分离纯培养血管内皮细胞的方法、维持血管内皮细胞特性的培养基和包括其的培养方法

技术特征：
1.一种分离纯血管内皮细胞的方法，该方法包括以下步骤：从分化培养基获得从人多能干细胞分化的内皮细胞谱系的细胞系；使用过滤器过滤所获得的所述细胞系；在基质上培养经过滤的所述细胞系；以及将附着在所述基质上的同质内皮细胞从所培养的所述细胞系中分离出来。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述过滤器具有范围在20μm至40μm内的孔间距。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基质包含胶原蛋白、纤维蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、matrigel、明胶、层粘连蛋白、肝素、聚赖氨酸和透明质酸中的至少一种。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述基质是胶原蛋白并且包含0.1mg/ml的所述胶原蛋白。5.根据权利要求1所述的方法，其中在含有细胞生长因子和抗坏血酸的dmem/f-12培养基中执行培养经过滤的所述细胞系。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子-1(fgf-1)、fgf-2(bfgf)、fgf-3、fgf-4、fgf-5、fgf-6、表皮生长因子(egf)、角质形成细胞生长因子(kgf)、肝细胞生长因子(hgf)、转化生长因子-α(tgf-α)、tgf-β、血管生成素1、血管生成素2、促红细胞生成素、神经纤毛蛋白、igf-1、骨素、多效素、激活素、内皮素01和血管内皮生长因子-a(vegf-a)中的至少一种。7.根据权利要求1所述的方法，其中培养经过滤的所述细胞系包括将经过滤的所述细胞系接种在两份基质上。8.根据权利要求1所述的方法，其中，培养经过滤的所述细胞系进行4小时至20小时。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述同质内皮细胞表达cdh5和vwf。10.根据权利要求9所述的方法，其中cdh5的基因表达水平是分离前的12倍。11.根据权利要求9所述的方法，其中，vwf的基因表达水平是分离前的2倍。12.一种血管内皮细胞，其包含98％或更多的通过权利要求1至11中任一项所述的方法分离并表达cdh5和vwf的同质内皮细胞。13.一种用于预防或治疗心血管疾病的细胞治疗组合物，该组合物包含根据权利要求12所述的纯度为98％或更高的血管内皮细胞。14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述心血管疾病包括缺血性心脏病、心力衰竭、高血压性心脏病、心律失常、心肌病、室间隔缺损、先天性心脏病、心肌梗塞、心包疾病、中风、外周血管疾病、动脉瘤、动脉硬化、高血压、心绞痛和心肌梗塞中的至少一者。15.一种维持血管内皮细胞特性的培养方法，该方法包括：通过将具有诱导培养基的人多能干细胞悬浮在板上来第一次接种人多能干细胞(hpsc)；在诱导培养基中第一次培养第一次接种的干细胞，以使所述第一次接种的干细胞分化为中胚层细胞；在分化培养基中第二次培养所述第一次接种的干细胞，以使所述第一次培养的细胞分化为内皮细胞；从第二次培养的细胞中选择所述血管内皮细胞谱系的细胞；通过将所选择的所述血管内皮细胞与维持培养基悬浮在板上来进行第二次接种；以及
传代培养第二次接种的血管内皮细胞以在所述维持培养基中增殖所述第二次接种的血管内皮细胞。16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述诱导培养基含有4ng/ml至6ng/ml的fgf2和2μm至4μm的chirr99021。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述分化培养基含有4ng/ml至6ng/ml的fgf2、5ng/ml至10ng/ml的egf、10ng/ml至30ng/ml的vegf-a和20ng/ml到30ng/ml的dll4。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述维持培养基含有4ng/ml至6ng/ml的fgf2、5ng/ml至10ng/ml的egf、10ng/ml至30ng/ml的vegf-a，和20ng/ml至50ng/ml的抗坏血酸。19.根据权利要求15所述的方法，其中所述人多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞(ipsc)和体细胞核移植干细胞(scnt)中的至少一种。20.根据权利要求15所述的方法，其中进行所述第一次培养以每天更换培养基，持续3天。21.根据权利要求15所述的方法，其中，进行所述第二次培养步骤以每天更换培养基，持续11天至13天。22.根据权利要求15所述的方法，其中，所述板包括由胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白片段、玻连蛋白、基底膜基质、明胶、透明质酸、聚赖氨酸和玻连蛋白中的至少一种制成的涂层膜。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述涂层膜包含0.1mg/ml的所述胶原蛋白。24.根据权利要求15所述的方法，其中所述传代培养步骤在第1至第4代中进行。25.一种血管内皮细胞，其通过权利要求15至24中任一项所述的方法制备，纯度为98％以上。26.一种血管内皮细胞特性的维持培养基，所述培养基包含4ng/ml至6ng/ml的fgf2、5ng/ml至10ng/ml的egf、10ng/ml至30ng/ml的vegf-a和20ng/ml至50ng/ml的抗坏血酸作为活性成分。27.一种维持血管内皮细胞特性的培养方法，该方法包括：通过用含有4ng/ml至6ng/ml的fgf2、5ng/ml至10ng/ml的egf、10ng/ml至30ng/ml的vegf-a和20ng/ml至50ng/ml的抗坏血酸作为活性成分的维持培养基将作为细胞血管内皮细胞谱系分离的细胞悬浮而将所述细胞血管内皮细胞谱系接种在板上；以及通过在所述维持培养基中培养所接种的所述血管内皮细胞来传代培养所接种的所述血管内皮细胞，以维持所述血管内皮细胞的特性。28.根据权利要求27所述的传代培养方法，其中，所述传代培养的细胞具有cdh5阳性细胞，其表达维持在98％以上直至第4代。29.根据权利要求27所述的传代培养方法，其中，所述传代培养细胞具有pecam1阳性细胞，其表达维持在40％以上直至第4代。30.根据权利要求27所述的传代培养方法，其中，所述传代培养细胞具有vwf阳性细胞，其表达维持在88％以上直到第4代。

技术总结
本说明书提供：一种分离血管内皮细胞的纯培养物的方法，该方法能够在从由人多能干细胞分化的内皮细胞谱系的细胞系中分离在特定时间粘附在基质上的同质内皮细胞；一种维持血管内皮细胞特性的培养基，其包括通过该方法分离的高纯度血管内皮细胞，4ng/ml至6ng/ml的FGF2、5ng/ml至10ng/ml的EGF、10ng/ml至30ng/ml的VEGF-A、20ng/ml至50ng/ml的抗坏血酸和DMEM/F-12作为活性成分；以及包括它们的培养方法。方法。方法。


技术研发人员：李信贞 尹宁涉
受保护的技术使用者：延世大学校产学协力团
技术研发日：2020.11.11
技术公布日：2022/7/12