapcrossfab-iggp329glala构建体的氨基酸序列可见于表18中。[0650]表18：成熟双特异性2 1抗icos(1167)/抗fap(4b9)crossfab-iggp329glala的氨基酸序列[0651][0652][0653][0654]表19：具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性构建体(2 1抗icos、抗fapcrossfab-iggp329glala)的生化分析[0655][0656]3.5靶向icos和成纤维细胞活化蛋白(fap)且对于icos为二价而对于fap为单价的双特异性抗原结合分子(反向2 1crossfab-iggp329glala)的产生[0657]制备了具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性激动性icos抗体(也称为2 1iggcrossfab，反向(fap结合物中的vh/vl交换))，如图1e所示。[0658]在本实例中，构建体的第一重链hc1包含以下组分：抗icos结合物的vhch1，然后是抗fap结合物的vlch1和fc杵。第二重链hc2包含抗icos的vhch1，然后是fc臼。按照实例1所述产生抗icos(1167)结合物。fap结合物(4b9)的形成和制备描述于wo2012/020006a2中，该专利以引用方式并入本文。[0659]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0660]双特异性2 1抗icos抗faphuigg1p329glala反向抗体是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:2:1:1的比率(“载体重链(vh-ch1-vl-ch1-ch2-ch3)”:“载体轻链(vl-cl)”:“载体重链(vh-ch1-ch2-ch3)”:“载体轻链(vh-cl)”转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0661]2 1抗icos、抗fapcrossfab-iggp329glala反向构建体的氨基酸序列可见于表20中。[0662]表20：成熟双特异性2 1抗icos(1167)/抗fap(4b9)crossfab-iggp329glala的氨基酸序列[0663][0664][0665]表21：具有对icos二价结合且对fap单价结合的双特异性构建体(反向2 1icos/fap人igg1p329glala)的生化分析[0666][0667]实例4[0668]小鼠和兔抗icos抗体的人源化[0669]4.1方法[0670]通过查询人v区和j区序列的blastp数据库来鉴定鼠输入序列(裁剪至可变部分)的合适的人受体框架。选择人受体框架的选择标准是序列同源性、相同或相似的cdr长度和人种系的估计频率，而且还有vh-vl结构域界面上某些氨基酸的保守性。在种系鉴定步骤之后，将鼠输入序列的cdr移植到人受体框架区上。这些初始cdr移植物和亲本抗体之间的每个氨基酸差异被评估对相应可变区的结构完整性的可能影响，并且在认为适当时引入对亲本序列的“回复突变”。结构评估基于亲代抗体和人源化变体两者的fv区同源性模型，该模型通过内部抗体结构同源性建模方案创建得到，其使用bioviadiscoverystudioenvironment版本17r2实现。在一些人源化变体中，包括“正向突变”，即，将亲本结合物的给定cdr位置上发生的原始氨基酸改变为人受体种系的等效位置上发现的氨基酸的氨基酸交换。目的是增加人源化变体的总体人特征(在框架区之外)，以进一步降低免疫原性风险。[0671]内部开发的经由电脑模拟的工具用于预测配对的vh和vl人源化变体的vh-vl结构域方向(wo2016/062734)。将结果与亲本结合物的预测vh-vl结构域取向进行比较，以选择在几何结构上与原始抗体接近的构架组合。基本原理是检测vh-vl界面区中可能的氨基酸交换，这些交换可能导致两个结构域的配对发生破坏性变化，进而对结合特性产生不利作用。[0672]4.2受体框架的选择及其适应[0673]009的人源化[0674]表1：icos克隆009的受体框架[0675][0676]后cdr3框架区改编自人ighj种系ighj6*01/02(yyyyygmdvwgqgttvtvss,seqidno:120)和人igkj种系igkj2*01(ytfgqgtkleik,seqidno:121)。与受体框架相关的部分以粗体显示。[0677]基于结构考虑，在h40(p》s)、h42(g》e)、h49(g》a)、h94(r》w)、h105(k》a)[vh1]、h40(p》s)、h42(g》e)、h93(a》t)、h94(r》w)、h105(k》a)[vh2]、l38(q》h)、l43(a》g)、l49(y》w)、l100(q》s)[vl1]和l38(q》h)、l43(a》g)、l49(y》w)、l100(q》s)[vl2]位引入了从人受体框架到亲本结合物中的氨基酸的回复突变。[0678]此外，h60(s》a)、h61(d》a)[vh1]、h60(s》a)[vh2]、l24(k》q)[vl1]和l24(k》r)[vl2]位被鉴定为正向突变(kabat编号)有希望的候选者。[0679]1138的人源化[0680]表23：icos克隆1138的受体框架[0681]兔v区种系移植物变体人受体v区种系的选择vhighv1s40*01vhg1ighv3-23*03vligkv1s1*01vlg1igkv1-39*01[0682]后cdr3框架区改编自人ighj种系ighj1*01(aeyfqhwgqgtlvtvss,seqidno:122)和人igkj种系igkj4*01/02(ltfgggtkveik,seqidno:1223)。与受体框架相关的部分以粗体显示。[0683]基于结构考虑，在h71(r》k)、h72(d》t)、h73(n》s)、h76(n》t)、h91(y》f)、h94(k》r)[vh1]和l1(d》a)、l42(k》q)、l43(a》p)[vl1]位引入了从人受体框架到亲本结合物中的氨基酸的回复突变。此外，在vh的一个变体中，n末端被反向突变(从v》q中去除h1和突变h2)，并且在vh的一个变体中，兔框架的h75位的缺口被重新引入。[0684]此外，位置h61(s》d)、h62(w》s)、h63(a》v)[vh1]和l24(q》r)[vl1]被鉴定为前向突变(kabat编号)的有希望的候选者。[0685]1143的人源化[0686]表24：icos克隆1143的受体框架[0687]兔v区种系移植物变体人受体v区种系的选择vhighv1s40*01vhg1ighv3-23*03vligkv1s4*01vlg1igkv1-39*01[0688]后cdr3框架区改编自人ighj种系ighj1*01(aeyfqhwgqgtlvtvss,seqidno:122)和人igkj种系igkj4*01/02(ltfgggtkveik,seqidno:123)。与受体框架相关的部分以粗体显示。[0689]基于结构考虑，在h48(v》i)、h49(s》g)、h71(r》k)、h72(d》t)、h73(n》s)、h76(n》t)、h91(y》f)、h94(k》r)[vh1]和l42(k》q)、l43(a》p)[vl1]位引入了从人受体框架到亲本结合物中的氨基酸的回复突变。此外，在vh的两个变体中，n末端被回复突变(从v》q中去除h1和突变h2)，并且在vh的两个变体中，兔框架的h75位的缺口被重新引入。[0690]此外，位置h61(t》d)[vh1]和l24(q》r)[vl1]被鉴定为前向突变(kabat编号)的有希望的候选者。[0691]4.3人源化变体[0692]回复突变冠以前缀b，正向突变冠以前缀f，例如bm48i是指在48位(kabat编号)上从蛋氨酸到异亮氨酸的回复突变(人种系氨基酸到亲本抗体氨基酸)。[0693]表25：克隆009的变体[0694][0695]表26：克隆1138的变体[0696][0697][0698]表27：克隆1143的变体[0699][0700]人源化变体的氨基酸序列可见下表28。[0701]表28：克隆icos009、1138和1143的人源化变体的氨基酸序列[0702][0703][0704][0705][0706]4.4人源化变体的克隆和表达[0707]重链和轻链dna序列的可变区在框架中亚克隆，恒定重链或恒定轻链预插入各自的受体哺乳动物表达载体。蛋白质表达由mpsv启动子驱动，并且合成的polya信号序列存在于cds的3’端。选定抗icos人源化变体的氨基酸序列示于表29中。[0708]表29：人igg形式的亲本和选定抗icos人源化变体的氨基酸序列[0709][0710][0711][0712][0713][0714][0715]人igg形式的人源化变体是通过使用expifectamine293(thermofisher)将expi293f(thermofisher)细胞与哺乳动物表达载体共转染而产生的。用相应的表达载体以1:1的比率(“载体重链”:“载体轻链”)转染细胞。[0716]为了在48深孔板中产生，在转染当天接种了2.5e6个细胞/ml的expi293f细胞。使用编码感兴趣靶蛋白的质粒进行瞬时转染。在opti-mem培养基(thermofisher)中制备dna/expifectamine293的mastermix，孵育5分钟，并加入细胞悬液中。转染后24小时，向每个孔中加入10μl增强子1(thermofisher)和100μl增强子2(thermofisher)。[0717]培养5天后，通过在1200xg下离心分离50min收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.2μm过滤器)，并保持在4℃。[0718]分泌的蛋白质通过在96孔形式的液体处理平台上使用蛋白质a亲和色谱法的亲和色谱法从细胞培养上清液中纯化。对于亲和色谱法，将上清液加载到proplusphytip柱(mabselectsuretm)(cv＝40μl；尖端体积500μlphynexus)上，所述柱用2倍290μl20mm磷酸钠、20mm柠檬酸钠(ph7.5)来平衡。用4倍300μl20mm磷酸钠、20mm柠檬酸钠(ph7.5)来洗涤除去未结合的蛋白，并且用2倍150μl20mm柠檬酸钠、100mm氯化钠、100mm甘氨酸(ph3.0)洗脱靶标蛋白。通过加入ph8.0的30μl0.5m磷酸钠中和蛋白质溶液。[0719]使用nanodrop分光光度计(thermofisher)对纯化的蛋白质进行量化，并通过在变性和还原条件下进行ce-sds(labchipgx,perkinelmer)和分析性sec(up-sw3000,toshobioscience)进行分析。在还原条件下，使用labchip设备通过比较表观分子尺寸与分子量标准来鉴定与igg相关的多肽链。[0720]实例5[0721]抗cea抗体a5b7的人源化变体的产生[0722]5.1方法[0723]抗cea抗体a5b7由例如m.j.banfield等人(proteins1997,29(2),161-171)公开，并且其结构可参见蛋白质结构数据库(pdb)中的pdbid:1clo(www.rcsb.org，h.m.berman等人，theproteindatabank，nucleicacidsresearch，2000，28，235-242)。该条目包括重链和轻链可变结构域序列。为鉴定抗cea结合剂a5b7的人源化过程中的合适的人受体框架，采用一种经典方法，即寻找具有高序列同源性的受体框架，在该框架上嫁接cdr，并且评估可以设想的回复突变。更明确地说，判断鉴定出的构架与亲代抗体的每个氨基酸差异对结合剂的结构完整性的影响，并且在适当时引入朝向亲代序列的回复突变。结构评估基于亲代抗体及其人源化版本的fv区同源性模型，该模型通过内部抗体结构同源性建模工具创建得到，该工具使用bioviadiscoverystudioenvironment4.5版实现。[0724]5.2受体框架的选择及其适应[0725]受体框架的选择如下表30所示：[0726]表30：受体框架[0727][0728]cdr3后框架区改编自用于重链的人j元件种系igjh6，并且序列类似于用于轻链的kappaj元件igkj2。[0729]基于结构上的考虑，在重链的93位和94位引入从人受体框架到亲代结合剂中的氨基酸的回复突变。[0730]5.3所得人源化cea抗体的vh和vl区[0731]所得人源化cea抗体的vh结构域可参见下表31，并且所得人源化cea抗体的vl结构域可参见下表32。[0732]表31：人源化cea抗体的vh结构域的氨基酸序列(基于人受体框架ighv3-23或ighv3-15)[0733][0734][0735]对于重链，发现初始变体3-23a5-1适用于结合测定(但表现出的结合能力略低于亲代鼠抗体)，并且被选作进一步修饰的起点。与人源化变体3-23a5-1相比，基于ighv3-15的变体表现出更低的结合活性。[0736]为恢复亲代嵌合抗体的全部结合活性，创建了变体3-23a5-1a、3-23a5-1c和3-23a5-1d。还测试了变体3-23a5-1，cdr-h2的长度能否适应人受体序列的，但该构建体完全丧失结合活性。由于cdr-h2(asn53-gly54)中存在假定的脱酰胺基热点，我们将该基序改为asn53-ala54。另一个可能的热点asn73-ser74回复突变为lys73-ser74。因此，创建了变体3-23a5-1e。[0737]表32：人源化cea抗体的vl结构域的氨基酸序列(基于人受体框架igkv3-11)。[0738][0739][0740]轻链基于人igkv3-11受体框架发生人源化。在系列a5-l1至a5-l4中，了解到变体a5-l1表现出良好的结合活性(但略低于亲代抗体)。cdr-l1的部分人源化(变体a5-l2；kabat位置30和31处)完全消除了结合。同样，cdr-h2的人源化(变体a5-l3；kabat位置50至56处)也完全消除了结合。位置90(变体a5-l4)对结合特性具有显著贡献。该位置处的组氨酸对于结合很重要。因此，选择变体a5-l1进行进一步修饰。[0741]系列a5-l1a至a5-l1d解决了恢复亲代嵌合抗体的全部结合潜能所需的回复突变的问题。变体a5-l1a显示，kabat位置1、2、整个框架2以及kabat位置71的回复突变未增加任何更多结合活性。变体a5-l1b和a5-l1c定位了那些位置的子集，并确认它们不改变结合特性。在kabat位置46和47处发生回复突变的变体a5-l1d表现出最佳的结合活性。[0742]5.4人源化a5b7抗体的选择[0743]基于vh和vl的新型人源化变体，根据wo2012/130831a1中所述的方法，将新型cea抗体表达为具有效应子沉默fc(p329g；l234,l235a)的huigg1抗体，以消除与fcγ受体的结合；检测它们与mkn45细胞上表达的cea的结合，并且与相应的亲代鼠a5b7抗体进行比较。[0744]表33：表达为huigg1_lala_pg抗体的vh/vl组合[0745]a5-l1aa5-l1ba5-l1ca5-l1d3-23a5-1ap1ae2164p1ae2165p1ae2166p1ae21673-23a5-1c‑‑p1ae2176p1ae21773-23a5-1dp1ae2179-p1ae2181p1ae2182[0746]mkn45(dsmzacc409)是表达cea的人胃腺癌细胞系。在高级rpmi 2％fcs 1％glutamax中培养细胞。检查mkn-45细胞的活力，并且细胞重悬并调整至密度为1mio细胞/ml。将100μl该细胞悬液(含0.1mio细胞)接种到96孔圆底板中。在400xg下将孔板离心4min，并且除去上清液。然后将40μl稀释的抗体或facs缓冲液加入细胞中，并且在4℃下孵育30分钟。孵育后，用facs缓冲液(每孔150μl)洗涤细胞两次。然后将20μl稀释的二级pe抗人fc特异性二抗(109-116-170,jacksonimmunoresearch)加入细胞中。将细胞在4℃下再孵育30分钟。为去除未结合的抗体，用facs缓冲液(每孔150μl)将细胞再洗涤两次。为固定细胞，将100μlfacs缓冲液(含1％pfa)加入孔中。测量前，将细胞重悬于150μlfacs缓冲液中。使用bd流式细胞仪测量荧光。所有测试的结合剂均能够与mkn45细胞结合，但与亲代a5b7抗体相比，结合能力略有下降。在所有测试的变体中，克隆p1ae2167具有最佳结合力，因此被选择用于进一步开发。[0747]5.5使用表面等离子体共振(biacore)确定鼠cea-抗体a5b7的人源化变体的fab片段对人cea的亲和力[0748]使用biacoret200仪器，通过表面等离子体共振评估鼠cea抗体a5b7的人源化变体的fab片段对人cea的亲和力。在cm5芯片上，通过标准胺偶联将人cea(hun(a2-b2)a-avi-hisb)以40nm的浓度固定化到流通池2上，持续30s，达到约100ru。随后将鼠cea抗体a5b7的人源化变体的fab片段作为分析物(3倍稀释液，浓度范围为500-0.656nm)注入，接触时间为120s，解离时间为250s或1000s，并且流速为30μl/min。通过在60s内2次脉冲注入10mm甘氨酸/hcl(ph2.0)，实现人cea(hun(a2-b2)a-avi-hisb)水平的再生。数据针对未固定化的流通池1和零浓度分析物进行双重参考。将分析物的传感图拟合到简单的1:1langmuir相互作用模型。人cea(a2结构域)的亲和常数[kd]汇总于下表34中。[0749]表34：代表鼠cea抗体a5b7的不同人源化变体的fab片段对人cea(a2结构域)的亲和常数。[0750][0751][0752]鼠cea抗体a5b7的人源化变体的亲和力低于亲代鼠抗体。选择来源于p1ae2167的fab片段p1ae4138(重链包含vh变体3-23a5-1a并且ckappa轻链包含vl变体a5-l1d)作为最终的人源化变体。此外，为去除脱酰胺位点，在vh结构域引入在kabat位置54(g54a)处的甘氨酸到丙氨酸的突变，从而得到vl变体3-23a5-1e。将最终的人源化抗体(重链包含vh变体3-23a5-1e并且ckappa轻链包含vl变体a5-l1d)命名为a5h1el1d或hua5b7。[0753]实例6[0754]靶向icos和癌胚抗原相关细胞粘附分子(cea)的双特异性抗原结合分子的产生[0755]6.1靶向icos和癌胚抗原相关细胞粘附分子(cea)的双特异性单价抗原结合分子(1 1形式)的产生[0756]通过应用杵臼结构技术允许两个不同重链的组装，制备了具有对icos和对cea单价结合的双特异性激动性icos抗体。如国际专利申请号wo2010/145792a1所述，应用crossmab技术以减少错误配对的轻链的形成。图1f至图1h示出单价结合icos和单价结合cea的双特异性抗原结合分子的示意图。[0757]对于cea抗原结合结构域，克隆medi-565的vh和vl序列获自国际专利申请号wo2014/079886al。实例5中描述cea抗体(a5h1el1d)的产生和制备。对于icos抗体jmab136，克隆jmab136的vh和vl序列获自专利us2008/0199466al。[0758]分子37含有cea抗体的交叉fab单元(vlch1)，所述fab单元与huigg1的杵重链(含有s354c/t366w突变)融合。fc臼重链(含有y349c/t366s/l368a/y407v突变)与结合icos的fab单元融合(图1f)。分子41含有cea抗体的交叉fab单元(vlch1)，所述fab单元与huigg1的臼重链(含有y349c/t366s/l368a/y407v突变)融合。fc杵重链(含有s354c/t366w突变)与结合icos的fab片段融合(图1g)。分子42和分子43含有icos抗体的交叉fab单元(vlch1)，所述fab单元与huigg1的臼重链(含有y349c/t366s/l368a/y407v突变)融合。fc杵重链(含有s354c/t366w突变)与结合cea的fab片段融合(图1h)。[0759]通过将fc臼与fc杵链组合容许产生异二聚体，其包括特异性结合cea的fab片段和特异性结合icos的fab片段。[0760]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0761]双特异性单价抗icos和抗ceacamhuigg1p329glala是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:1:1:1的比率(“载体杵重链”:“载体轻链1”:“载体臼重链”:“载体轻链2”)来转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0762]成熟的双特异性单价抗icos/抗ceacamhuigg1p329glalakih抗体序列的氨基酸序列示于表35中。[0763]表35：成熟的双特异性1 1抗icos/抗ceacam人igg1p329glala抗原结合分子的氨基酸序列[0764][0765][0766][0767][0768][0769][0770]表36：单价结合icos且单价结合cea的双特异性抗原结合分子(1 1icos/cea人igg1p329glala抗原结合分子)的生化分析[0771][0772]6.2靶向icos和癌胚抗原相关细胞粘附分子(cea)且二价结合icos并单价结合cea的双特异性抗原结合分子(2 1形式)的产生[0773]与如图1c所示靶向fap者类似，制备了二价结合icos且单价结合cea的双特异性激动性icos抗体(也称为2 1)。[0774]在本实例中，构建体的第一重链hc1包含以下组分：后接fc杵的抗icos抗体的vhch1，在其c末端与cea抗体的vl融合。第二重链hc2包含后接fc臼的抗icos抗体的vhch1，在其c末端与cea抗体的vh融合。对于cea抗原结合结构域，克隆medi-565的vh和vl序列获自国际专利申请号wo2014/079886al。对于icos抗体jmab136，克隆jmab136的vh和vl序列获自专利us2008/0199466al。[0775]根据国际专利申请公开号wo2012/130831a1中所述的方法，将pro329gly、leu234ala和leu235ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与fcγ受体的结合。[0776]双特异性2 1抗icos抗ceahuigg1p329glala抗体是通过使用fectopro(polyplus,us)将hek293f细胞与哺乳动物表达载体共转染产生的。用相应的表达载体以1:2:1的比率(“载体杵重链”:“载体轻链”:“载体臼轻链”)转染细胞。按照双特异性单价抗icos和抗faphuigg1p329glala抗体的描述产生和纯化构建体(参见实例3.1)。[0777]2 1抗icos、抗cea构建体的氨基酸序列可见于表37中。[0778]表37：成熟的双特异性2 1抗icos、抗cea、抗cea人igg1p329glala的氨基酸序列[0779][0780][0781]表38：二价结合icos且单价结合cea的双特异性抗原结合分子(2 1icos/cea人igg1p329glala)的生化分析[0782][0783]实例7[0784]分子的体外功能表征[0785]7.1抗icos抗体与icos表达细胞的结合(流式细胞术分析)[0786]使用表达icos的cho细胞(atcc，ccl-61，转染以稳定过表达人icos)测试实例1中制备的几种icos抗体的结合。[0787]简言之，收获悬浮细胞，计数，检查存活性，并在facs缓冲液(含0.1％bsa的pbs)中以每ml1百万个细胞的速度重新悬浮。将100μl细胞悬液(含10万个细胞)在圆底96孔板中于4℃孵育30min，其中抗icos的浓度增加(fap-icos构建体与t细胞结合的浓度为7pm–120nm)，用0.1％bsa的冷pbs洗涤细胞两次，用标记的二抗(分子1，8与来自jacksonimmunoresearchlab#709-116-149的pe缀合的驴抗人h lpe；分子18和20与来自jacksonimmunoresearchlab#711-116-152的驴抗兔h lpe(稀释度为1:100)，分子14与来自jacksonimmunoresearchlab#715-116-150的驴抗小鼠h lpe)在4℃再孵育30min，并用0.1％bsa的冷pbs洗涤两次。使用每孔75μlfacs缓冲液中的1％pfa将染色在4℃黑暗条件下固定20min。[0788]此外，除了以下修饰外，上述分子与人sr细胞(crl-2262)的结合如上所述进行：将sr细胞以每毫升2百万个细胞的速度重新悬浮在facs缓冲液(bd)中。将100μl细胞悬液(含20万个细胞)在96孔pp板中于4℃孵育1h，抗icos浓度增加(7pm–510nm)，用0.1％bsa的冷pbs洗涤细胞两次，于4℃用上述标记的二抗再孵育30min。[0789]使用facsfortessa(软件facsdiva)通过facs分析荧光。使用graphpadprism7获得了结合曲线和ec50值。[0790]结果表明，icos分子能够以浓度依赖性方式与人icos结合(图2a和图2b)。ec50值示出于表39中。观察到分子20和8的结合最好。[0791]表39：不同抗icosigg与icos cho或sr细胞结合的ec50值[0792][0793]此外，如上所述，测试了实例4中制备的icos抗体009、1143v2和1138的人源化变体(以分子15、28和32的形式)与人icos的结合。[0794]结果表明，这些分子能够以浓度依赖性方式与人icos结合(图3a至图3c)。ec50值示出于表40中。对于抗体009(分子14)，必须使用不同的参考分子进行测定(分子15，fap靶向2 1icos抗原结合分子)，其表现出结合特性发生改变。因此，很难与亲本分子进行比较。这三种变体表现出相当的结合特征(图3a)，与分子25和27相比，分子26表现出轻微受损的结合。[0795]对于分子28，研究表明分子31显示出与亲本抗体(分子28)的相当结合，并且与分子29和30相比显示出更高的绝对结合(图3b)。[0796]与亲本抗体相比，分子35显示出相似的结合行为，而分子33和分子34显示出较高的ec50值，与亲本抗体相比，总体结合较低(分子32)。[0797](图3c)。[0798]表40：不同抗icosigg与icos 结合的ec50值[0799]ec50(pm)max(log10(mfi))分子15516.13.059分子2529196.547分子2652577.804分子2726986.852ꢀꢀꢀ分子2825584.881分子2951952.378分子3022512.747分子3117464.444ꢀꢀꢀ分子3221164.303分子3375783.888分子34101601.914分子3527214.55[0800]7.2活化jurkat-nfat报告细胞(基于发光的分析)[0801]通过使用对nfat核易位作出应答的表达荧光素酶的工程化jurkat细胞系来评估对同时tcr接合的依赖性。[0802]使用包被有1.5μg/mlacd3(biolegend#317304)和2μg/mlacd28(biolegend#302914)或pha-l(sigma#,1μg/ml)和il-2(proleukin,novartis；200u/ml)的细胞培养瓶在jurkatnfat培养基(rpmi1640培养基含有10％fcs、1％glumax、25mmhepes、1xneaa、1％so-丙酮酸盐；选择：200ug/ml潮霉素b)中预活化gloresponsejurkatnfat-re-luc2p(promega#cs176501)报告细胞系以诱导icos表达。[0803]在测定前，细胞被饥饿(无刺激的jurkatnfat培养基)过夜。用比率为1:1的1μg/mlbi《huiggf(ab’)2》(jir,#109-066-097)和1μg/mlbi《miggf(ab’)2》(jir,#115-066-072)的混合物同时包被(4℃过夜)测定板streptawelllhighbind(透明，96孔，roche#11989685001)。第二天洗涤板，并且加入指定浓度(范围为29pm–120000pm)的0.25μg/mlacd3(biolegend#317315)加抗icos分子，并且将板在室温孵育2小时。用dpbs(gibco,#14190136)洗涤该板一次，并加入0.15mio刺激和饥饿的gloresponsejurkatnfat-re-luc2p。根据制造商的说明，在37℃和5％co2下孵育5小时后，使用promegaoneglo测定系统(promega,#e6120)通过发光读数评估nfat介导的信号传导。将板重新格式化为无菌96孔平底白色板(costar,#3917)，并在tecanspark10m板阅读器(发光读数，1000ms积分时间，自动衰减设置)上读取。使用graphpadprism7获得曲线和ec50值。结果表明，所有测试的icos抗体(野生型igg形式)都能够以浓度依赖性方式活化jurkat-nfat报告细胞(图4)。ec50值示出于表41中。观察到分子20的活化最强。[0804]表41：使用不同抗icosigg活化jurkat-nfat报告细胞系的ec50值[0805]分子ec50[nm]分子140.08分子180.09分子200.02分子80.13[0806]此外，如上所述，测试了实例4中制备的icos抗体009、1143v2和1138的人源化变体(以分子15、28和32的形式)活化jurkat-nfat报告细胞的能力。[0807]结果表明，这些分子能够以浓度依赖性方式活化jurkat-nfat报告细胞(图5a至图5c)。ec50值示出于表42中。对于分子14，必须使用不同的参考分子进行测定(分子15)，与变体相比，其总体激动活性较低。因此，很难与亲本分子进行比较。这三种变体表现出非常相似的激动活性，这与之前与人icos结合的情况是一样的。[0808]分子28及其变体表现出相当的ec50值，且在最大激动活性方面只有轻微差异，等级为分子29》分子30》分子28＝分子31，这也与前述与人icos结合的结果一致。[0809]此外，仅观察到分子32及其人源化变体的激动活性存在微小差异：最大激动活性的等级为分子35》分子33》分子34》分子32。就ec50而言，等级为分子34》分子32》分子33》分子35。[0810]表42：使用不同抗icosigg活化jurkat-nfat报告细胞系的ec50值[0811][0812][0813]7.3与icos配体的竞争(流式细胞术分析)[0814]在icos cho转染细胞上测试了实例1中制备的几种抗icos抗体与人icos配体(seqidno:215,uniprotno.o75144)的竞争(见实例2.2)。[0815]简言之，收获细胞，计数，检查存活性，并在facs缓冲液(含0.1％bsa的pbs)中以每ml1百万个细胞的速度重新悬浮。将100μl细胞悬液(含10万个细胞)在圆底96孔板中于4℃与以alexa-fluor647(＝icosl预结合)标记的120nmicosl或以alexa-fluor488(＝icosigg预结合)标记的抗icos分子孵育30min。用0.1％bsa的冷pbs洗涤细胞两次，并在抗icosa488分子(对于icosl预结合的孔)或icosl-a647分子(对于抗icos分子预结合的孔)浓度增加(7pm-120)的情况下孵育。再次用0.1％bsa的冷pbs洗涤细胞两次，然后在4℃黑暗条件下使用每孔75μl1％pfa的facs缓冲液重新孵育并固定20min。使用facsfortessa(软件facsdiva)通过facs分析荧光。使用graphpadprism7分析数据。[0816]表43示出不同条件下抗icos分子在120nm浓度下的中位荧光强度(mfi)和％相对结合(计算方法为mfi(icosl 抗-icos)/mfi(仅抗icos)*100，所有mfi均使用来自具有细胞和二抗的孔的信号作为基线进行基线校正)。显示，除非竞争性对照分子外，所有抗icos抗体仍与huicos结合，即使添加了120nmicosl。[0817]表43：在huicos-配体(icosl)存在/不存在情况下抗icosigg的绝对和相对结合[0818][0819][0820]7.4双特异性肿瘤靶向icos分子与icos、fap或cea过表达细胞的结合(流式细胞术分析)[0821]使用icos表达cho细胞(atcc，ccl-61，转染以稳定过表达人icos)测试实例3或6中制备的几种双特异性肿瘤靶向icos抗原结合分子的结合。[0822]简言之，收获悬浮细胞，计数，检查存活性，并在facs缓冲液(含0.1％bsa的pbs)中以每ml1百万个细胞的速度重新悬浮。将100μl细胞悬液(含10万个细胞)在圆底96孔板中于4℃在抗icos浓度增加(7pm-120nm)的情况下孵育30min，用0.1％bsa的冷pbs洗涤细胞两次，用标记的二抗(fabfcy特异性af647(1:100)，190-606-008jacksonimmunoresearch)于4℃再孵育30min，并用0.1％bsa的冷pbs洗涤两次。使用每孔75μlfacs缓冲液中的1％pfa将染色在4℃黑暗条件下固定20min。[0823]使用facsfortessa(软件facsdiva)通过facs分析荧光。使用graphpadprism7获得了结合曲线和ec50值。[0824]结果表明，双特异性icos抗原结合分子能够以浓度依赖性方式与人icos结合(图6a)。ec50值示出于表44中。观察到分子15的结合最好。此外，结果表明图1a至图1c所示的三种不同形式的结合等级，显示出与1 1形式(图6b)相比，2 1形式(图1c)的结合是优异的，正如预期的那样，这是由于与icos的二价结合优于单价结合。[0825]表44：不同肿瘤靶向抗icos分子与icos cho细胞结合的ec50值[0826]分子ec50[pm]分子151123分子195444分子222186分子92718分子1041710分子114169[0827]此外，相同分子与人nih/3t3-hufap克隆19细胞(亲代细胞系atcc#ccl-92，经修饰以稳定过表达人fap)的结合以与上述相同的方式进行。[0828]结果表明，双特异性肿瘤靶向icos抗原结合分子能够以浓度依赖性方式与人fap结合(图7a)。ec50值示出于表45中。分子9、15、19和22表现出非常相似的结合。另一方面，结果表明，与2 1(图1c)和1 1ht形式(图1b)相比，1 1分子形式(图1a)的结合更好(见图7b)。这可能是由vh-vl与fab融合时fap靶向部分的不同结合亲和力驱动的。[0829]表45：不同肿瘤靶向抗icos分子与fap nih/3t3-hufap克隆19结合的ec50值[0830]分子ec50[pm]分子152967分子196155分子224680分子95730分子101403分子111154[0831]此外，在预活化的食蟹猴pbmc上评估了相同分子与食蟹猴icos的结合。[0832]简言之，根据制造商的说明，使用dynabeadstm人t活化剂cd3/cd28(thermofischer#11131d)将食蟹猴pbmc活化48小时，并在37℃储存在加湿培养箱中的含10％fcs和1％glutamax(gibco35050061)的rpmi1640培养基中，直至进行后续的结合实验，如上所述。[0833]结果显示，肿瘤靶向icos抗原结合分子能够以浓度依赖性方式与食蟹猴icos结合(图8a及图8b)。ec50值示出于表46中。观察到分子15与cd4 和cd8 t细胞亚群的结合最好。[0834]表46：不同双特异性肿瘤靶向抗icos分子与食蟹猴pbmc结合的ec50值[0835][0836][0837]比较图1a、图1b和图1c中描述的形式与食蟹猴icos结合的能力，证明图1c中描述的形式与icos的二价结合优于图1a和图1b中描述的形式的单价结合(图8c和图8d以及表47)。[0838]表47：不同形式的双特异性肿瘤靶向抗icos分子与食蟹猴pbmc结合的ec50值[0839][0840]此外，使用鼠脾细胞评估小鼠交叉反应分子9、10和11与鼠icos的结合，对上述方案进行以下改变：将c57bl/6小鼠或hcea(ho)tg小鼠的brspleen转移到gentlemacsc管(miltenyi)中，并向每个管中加入macs缓冲液(pbs 0.5％bsa 2mmedta)。使用gentlemacs解离仪解离脾，快速旋转试管，并使细胞通过100μm尼龙细胞过滤网。此后，用3mlrpmi1640培养基(sigma,cat.-no.r7388)冲洗试管并在350×g下离心分离8分钟。弃去上清液，使细胞悬液通过70μm尼龙细胞过滤网并用培养基洗涤。再次离心分离(350xg,8min)后，弃去上清液，并加入5mlack裂解缓冲液。室温孵育5分钟后，用rpmi培养基洗涤细胞。然后，将细胞重新悬浮，并将沉淀球粒汇集在测定培养基(rpmi1640,2％fbs,1％glutamax)中，用于细胞计数(vi-细胞设置白细胞，1:10稀释)。然后，用pha-l(sigma#,2μg/ml)和il-2(proleukin,novartis；200u/ml)预活化脾细胞48小时以上调鼠icos的表达，然后用于随后的结合实验，如上所述。[0841]结果表明，这些分子能够以浓度依赖性方式与鼠icos结合(图9a)。ec50值示出于表48中。同样，与2 1和1 1ht形式相比，2 1形式显示出与鼠icos的结合使优异的，而1 1形式显示出优于鼠fap的结合是优异的(图9b)。[0842]表48：不同肿瘤靶向抗icos分子与鼠脾细胞结合的ec50值[0843][0844]在实例3.4和3.5中制备并在图1d和图1e中描述的另一组双特异性肿瘤靶向抗icos分子的形式，除了将预活化的人pbmc用作与人icos结合的靶细胞的修饰之外，如上所述测试了它们与人icos和人fap的结合特性。[0845]简言之，外周血单核细胞(pbmc)是通过对从血沉棕黄层(“blutspendezürich”)获得的肝素化血液的富集淋巴细胞制剂进行histopaque(sigma-aldrich,catno.10771-500mlhistopaque-1077)密度离心制备的。用无菌dpbs以1:2稀释血液，并在histopaque梯度(sigma,#h8889)上分层。离心分离(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含pbmc间期以上的血浆，并将pbmc转移到新的falcon管中，随后用50mlpbs填充。将混合物离心分离(400xg，10分钟，室温)，弃去上清液，并且用无菌pbs洗涤pbmc沉淀球粒两次(离心分离步骤350xg，10分钟)。自动计数(cedexhires)得到的pbmc种群，并将其储存在含有10％fcs和1％glutamax(gibco35050061)的rpmi1640培养基中。使用pha-l(sigma#,2μg/ml)和il-2(proleukin,novartis；200u/ml)预活化pbmc48h，以在37℃、加湿培养箱中上调人icos的表达。孵育后，pbmc用于随后的结合实验，如上所述。[0846]结果显示，双特异性fap靶向icos分子能够以浓度依赖性方式结合人icos和人fap(图10a至图10c)。ec50值示出于表49中。分子12和13在cd4 和cd8 t细胞亚群形式上均表现出与人icos的优异结合(图10a和图10b)。另一方面，分子13与人fap的结合较差(图10c)。[0847]表49：不同fap靶向抗icos分子与fap nih/3t3-hufapcl.19细胞或人pbmc的预活化cd4 和cd8 亚群结合的ec50值[0848][0849]此外，fap靶向icos分子40、15、44、21和22与sr细胞上的icos以及与fap nih/3t3-hufapcl.19细胞结合在进一步的实验中进行了测试(见图12a和图12b)。数据示出于下表49a中。[0850]表49a：不同fap靶向抗icos分子与sr细胞上的icos以及与fap nih/3t3-hufapcl.19细胞结合的ec50值[0851]分子sr细胞上的人icos人fapec50[pm]ec50[pm]分子401.743.85分子151.391.98分子442.174.34分子210.575.01分子221.173.24[0852]在实例6中制备的另一组肿瘤靶向抗icos分子(靶向cea而不是fap)如上所述测试它们与人icos和人cea的结合特性。如前所述，在预活化的人pbmc上测试与人icos的结合。使用mkn-45细胞(人胃腺癌细胞系，dsmzacc409)评估与cea的结合。[0853]结果表明，cea靶向双特异性icos分子能够以浓度依赖性方式结合人icos和人cea(图11a至图11c)。分子42表现出与人icos的优异结合(图11a和图11b)，而所有三种分子都显示出与人cea的相当结合(图13c)。[0854]7.5在肿瘤靶向icos抗原结合分子存在情况下，tcb介导的t细胞活化增加(流式细胞术分析)[0855]在cea阳性的mkn-45和fap表达nih/3t3-hufap克隆19细胞(atcc，ccl-92，转染后稳定过表达人fap)以及人pbmc的共培养测定中，评估了fap靶向或cea靶向双特异性激动性icos分子进一步促进ceacam5-tcb介导的t细胞活化的能力。[0856]简言之，在实验前一天，用细胞解离缓冲液收获贴壁靶细胞，并在平底96孔板中以10000个细胞/孔的密度铺板(gibco,13151014)。由此，使用5000rad(无滤光片照射，5级)x射线照射器rs2000(rad源)，在平板培养前对nih/3t3-hufap克隆19细胞进行额外照射。让靶细胞粘附过夜。通过对来自血沉棕黄层(“blutspendezürich”)的富集淋巴细胞制剂进行histopaque(sigma-aldrich,catno.10771-500mlhistopaque-1077)密度离心分离制备外周血单核细胞(pbmc)，用无菌dpbs以1:2稀释血液，并在histopaque梯度(sigma,#h8889)上分层。离心分离(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含pbmc间期以上的血浆，并将pbmc转移到新的falcon管中，随后用50mlpbs填充。将混合物离心分离(400xg，10分钟，室温)，弃去上清液，并且用无菌pbs洗涤pbmc沉淀球粒两次(离心分离步骤350xg，10分钟)。自动计数得到的pbmc种群(cedexhires)，并在37℃储存在加湿培养箱中的含有10％fcs和1％glutamax(gibco35050061)的rpmi1640培养基中，直至测定开始。[0857]在80pmceacam5-tcb的固定浓度且fap或cea靶向icos分子浓度增加(三份均为0.11pm-5000pm)存在的情况下，向靶细胞和成纤维细胞中加入pbmc，以获得5:1:1的最终e:t比。在37℃、5％co2下孵育48小时后，使用识别t细胞活化标记cd69(早期活化标记)和cd25(晚期活化标记)的抗体，通过流式细胞术分析评估t细胞活化。[0858]简言之，以400xg离心分离pbmc4min，并用含0.1％bsa的pbs(facs缓冲液)洗涤两次。根据供应商的说明对cd8(percp/cy5.5抗人cd8a，biolegend#301032)、cd4(apc/cy7抗人cd4，biolegend#300518)、cd69(bv421抗人cd69，biolegend#310930)、cd25(pe抗人cd25，biolegend#356104)进行表面染色。然后用含0.1％bsa的150μl/孔pbs洗涤细胞两次，并用含1％pfa的75μl/孔facs缓冲液在4℃固定15-30min。离心分离后，将样品重悬于150μlfacs缓冲液中。使用facsfortessa(软件facsdiva)通过facs分析荧光。使用graphpadprism7获得图表。[0859]如上所述，在多达五个pbmc供体上比较了实例3中制备的几种fap-icos分子的激动活性(图12c)。结果表明，分子44及其变体分子21和22的活性相当，并且分子15(分子40的变体)的活性略微降低。[0860]在另一个实例中，在三个如上所述的pbmc供体(图13a和图13b)上比较了选定fap-icos分子的激动活性，除了以下修改：使用5pm的mcsptcb来替换80pmceacam5tcb，结合用mcsp 和fap mv-3细胞(保藏号cvcl_w280)替换细胞系，效应器与靶标比为5:1(每孔50'000个效应器和10'000个靶细胞)。[0861]所有测试的fap-icos分子都能够促进tcb介导的t细胞活化(图13a)。观察到分子19的活化最强。当比较三种不同形式的fap-icos时，图1c中描述的形式诱导了最强的活化(图13b)。[0862]在另一项测定中，对图1a、图1d和图1e中所述的形式进行了比较，如上文对两个健康的pbmc供体所述(图14a至图14c)。[0863]结果表明，与单独tcb治疗相比，所有三种形式均可诱导额外的t细胞活化。在测试的三种形式之间未发现最大激动活性的差异(图14c)。然而，三种形式在不同浓度下达到其最大激动活性，等级(从低到高)为图1a》图1e》图1d。[0864]为了评估将tcb和肿瘤靶向icos分子靶向相同靶细胞(“顺式设置”)或两种不同细胞(“反式设置”)的差异，在上述测定中，在两个健康的pbmc供体上测试了靶向fap(反式设置)或cea(顺式设置)的两种icos分子(图15a至图15c)。[0865]结果表明cea靶向分子41的总体激动活性更高(图15c)。然而，fap靶向分子10似乎在较低浓度下达到其最大激动活性(图15a至图15b)。[0866]此外，如前所述，使用nih/3t3-hufap克隆19、mkn-45细胞作为靶标和80pmceacam5tcb作为第一刺激，在三个pbmc供体上测试了一组cea-icos分子。[0867]结果表明，与单独使用tcb刺激相比，所有三种测试分子都能够进一步促进t细胞活化(图16a至图16c)。分子42表现出最高的附加刺激。[0868]实例8[0869]t细胞双特异性(tcb)抗体的制备、纯化和表征[0870]4.1用人或人源化结合物制备tcb抗体[0871]根据wo2014/131712a1或wo2016/079076a1中描述的方法制备了tcb分子。[0872]在实验中使用的抗cea/抗cd3双特异性抗体(ceacd3tcb或ceatcb)的制备描述于wo2014/131712a1的实例3中。ceacd3tcb是“2 1iggcrossfab”抗体并且包括两条不同的重链和两条不同的轻链。引入ch3结构域中的点突变(“突起入孔”)以促进两条不同重链的组装。进行cd3结合fab中的vh和vl结构域的交换，以便促进两条不同轻链的正确组装。2 1意指分子具有两个对于cea具有特异性的抗原结合结构域和一个对于cd3具有特异性的抗原结合结构域。ceacam5cd3tcb具有相同的形式，但是包含另一cea结合剂并且包含cd3结合剂的ch和cl结构域中的点突变，以便支持轻链的正确配对。[0873]ceacd3tcb包含seqidno:242、seqidno:243、seqidno:244和seqidno:245所示的氨基酸序列。ceacam5cdtcb包含seqidno:246、seqidno:247、seqidno:249和seqidno:249所示的氨基酸序列。[0874]4.22 1形式(对小鼠cea是二价的，而对于小鼠cd3为单价的)的抗cea/抗cd3t细胞双特异性抗体的制备[0875]制备了抗cea(ch1a1a98/992f1)/抗cd3(2c11)t细胞双特异性2 1替代分子，其由一个cd3-fab、以及两个cea-fab和一个fc结构域组成，其中所述两个cea-fab通过其c末端连接到所述fc部分的铰链区，并且其中cd3-fab通过其c末端连接到一个cea-fab的n末端。cd3结合部分是交叉fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变区或恒定区被交换。[0876]鼠替代分子的fc结构域是muigg1fc结构域，其中引入了ddkk突变以增强抗体fc异二聚体的形成，如尤其gunasekaran等人,j.biol.chem.2010,19637-19646所述。第一重链的fc部分包含突变lys392asp和lys409asp(称为fc-dd)，且第二重链的fc部分包含突变glu356lys和asp399lys(称为fc-kk)。根据kabateu索引编号。此外，根据例如baudino等人j.immunol.(2008),181,6664-6669或wo2016/030350a1中描述的方法，在重链的恒定区引入dapg突变以消除与小鼠fcγ受体的结合。简言之，在fc-dd和fc-kk重链的恒定区引入了asp265ala和pro329gly突变，以消除与fcγ受体的结合(根据kabateu索引编号；即d265a、p329g)。[0877]因此，抗cea(ch1a1a98/992f1)/抗cd3(2c11)t细胞双特异性2 1替代分子包含seqidno:250、seqidno:251、seqidno:252和seqidno:253的氨基酸序列。[0878]实例9[0879]肿瘤靶向icos抗原结合分子与ceacam5-tcb联合的体内功能表征9.1在nsg小鼠中单次注射后，双特异性fap-icos(1167)双特异性抗体的药代动力学概况[0880]向nsg小鼠注射单剂量2.5mg/kg的fap-icos分子。向所有小鼠静脉注射200μl适当的溶液。为了获得每200μl适量的化合物，用组氨酸缓冲液稀释贮备溶液(表50)。在10分钟、1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、72小时、96小时、6天、8天、10天和12天对每个时间点和组的三只小鼠进行放血。采用elisa法对血清样品中的注射用化合物进行分析。通过huicoselisa(通过人icos结合进行检测)进行分子检测。在每一步之后，将板洗涤三次，以除去未结合的物质。最后，通过加入abts底物溶液以形成有色反应产物，使过氧化物酶结合的复合物可视化。在405nm(参考波长为490nm)通过光度确定的反应产物的强度与血清样品中的分析物浓度成比例。结果(图17)表明所有分子的pk行为稳定，这表明后续疗效研究的时间表为每周一次。[0881]表50：测试组合物的描述[0882][0883][0884]9.2人源化小鼠中mkn45异种移植物中fap-icos抗体联合ceacam5-tcb的体内疗效研究[0885]此处描述的疗效研究旨在了解在完全人源化的nsg小鼠中，fap-icos分子联合ceacam5-tcb在肿瘤消退和immuno-pd方面的形式依赖性疗效。[0886]人mkn45细胞(人胃癌)最初获自atcc，并且扩增后保藏在glycart内部细胞库。细胞在含有10％fcs的dmem中于37℃、5％co2的水饱和气氛中培养。体外传代12用于皮下注射，存活率为97％。人成纤维细胞nih-3t3最初获自atcc，在rochenutley进行工程改造以表达人fap，并在含10％小牛血清、1x丙酮酸钠和1.5ug/ml嘌呤霉素的dmem中培养。克隆39以体外传代数18和98.2％的存活率使用。[0887]将混合有50微升matrigel的50微升细胞悬液(1x106mkn45细胞 1x1063t3-hufap)用22g至30g针头皮下注射到麻醉小鼠的侧面。[0888]根据规定指南(gv-solas；felasa；tierschg)，将实验开始时为4-5周龄的雌性nsg小鼠(jackson实验室)维持在不含特定病原体的条件下，日循环为12h光照/12h黑暗。实验研究方案经过地方政府的审查和批准(p2011/128)。到达之后，将动物维持一周以适应新环境并进行观察。定期进行连续健康状态监测。[0889]对雌性nsg小鼠i.p.注射15mg/kg的白消安，接着在一天后i.v.注射从脐带血中分离的1x105个人造血干细胞。在干细胞注射后第14-16周，对小鼠进行舌下放血并且通过流式细胞术针对成功的人源化对血液进行分析。将有效移植的小鼠根据它们的人t细胞频率随机化为不同的处理组。当时，小鼠被注射所述的肿瘤细胞和成纤维细胞s.c.(图18)，并且当肿瘤大小达到约250mm3(第23天)时，用化合物或组氨酸缓冲液(媒介物)每周处理一次。向所有小鼠静脉注射200μl适当的溶液。为了获得每200μl适量的化合物，在需要时用组氨酸缓冲液稀释贮备溶液(表51)。根据不同fap-icos分子的分子量(匹配的摩尔浓度，c、d、f组)调整其剂量。对于1 1形式，已使用了三个剂量(e-g组)。对于联合疗法(c-g组，图1)，fap-icos和ceacam5tcb构建体同时注射。使用卡尺每周测量肿瘤生长两次(图18)，并按下式计算肿瘤体积：[0890]tv：(w2/2)×l(w：宽度，l：长度)[0891]终止时(第50天)，处死小鼠，取出肿瘤和脾，称重，并通过胶原酶v和dna酶消化制备单细胞悬液，用于随后的facs分析。对单细胞进行人cd45、cd3、cd8、cd4、cd25、cd19和foxp3染色(细胞内)，并在facsfortessa下进行分析。[0892]将小片(30mg)肿瘤组织速冻，并分离出全蛋白。通过多重分析来分析蛋白质悬液的细胞因子含量。[0893]图19a至图19g示出摩尔浓度匹配的联合治疗组中的肿瘤生长动力学(平均值， sem)，以及每只小鼠的单个肿瘤生长和研究终止时的肿瘤重量。如本文所述，ceacam5tcb作为单一药剂，诱导的初始肿瘤生长抑制很少。然而，与所有fap-icos分子的联合显示出显著改善的肿瘤生长抑制，这也通过研究终止时的肿瘤重量得到反映(图19g)。有趣的是，研究终止时处死的动物的肿瘤immuno-pd数据(图20a至图20f)揭示，所有联合组中肿瘤内t和b细胞频率增加。在联合治疗中，肿瘤中t细胞浸润的增加使cd8/treg比向cd8细胞移动。终止时未在脾中检测到影响。然而，所用不同类型的双特异性fap-icos抗体之间在肿瘤生长和immunopd方面未观察到统计学差异。[0894]图21a至图21g示出1 1fap-icos形式的剂量应答组的肿瘤生长动力学(平均值， sem)，以及每只小鼠的单个肿瘤生长和研究终止时的肿瘤重量。不同剂量的肿瘤生长数据揭示，4和1mg/kg剂量的效应最强，而最高测试剂量10mg/kg的应答较弱。有趣的是，在研究终止时处死的动物的肿瘤immuno-pd数据(图22a至图22f)揭示，所有剂量的fap-icos1 1形式均增加了肿瘤内t和b细胞频率。在联合治疗中，肿瘤中t细胞浸润的增加使cd8/treg比向cd8细胞移动。在测试的最低剂量(1mg/kg)检测到最强的immuno-pd效应。[0895]此外，图23所示的全肿瘤蛋白裂解物的细胞因子/趋化因子分析揭示，与所有其他测试治疗组相比，在1 1形式的双特异性fap-icos抗体的剂量最低时，细胞因子/趋化因子的上调最强。[0896]表51：测试组合物的描述ligandforcd28inhuman.immunity.2011may27；34(5):729-40.[0921]young,m.r.i.,th17cellsinprotectionfromtumororpromotionoftumorprogression.jclincellimmunol.2016jun；7(3):431.[0922]yuraszecketal.,translationandclinicaldevelopmentofbispecifict-cellengagingantibodiesforcancertreatment.clinicalpharmacology&therapeutics2017,101.当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
