一种人乳头瘤病毒18型嵌合蛋白及其用途

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人乳头瘤病毒嵌合蛋白，及由其形成的五聚体或病毒样颗粒，以及人乳头瘤病毒嵌合蛋白、人乳头瘤病毒嵌合五聚体或人乳头瘤病毒嵌合病毒样颗粒在制备预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗中的用途。


背景技术：

2.人乳头瘤病毒(human papillomavirus,hpv)是一类感染上皮组织的无包膜小 dna病毒。根据人乳头瘤病毒的主要外壳蛋白l1氨基酸的同源性，已鉴定了200 多型的该病毒，分为α、β、γ、μ、η属。根据感染部位不同又分为黏膜型及皮肤型。黏膜型hpv主要感染泌尿生殖器、肛周及口咽部的粘膜皮肤，均为α属，并进一步分为有转化活性的致癌型(oncogenic hpv)及诱发良性增生的低危型 (low-risk hpv，lr-hpv)。致癌型hpv包括12种常见的高危型(包括hpv16、
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18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59型等)，1种可能的高危型(hpv68)，及10余种十分少见的可疑高危型(hpv26、-30、-34、-53、-66、
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67、-69、-70、-73、-82、-85型等)。研究发现，所有致癌型hpv阳性癌组织均呈现特异性e6*i mrna表达、抑癌基因rb/p53及细胞周期蛋白cd1的表达降低及p16ink 4a表达增高，表明感染任何一种致癌型hpv罹患癌症的风险是一样的。低危型hpv有约12种(hpv6、-7、-11、-13、-32、-40、-42、-43、-44、
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54、-74、-91型等)，其中hpv6、-11型合计诱发90％的肛周生殖器尖锐湿疣及绝大多数呼吸道复发性乳头瘤。皮肤型hpv主要感染上述部位之外的皮肤组织，其中一些型别(hpv2、-27、-57)诱发皮肤疣状增生，另一些型别(hpv5、-8、
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38等)与皮肤鳞状细胞癌及基底细胞癌的发生相关。
3.致癌型hpv感染相关的恶性肿瘤目前已确定的有：宫颈癌、阴道癌、阴唇癌、阴茎癌、肛门肛周癌、口咽癌、扁桃体癌及口腔癌，其中以宫颈癌的危害最大。宫颈癌是世界范围第三高发的妇女恶性肿瘤，年发病率约52.7万，其中亚洲地区28.5万；中国的年发病数7.5万。12种常见高危型hpv累计诱发 95.2％-96.5％的宫颈癌，其余10多种少见的可能及可疑的高危型累计诱发约 3.29％的宫颈癌。hpv16型是全球范围内的优势流行高危型，在hpv相关的肿瘤如宫颈癌、肛周癌、阴茎癌、外阴癌等及癌前病变中的检出率最高。hpv16及 hpv 18在世界范围内宫颈癌中的检出率分别达50-60％及～20％。12种常见高危型hpv累计诱发95.2％-96.5％的宫颈癌，其余10多种少见的可能及可疑的高危型累计诱发约3.29％的宫颈癌。
4.hpv l1病毒样颗粒(l1 virus-like particle,l1 vlp)主要诱发型别特异性中和抗体和保护反应，只能通过增加l1 vlp的型别来扩大疫苗的保护范围。上市的3 种hpv疫苗均为l1 vlp疫苗，分别是gsk的二价苗(cervarix，hpv16/-18)， merck的四价苗(gardasil，hpv6/-11/-16/-18)和九价苗(gardasil-9， hpv6/-11/-16/-18/-31/-33/-45/-52/-58)，其中保护范围最宽的九价苗才只涵盖有限的7种高危型、2种低危型(hpv6/-11)，而且不能预防皮肤型。另外l1 vlp疫苗不能通过无限制的增加l1 vlp的型别来扩大保护范围，因此l1 vlp疫苗难以满足hpv感染相关疾病的预防要求。
5.hpv的次要衣壳蛋白l2在天然状态下没有免疫活性，但l2的n端多肽可诱发交叉中和抗体及交叉保护反应，只是免疫原性弱，诱发抗体的滴度低，而且单型l2抗血清的交叉中和型别有限。目前仅在16l2n中发现了多种可诱发中和抗体的保守表位肽，其中aa.17-38为其主要中和表位区，识别该区域的单抗rg-1交叉中和的型别最多，因此该区域又称rg-1表位肽，其中aa.21-31为其中和表位的核心序列，rg-1表位肽的相关研究，无论序列的长短，均保留aa.21-31的同源区。
6.已经报道的用于疫苗研究的rg-1型别有hpv4型rg-1、hpv6型rg-1、 hpv16型rg-1、hpv17型rg-1、hpv31型rg-1、hpv33型rg-1、hpv45型 rg-1、hpv51型rg-1、hpv58型rg-1等[c.schellenbacher et al.,the journal ofinvestigative dermatology 2013,133(12):2706-13；h.seitz et al.,vaccine 2014, 32(22):2610-2617；b.huber et al.,plos one 2015,10(3):e0120152；b.huber et al., plos one 2017,12(1):e0169533；x.chen et al.,oncotarget 2017,8(38):63333-63344； x.chen et al.,human vaccines&immunotherapeutics 2018,14(8):2025-2033； pct/cn2017/075402]，采用的方式包括vlp表面展示、细菌蛋白表面展示(细菌硫氧还蛋白trx、鞭毛蛋白、霍乱毒素突变体crm197)、靶向igγr改造抗体及含rg-1表位的多型l2多肽串联融合。但研究表明，多种rg-1表位肽相关疫苗的活性结果较差，如表面展示hpv4型rg-1、hpv6型rg-1、hpv17型rg-1的 3种16型cvlp诱发产生的hpv16的中和抗体滴度很低，交叉中和滴度未能检测到[b.huber et al.,plos one 2017,12(1):e0169533；x.chen et al.,oncotarget 2017, 8(38):63333-63344]；展示hpv45型rg-1的18cvlp诱发产生的hpv18的中和抗体滴度很低(仅为18型l1vlp的1/100)，而且仅交叉中和致癌型hpv45、70 及39，滴度很低，最高的仅为100[b.huber et al.,plos one 2015, 10(3):e0120152]；表面展示51型rg1的trx融合蛋白抗血清的交叉范围窄，交叉中和抗体滴度最高的仅为500[h.seitz et al.,vaccine 2014,32(22):2610-2617]。相反，schellenbacher等人报道的16型rg1-cvlp及本发明人之前报道的31型rg1-cvlp、33型rg1-cvlp及58型rg1-cvlp的免疫活性较好，骨架型别vlp 诱发的hpv16中和抗体滴度高达105(与16型l1 vlp诱发的相当)，相应rg-1 表位诱发的l2依赖的交叉中和抗体中和范围广、滴度相对较高(最高的可达 6400)[c.schellenbacher et al.,the journal of investigative dermatology 2013, 133(12):2706-13；x.chen et al.,oncotarget 2017,8(38):63333-63344；x.chen etal.,human vaccines&immunotherapeutics 2018,14(8):2025-2033； pct/cn2017/075402]。
[0007]
上述数据提示，不同型别hpv来源的rg-1表位肽的免疫原性存在非常大的差异。本发明人在之前的文献中比较了58型rg-1及6型rg-1的免疫原性，发现58型rg-1表位肽抗血清交叉中和的型别多(13个型别)、滴度也较高(最高的达3200)，而6型rg-1表位肽抗血清的中和型别较少(9个型别)、滴度很低 (最高的仅为100)[x.chen et al.,oncotarget 2017,8(38):63333-63344]。表明尽管 rg-1表位肽区在不同型别间具有较强的保守性，但不同型别的rg-1的免疫原性存在差异，因此任选1种l2 aa.17-36同源多肽，构建嵌合蛋白疫苗，其免疫活性是无法预测的。
[0008]
另一方面，schellenbacher和wang的报道的hpv16 cvlp疫苗研究显示，同是将16型rg-1表位肽插入16型l1 vlp载体的表面区，由于16型rg-1核心表位肽序列的旁侧序列及插入位点和插入方式的差异，获得的多种不同的16型 rg1-cvlp的免疫活性具有显著差异，
其中最好的是在16型l1的de环区插入 16型rg-1的cvlp，最差的是在16型l1的h4区插入16型rg-1核心序列的 cvlp。另外，chen和boxus均报道了33型rg-1的cvlp，但采用的载体不同，分别是hpv16 l1 vlp及18l1 vlp，虽然两篇报道均选择了de环作为插入位点，但是插入区相差1个氨基酸，表位肽长度相差2个氨基酸，获得的两种33型 rg1-cvlp诱发产生的33型rg-1依赖的交叉中和抗体的活性差异十分显著，33 型rg1-cvlp抗血清可交叉中和至少12种型别(其中2种型别的滴度》1000)，而33型rg1-18cvlp抗血清仅交叉中和7种型别，其中6种型别的中和滴度(其中4种型别的滴度均＜100)均远较33rg1-16cvlp抗血清的低。
[0009]
因而，目前需要开发一种能够针对更多hpv型别的病毒产生高滴度中和抗体的基于hpv l1与hpv l2嵌合蛋白的疫苗。


技术实现要素：

[0010]
为解决上述技术问题，本发明人选用了多种不同长度的59型rg-1表位肽，用于hpv cvlp的研究，结果显示，本发明获得的hpv18型cvlp的免疫原性很强，其诱发的血清中和抗体可高滴度中和α7亚属的多个型别的hpv。
[0011]
本发明人在实施例1中对8个不同型别rg-1表位免疫血清的中和活性比较分析，发明人意外的发现59型rg-1表位肽的免疫血清可交叉中和至少17种型别，特别是中和hpv45、59及16型的滴度均在103以上，是目前报道的中和α7属高危型hpv型别活性最好的，且同时对hpv16的交叉中和活性又可与目前报道的免疫原性较强的16rg-1相当。
[0012]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人乳头瘤病毒嵌合蛋白，用于制备预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗。
[0013]
本发明基于本发明人以下的意想不到的发现：在全长或截短型hpv18型l1 蛋白的表面区插入hpv59型l2蛋白多肽，可提高hpv59型l2蛋白多肽的免疫原性，获得的嵌合蛋白在大肠杆菌或昆虫细胞表达系统中可高水平表达，该嵌合蛋白可组装成vlp，并可诱发针对来自不同属/亚属的多种型别hpv的广谱保护性免疫反应。在本文实施例中提供了相关的实验结果。
[0014]
基于上述目的，本发明一方面提供了一种人乳头瘤病毒嵌合蛋白，其骨架是 hpv18 l1蛋白或hpv18 l1蛋白的突变体，所述的骨架上嵌合至少一个来自 hpv59型l2蛋白的多肽。
[0015]
即，在本发明的第一方面中，本发明提供了一种人乳头瘤病毒嵌合蛋白，其包含hpv18型l1蛋白或hpv18型l1蛋白的突变体以及插入所述hpv18型l1 蛋白或hpv18型l1蛋白的突变体的表面区的来自hpv59型l2蛋白的多肽、或由其组成，其中所述hpv18型l1蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述 hpv59型l2蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0016]
在根据本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，所述的hpv18 型l1蛋白的突变体是在所述的hpv18型l1蛋白的n端截短0-8个氨基酸和/或c 端截短0-32个氨基酸的所获得的蛋白。
[0017]
在根据本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，所述hpv18型 l1蛋白的突变体选自：
[0018]
将seq id no.1所示的氨基酸序列的c端截短32个氨基酸的突变体；
[0019]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、478、484、496、499、504、 506置换为
甘氨酸(g)且将氨基酸485、500、502置换为丝氨酸(s)的突变体 (mut1)；
[0020]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、478、485、496、499、504、 506置换为甘氨酸(g)且将氨基酸486、500、502置换为丝氨酸(s)的突变体 (mut2)；
[0021]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、478、484、496、499、502、 506置换为甘氨酸(g)、将氨基酸485、500置换为丝氨酸(s)且将氨基酸504 置换为天冬氨酸(d)的突变体(mut3)；
[0022]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、478、485、496、502、506置换为甘氨酸(g)、将氨基酸486、500置换为丝氨酸(s)且将氨基酸499、504 置换为天冬氨酸(d)的突变体(mut4)；
[0023]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、484、496、499、504、506置换为甘氨酸(g)且将氨基酸485、500、502置换为丝氨酸(s)的突变体(mut5)；和
[0024]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、485、496、499、504、506置换为甘氨酸(g)且将氨基酸486、500、502置换为丝氨酸(s)的突变体(mut6)。
[0025]
在根据本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，所述来自 hpv59型l2蛋白的多肽选自seq id no.2所示氨基酸的1-50区域内的任意连续 8-33个氨基酸的片段；优选地，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽为hpv型59 型l2蛋白rg-1表位肽或其突变体表位肽；进一步优选地，所述来自hpv59型 l2蛋白的多肽由选自以下的氨基酸序列组成：seq id no.2所示的氨基酸17至32、 seq id no.2所示的氨基酸16至35、seq id no.2所示的氨基酸17至37、seq idno.2所示的氨基酸16至37、以及在上述氨基酸序列的n端和/或c端延长或截短 1至7个氨基酸的序列。
[0026]
最优选地，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽的氨基酸序列如seq id no.3、 seq id no.4、seq id no.5或seq id no.6所示。
[0027]
可选地，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽是在seq id no.3所示的氨基酸序列的n端延长或截短1-7个氨基酸和/或c端延长或截短1-7个氨基酸所获得的多肽。
[0028]
可选地，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽还可以是与seq id no.3、seq idno.4、seq id no.5或seq id no.6所示的氨基酸序列具有大于60％、优选大于 70％、优选大于80％、大于90％、甚至更优选大于95％序列同一性的多肽。
[0029]
在根据本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，所述hpv18型 l1蛋白可来自，例如但不限于ncbi数据库中的atl15214.1、atl14646.1、 ars43458.1、ars43428.1、ars43449.1、agu90430.1等来自hpv18变异株的 l1蛋白。优选地，所述的hpv18型l1蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0030]
在本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，所述来自hpv59型 l2蛋白的多肽插入hpv18型l1蛋白或hpv18型l1蛋白的突变体的表面区；优选地，插入所述的hpv18型l1蛋白或hpv18型l1蛋白的突变体的de环或h4 区；更优选地，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽通过直接插入的方式插入所述的hpv18型l1蛋白或所述hpv18型l1蛋白的突变体的氨基酸134和氨基酸135 之间、或氨基酸137和138之间、或氨基酸432和433之间、或氨基酸434和435 之间，或者通过非等长置换的方式插入所述的hpv18型l1蛋白或所述hpv18型 l1蛋白的突变体的氨基酸121至124区域、或氨基酸131至138区域、或氨基酸 431-433区域、或氨基酸432-435区域。
[0031]
如本文所用，术语“直接插入”是指在相邻两个氨基酸之间插入所选择的肽片段。例如，在seq id no.1的氨基酸134和氨基酸135之间的直接插入指的是将所选择的肽片段直接插入到seq id no.1的氨基酸134和氨基酸135之间。
[0032]
如本文所用，术语“非等长置换”指的是在删除指定氨基酸区间的序列后，将所选的肽片段插入到指定的氨基酸区间。例如，在seq id no.1的氨基酸121 至124区域的非等长置换指的是，删除seq id no.1的氨基酸122-123之后，将所选择的肽片段插入到seq id no.1的氨基酸氨基酸121至124之间。可选地，在所述直接插入或非等长置换的方式中，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽在其 n端和/或c端包含1至3个氨基酸残基长的连接子。
[0033]
可选地，所述的连接子由选自甘氨酸(g)、丝氨酸(s)、丙氨酸(a)及脯氨酸(p)的氨基酸任意组合构成。优选地，n端选用g(甘氨酸)p(脯氨酸) 连接子，c端选用p(脯氨酸)连接子。
[0034]
在本发明的乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，在所述直接插入的方式中，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽的氨基酸序列是seq id no.4或seq idno.5，插入位点为所述的hpv18型l1蛋白或c端截短32个氨基酸的所述hpv18 型l1蛋白的突变体的氨基酸137和氨基酸138之间，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10所示。
[0035]
在本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，在所述直接插入的方式中，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽的氨基酸序列是seq id no.3，插入位点为所述的hpv18型l1蛋白或c端截短32个氨基酸的所述hpv18型l1蛋白的突变体的氨基酸432和433之间或氨基酸434和435之间，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13或seq idno.14所示。
[0036]
在本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，在所述直接插入的方式中，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽的氨基酸序列是n端含有gp连接子且c端含有p连接子的seq id no.4或seq id no.6所示序列，插入位点为所述的hpv18型l1蛋白或c端截短32个氨基酸的所述hpv18型l1蛋白的突变体的氨基酸134和氨基酸135之间，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq idno.15、seq id no.16、seq id no.17或seq id no.18所示。
[0037]
在本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，在所述非等长置换的方式中，删除所述hpv18型l1蛋白或c端截短32个氨基酸的所述hpv18型 l1蛋白的突变体的氨基酸132-137区域后，在hpv18型l1蛋白或c端截短32 个氨基酸的所述hpv18型l1蛋白的突变体的氨基酸131及138之间插入来自 hpv59型l2蛋白的多肽，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽其n端增加了甘氨酸-脯氨酸连接子，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽的氨基酸序列如seq id no.3所示，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq id no.19、或seq idno.20所示。
[0038]
在本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，在所述非等长置换的方式中，删除所述hpv18型l1蛋白或c端截短32个氨基酸的所述hpv18型 l1蛋白的突变体的氨基酸122-123区域后，在hpv18型l1蛋白或c端截短32 个氨基酸的所述hpv18型l1蛋白的突变体的氨基酸121及124之间插入来自 hpv59型l2蛋白的多肽，在所述直接插入的方式中，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽的氨基酸序列是seq id no.3所示，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq id no.21或seq id no.22所示。
[0039]
在本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，在所述非等长置换的方式中，删除所述hpv18型l1蛋白或c端截短32个氨基酸的所述hpv18型 l1蛋白的突变体的氨基酸432后，在hpv18型l1蛋白或c端截短32个氨基酸的所述hpv18型l1蛋白的突变体的氨基酸431及433之间插入来自hpv59型 l2蛋白的多肽，在所述直接插入的方式中，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽的氨基酸序列是seq id no.3所示，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seqid no.23或seq id no.24所示。
[0040]
在本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，在所述非等长置换的方式中，删除所述hpv18型l1蛋白或c端截短32个氨基酸的所述hpv18型 l1蛋白的突变体的氨基酸433-434后，在hpv18型l1蛋白或c端截短32个氨基酸的所述hpv18型l1蛋白的突变体的氨基酸432及435之间插入来自hpv59 型l2蛋白的多肽，在所述直接插入的方式中，所述来自hpv59型l2蛋白的多肽的氨基酸序列是seq id no.3所示，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如 seq id no.25或seq id no.26所示。
[0041]
在本发明的人乳头瘤病毒嵌合蛋白的优选的实施方案中，所述seq id no.4 所示的多肽通过直接插入的方式嵌合于所述hpv18型l1蛋白突变体的氨基酸137 和138之间，所述hpv18型l1蛋白突变体选自：
[0042]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、478、484、496、499、504、 506置换为甘氨酸(g)且将氨基酸485、500、502置换为丝氨酸(s)的突变体，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq id no.27所示(mut1)；或者，
[0043]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、478、485、496、499、504、 506置换为甘氨酸(g)且将氨基酸486、500、502置换为丝氨酸(s)的突变体，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq id no.28所示(mut2)；或者，
[0044]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、478、484、496、499、502、 506置换为甘氨酸(g)、将氨基酸485、500置换为丝氨酸(s)且将氨基酸504 置换为天冬氨酸(d)的突变体，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq id no.29所示(mut3)；或者，
[0045]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、478、485、496、502、506置换为甘氨酸(g)、将氨基酸486、500置换为丝氨酸(s)且将氨基酸499、504 置换为天冬氨酸(d)的突变体，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq id no.30所示(mut4)；或者，
[0046]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、484、496、499、504、506置换为甘氨酸(g)且将氨基酸485、500、502置换为丝氨酸(s)的突变体，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq id no.31所示(mut5)；或者，
[0047]
将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、485、496、499、504、506置换为甘氨酸(g)且将氨基酸486、500、502置换为丝氨酸(s)的突变体，获得的乳头瘤病毒嵌合蛋白氨基酸序列如seq id no.32所示(mut6)。
[0048]
本发明的另一方面涉及编码上述的乳头瘤病毒嵌合蛋白的多核苷酸。
[0049]
本发明还提供了包含上述的多核苷酸的载体，以及包含所述的载体的细胞。
[0050]
本发明涉及的编码上述的乳头瘤病毒嵌合蛋白的多核苷酸序列适用于不同的表达系统。可选地，这些核苷酸序列采用大肠杆菌密码子进行全基因优化，可在大肠杆菌表达系统中高水平表达；或采用昆虫细胞密码子进行全基因优化，可在昆虫细胞表达系统中高水平表达。
[0051]
本发明还提供了一种多聚物，优选地，该多聚物为乳头瘤病毒嵌合五聚体或嵌合病毒样颗粒，其含有上述的乳头瘤病毒嵌合蛋白，或者由上述的乳头瘤病毒嵌合蛋白所形成。
[0052]
本发明还提供了上述的乳头瘤病毒嵌合蛋白、乳头瘤病毒嵌合五聚体或上述的乳头瘤病毒嵌合病毒样颗粒在制备预防乳头瘤病毒感染和/或所述乳头瘤病毒感染诱发的疾病的疫苗中的用途，优选地，所述乳头瘤病毒感染诱发的疾病包括但不限于宫颈癌、阴道癌、阴唇癌、阴茎癌、肛门肛周癌、口咽癌、扁桃体癌及口腔癌；
[0053]
优选地，所述乳头瘤病毒感染为一种或多种选自以下乳头瘤病毒型别的感染： hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、 hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv70、hpv73； hpv6、hpv11、hpv2、hpv5、hpv27和hpv57。
[0054]
本发明还提供了一种用于预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗，其包含上述的乳头瘤病毒嵌合五聚体或嵌合病毒样颗粒、佐剂、以及疫苗用赋形剂或载体，优选地，还包含至少一种嗜黏膜组和/或嗜皮肤组的hpv的病毒样颗粒或嵌合病毒样颗粒。其中，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
[0055]
可选地，所述佐剂为人用佐剂。
[0056]
发明中相关术语的说明及解释
[0057]
根据本发明，术语“昆虫细胞表达系统”包括昆虫细胞、重组杆状病毒、重组bacmid及表达载体。其中昆虫细胞来源于市场上可得到的细胞，在此举例但不限于：sf9，sf21，high five。
[0058]
根据本发明，术语“原核表达系统”包括但不限于大肠杆菌表达系统。其中表达宿主菌来源于市场上可得到的菌株，在此举例但不限于：bl21(de3)， bl21(de3)plyss，c43(de3)，rosetta-gami b(de3)。
[0059]
根据本发明，术语“全长hpv18型l1蛋白”的例子包括但不限于ncbi数据库中编号为atl15070.1的蛋白等长的全长l1蛋白。
[0060]“截短型hpv18型l1蛋白”的基因片段指的是其与野生型hpv 18型l1蛋白基因相比，在其5’端和/或3’端缺失编码1个或多个氨基酸的核苷酸，其中“野生型 hpv18型l1蛋白”的全长序列例如但不限于ncbi数据库中的如下序列： atl15214.1、atl14646.1、ars43458.1、ars43428.1、ars43449.1、 agu90430.1等。
[0061]
根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体”是指选自一种或多种，包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂。例如，ph调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子、阴离子或非离子型表面活性剂，举例但不限于聚山梨酯80(tween-80)，离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。
[0062]
根据本发明，术语“人用佐剂”是指在临床上可应用于人体的佐剂，包括当前已获得批准的和将来可能获得批准的各种佐剂，例如但不限于铝佐剂、mf59及各种形式的佐剂组合物。
[0063]
根据本发明，本发明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，优选注射。
[0064]
根据本发明，本发明疫苗优选单位剂型使用，其中单位剂型中蛋白病毒样颗粒的剂量为5μg-100μg，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、
100μg、以及上述任意两个数值之间的范围；优选 30μg-60μg。
附图说明
[0065]
图1a-图1b：本发明实施例6中嵌合蛋白在大肠杆菌及昆虫细胞中的表达鉴定。结果显示，26种嵌合蛋白均可在大肠杆菌或昆虫细胞中表达，其中有6种嵌合蛋白可在两种表达系统中表达。
[0066]
图1a：嵌合蛋白在大肠杆菌中的表达鉴定：1为18l1de
137-138
/59des；2为 18l1de
137-138
/59de；3为18l1h4
432-433
/59de；4为18l1h4
434-435
/59de；5为 18l1de
134-135
/59des；6为18l1de
134-135
/59de；7为18l1de
131-138
/59de；8为18l1de
121-124
/59de，9为18l1h4
431-433
/59de；10为18l1h4
432-435
/59de；11为 18l1de
137-138
/59des-mut1；12为18l1de
137-138
/59des-mut2；13为 18l1de
137-138
/59des-mut3；14为18l1de
137-138
/59des-mut4；15为 18l1de
137-138
/59des-mut5；16为18l1de
137-138
/59des-mut6；
[0067]
图1b：嵌合蛋白在昆虫细胞中的表达鉴定：1为18l1δcde
137-138
/59des；2 为18l1δcde
137-138
/59de；3为18l1δch4
432-433
/59de；4为18l1δch4
434-435
/59de； 5为18l1δcde
134-135
/59des；6为18l1δcde
134-135
/59de；7为 18l1δcde
131-138
/59de；8为18l1δcde
121-124
/59de，9为18l1δch4
431-433
/59de；10 为18l1δch4
432-435
/59de；11为18l1de
137-138
/59des-mut1；12为 18l1de
137-138
/59des-mut2；13为18l1de
137-138
/59des-mut3；14为 18l1de
137-138
/59des-mut4；15为18l1de
137-138
/59des-mut5；16为 18l1de
137-138
/59des-mut6。
[0068]
图2a-图2d：本发明实施例6中纯化后获得的cvlp的动态光散射分析结果。结果显示18l1δcde
134-135
/59de、18l1δcde
134-135
/59des、18l1δcde
137-138
/59de 及18l1δcde
137-138
/59des重组蛋白形成的病毒样颗粒水化动力学直径分别为 106.8nm、113.3nm、114.7nm和122.9nm，颗粒组装的百分比均为100％。
[0069]
图2a：18l1δcde
134-135
/59de；图2b：18l1δcde
134-135
/59des；图2c： 18l1δcde
137-138
/59de；图2d：18l1δcde
137-138
/59des。
[0070]
图3a-图3d：本发明实施例7中纯化后获得的cvlp的透射电镜观察结果。视野中可见大量的病毒样颗粒，颗粒均一度好。cvlp直径为50nm左右，与l1 蛋白的vlp的大小相似。bar＝50nm。
[0071]
图3a：18l1δcde
134-135
/59de；图3b：18l1δcde
134-135
/59des；图3c： 18l1δcde
137-138
/59de；图3d.18l1δcde
137-138
/59des。
[0072]
图4：本发明实施例10中的嵌合vlp小鼠免疫血清对α7亚属hpv假病毒的中和活性检测。*：p《0.05。
具体实施方式
[0073]
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界定在所附的权利要求中。
[0074]
除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域
的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述，但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本说明书中所提到的所有公开文献均被并入于此作为参考，以揭示并说明所述公开文献中的方法和/或材料。
[0075]
实施例1：不同型别rg-1表位肽的免疫活性检测
[0076]
采用化学合成法合成hpv35、-39、-51、-53、-56、-59、-68、-82的rg-1表位肽，表位肽序列如表1所示，多肽由上海吉尔生化有限公司合成，为了提高合成肽的免疫原性，各合成肽通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (edc，cas no.25952-53-8)活化羧基后与钥孔血蓝蛋白(klh)偶联。
[0077]
取2.0-2.5kg体重的新西兰大白兔，随机分组，每组2-4只，于免疫前4天背部多点皮下注射15mg灭活的与等体积弗氏完全佐剂充分混匀的dh5a(含0.5％v/v 甲醛的pbs，37℃处理24-48h)进行免疫刺激，首次免疫采用背部、大腿内侧多点皮下注射1mg与等体积弗氏完全佐剂充分混匀的klh-多肽。加强免疫4次，每次间隔2周，加强免疫的抗原为0.5mg与等体积弗氏不完全佐剂(充分混匀的 klh-多肽。最后一次免疫后2周采血，分离血清。
[0078]
使用17种hpv假病毒对免疫血清的中和抗体滴度进行检测，结果如表2所示。59rg-1表位肽的免疫活性最好，其抗血清可中和所有17种检测型别，其中 hpv45,-59,-16的中和抗体的滴度均在103以上，hpv5,-31,-18,-39,-68,-57的中和抗体滴度在500-1000之间。值得注意的是，59rg-1表位肽抗血清对检测的5种α7-hpv的中和抗体水平均很高。
[0079]
多肽合成、假病毒制备及假病毒中和实验的方法均是公开的，例如专利cn 104418942a及108676057a。
[0080]
表1.合成的不同型别rg-1表位肽的序列
[0081]
型别合成肽序列seq id no.hpv35tqlyrtckaagtcppdvipkveg44hpv39stlyrtckqsgtcppdvvdkveg45hpv51tqlystckaagtcppdvvnkveg46hpv53tqlyqtckqsgtcpedvinkieh47hpv56tqlyktcklsgtcpedvvnkieq48hpv59lyktckq agtcp sdvin kvegtt49hpv68stlyktckqsgtcppdvinkveg50hpv82tqlystckaagtcppdvipkvkg51
[0082]
表2.不同的rg1-klh偶联肽在兔子中诱发的血清中和抗体滴度
[0083][0084]
实施例2：嵌合l1蛋白的基因的合成及表达载体构建
[0085]
26种嵌合l1蛋白，分别为：
[0086]
1)嵌合l1蛋白18l1de
137-138
/59des：骨架为全长hpv18型l1蛋白(序列如seq id no.1所示)，在其de环aa.137/138位点，直接插入hpv59型l2蛋白的aa.17-32多肽(如seq id no.4所示)，18l1de
137-138
/59des嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.7所示。编码18l1de
137-138
/59des的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0087]
2)嵌合l1蛋白18l1de
137-138
/59de：骨架为全长hpv18型l1蛋白(序列如 seq id no.1所示)，在其de环aa.137/138位点，直接插入hpv59型l2蛋白的 aa.16-35多肽(如seq id no.5所示)，18l1de
137-138
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.9所示。编码18l1de
137-138
/59de的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，采用全基因合成的方式构
建；
[0088]
3)嵌合l1蛋白18l1h4
432-433
/59de：骨架为全长hpv18型l1蛋白(序列如 seq id no.1所示)，在其h4区aa.432/433位点，直接插入hpv59型l2蛋白的 aa.17-37多肽(如seq id no.3所示)，18l1h4
432-433
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.11所示。编码18l1h4
432-433
/59de的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0089]
4)嵌合l1蛋白18l1h4
434-435
/59de：骨架为全长hpv18型l1蛋白(序列如 seq id no.1所示)，在其h4区aa.434/435位点，直接插入hpv59型l2蛋白的 aa.17-37多肽(如seq id no.3所示)，18l1h4
434-435
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.13所示。编码18l1h4
434-435
/59de的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0090]
5)嵌合l1蛋白18l1de
134-135
/59des：骨架为全长hpv18型l1蛋白(序列如seq id no.1所示)，在其de环aa.134/135位点，直接插入n端含gp连接子且c端含p连接子的hpv59型l2蛋白的aa.17-32多肽(即在seq id no.4所示序列的n端添加甘氨酸-脯氨酸，且在c端添加脯氨酸)，18l1de
134-135
/59des嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.15所示。编码18l1de
134-135
/59des的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0091]
6)嵌合l1蛋白18l1de
134-135
/59de：骨架为全长hpv18型l1蛋白(序列如 seq id no.1所示)，在其de环aa.134/135位点，直接插入n端含gp连接子且 c端含p连接子的hpv59型l2蛋白的aa.16-37多肽(即在seq id no.6所示序列的n端添加甘氨酸-脯氨酸，且在c端添加脯氨酸)，18l1de
134-135
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.17所示。编码18l1de
134-135
/59des的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0092]
7)嵌合l1蛋白18l1de
131-138
/59de：骨架为全长hpv18型l1蛋白(序列如 seq id no.1所示)，删除其aa.132-137区域，并在aa.131/138之间融合n端包含 gp连接子的hpv59型l2蛋白的aa.17-37多肽(在hpv 18型l1蛋白的aa.132-137 区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列为seq id no.3所示序列的n端添加甘氨酸-脯氨酸，18l1de
131-138
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.19 所示。编码18l1de
131-138
/59de的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0093]
8)嵌合l1蛋白18l1de
121-124
/59de：骨架为全长hpv18型l1蛋白(序列如 seq id no.1所示)，删除其aa.122-123区域，并在aa.121/124之间融合hpv59 型l2蛋白的aa.17-37多肽(在hpv 18型l1蛋白的aa.122-133区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列如seq id no.3所示，18l1de
121-124
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.21所示。编码18l1de
121-124
/59de的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0094]
9)嵌合l1蛋白18l1h4
431-433
/59de：骨架为全长hpv18型l1蛋白(序列如 seq id no.1所示)，删除其aa.432，并在aa.431/433之间融合hpv59型l2蛋白的aa.17-37多肽(在hpv 18型l1蛋白的aa.431-433区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列如seq id no.3所示，18l1h4
431-433
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.23所示。编码
18l1h4
431-433
/59de的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0095]
10)嵌合l1蛋白18l1h4
432-435
/59de：骨架为全长hpv18型l1蛋白(序列如 seq id no.1所示)，删除其aa.433-434区域，并在aa.432/435之间融合hpv59 型l2蛋白的aa.17-37多肽(在hpv 18型l1蛋白的aa.432-435区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列如seq id no.3所示，18l1h4
432-435
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.25所示。编码18l1h4
433-434
/59de的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0096]
11)嵌合l1蛋白18l1δcde
137-138
/59des：骨架为c端截短32个氨基酸的hpv18型l1蛋白(序列seq id no.1的c端截短32个氨基酸)，在其de环 aa.137/138位点，直接插入hpv59型l2蛋白的aa.17-32多肽(如seq id no.4所示)，18l1δcde
137-138
/59des嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.8所示。编码 18l1δcde
137-138
/59des的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建，其核苷酸序列如seq id no.33所示；
[0097]
12)嵌合l1蛋白18l1δcde
137-138
/59de：骨架为c端截短32个氨基酸的 hpv18型l1蛋白(序列seq id no.1的c端截短32个氨基酸)，在其de环 aa.137/138位点，直接插入hpv59型l2蛋白的aa.16-35多肽(如seq id no.5所示)，18l1δcde
137-138
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示。编码 18l1δcde
137-138
/59de的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建，其核苷酸序列如seq id no.34所示；
[0098]
13)嵌合l1蛋白18l1δch4
432-433
/59de：骨架为c端截短32个氨基酸的hpv18 型l1蛋白(序列seq id no.1的c端截短32个氨基酸)，在其h4区aa.432/433 位点，直接插入hpv59型l2蛋白的aa.17-37多肽(如seq id no.3所示)， 18l1δch4
432-433
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.12所示。编码 18l1δch4
432-433
/59de的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0099]
14)嵌合l1蛋白18l1δch4
434-435
/59de：骨架为c端截短32个氨基酸的hpv18 型l1蛋白(序列seq id no.1的c端截短32个氨基酸)，在其h4区aa.434/435 位点，直接插入hpv59型l2蛋白的aa.17-37多肽(如seq id no.3所示)， 18l1δch4
434-435
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.14所示。编码 18l1δch4
434-435
/59de的多核苷酸序列经昆虫细胞码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0100]
15)嵌合l1蛋白18l1δcde
134-135
/59des：骨架为c端截短32个氨基酸的 hpv18型l1蛋白(序列seq id no.1的c端截短32个氨基酸)，在其de环 aa.134/135位点，直接插入n端含gp连接子且c端含p连接子的hpv59型l2 蛋白的aa.17-32多肽(即在seq id no.4所示序列的n端添加甘氨酸-脯氨酸，且在c端添加脯氨酸)，18l1δcde
134-135
/59des嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.16所示。编码18l1δcde
134-135
/59des的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建，其核苷酸序列如seq id no.35所示；
[0101]
16)嵌合l1蛋白18l1δcde
134-135
/59de：骨架为c端截短32个氨基酸的 hpv18型l1蛋白(序列seq id no.1的c端截短32个氨基酸)，在其de环 aa.134/135位点，直接插入n端含gp连接子且c端含p连接子的hpv59型l2 蛋白的aa.16-37多肽(即在seq id no.6所示序列的n端添加甘氨酸-脯氨酸，且在c端添加脯氨酸)，18l1δcde
134-135
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.18所示。编码18l1δcde
134-135
/59de的多核苷酸序列经昆虫细胞密码
子优化设计，采用全基因合成的方式构建，其核苷酸序列如seq id no.36所示；
[0102]
17)嵌合l1蛋白18l1δcde
131-138
/59de：骨架为c端截短32个氨基酸的 hpv18型l1蛋白(序列seq id no.1的c端截短32个氨基酸)，删除其aa.132-137 区域，并在aa.131/138之间融合n端包含gp连接子的hpv59型l2蛋白的aa.17-37 多肽(在hpv 18型l1蛋白的aa.132-137区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列为seq id no.3所示序列的n端添加甘氨酸-脯氨酸，18l1de
131-138
/59de 嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.20所示。编码18l1de
131-138
/59de的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建，其核苷酸序列如seq id no.37所示；
[0103]
18)嵌合l1蛋白18l1δcde
121-124
/59de：骨架为c端截短32个氨基酸的 hpv18型l1蛋白(序列seq id no.1的c端截短32个氨基酸)，删除其aa.122-123 区域，并在aa.121/124之间融合hpv59型l2蛋白的aa.17-37多肽(在hpv 18型 l1蛋白的aa.122-133区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列如seq id no.3所示，18l1δcde
121-124
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.22所示。编码18l1δcde
121-124
/59de的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0104]
19)嵌合l1蛋白18l1δch4
431-433
/59de：骨架为c端截短32个氨基酸的hpv18 型l1蛋白(序列seq id no.1的c端截短32个氨基酸)，删除其aa.432，并在 aa.431/433之间融合hpv59型l2蛋白的aa.17-37多肽(在hpv 18型l1蛋白的 aa.431-433区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列如seq id no.3所示， 18l1δch4
431-433
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.24所示。编码 18l1δch4
431-433
/59de的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0105]
20)嵌合l1蛋白18l1δch4
432-435
/59de：骨架为c端截短32个氨基酸的hpv18 型l1蛋白(序列seq id no.1的c端截短32个氨基酸)，删除其aa.433-434区域，并在aa.432/435之间融合hpv59型l2蛋白的aa.17-37多肽(在hpv 18型 l1蛋白的aa.432-435区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列如seq id no.3所示，18l1δch4
432-435
/59de嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.26所示。编码18l1δch4
432-435
/59de的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建；
[0106]
21)嵌合l1蛋白18l1de
137-138
/59des-mut1：骨架为全长hpv18型l1蛋白的突变体mut1(即将seq id no.1所示氨基酸序列的氨基酸477、478、484、496、499、504、506置换为甘氨酸(g)且将氨基酸485、500、502置换为丝氨酸(s)的突变体)，在其de环aa.137/138位点，直接插入hpv59型l2蛋白的 aa.17-32多肽(如seq id no.4所示)，18l1de
137-138
/59des-mut1嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.27所示。编码18l1de
137-138
/59des-mut1的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计或昆虫细胞密码子优化设计，采用全基因合成的方式构建，其中采用昆虫细胞密码子优化的18l1de
137-138
/59des-mut1的多核苷酸序如 seq id no.38所示；
[0107]
22)嵌合l1蛋白18l1de
137-138
/59des-mut2：骨架为全长hpv18型l1蛋白的突变体mut2(即将seq id no.1所示序列的氨基酸477、478、485、496、499、 504、506置换为甘氨酸且将氨基酸486、500、502置换为丝氨酸)，在其de环 aa.137/138位点，直接插入hpv59型l2蛋白的aa.17-32多肽(如seq id no.4所示)，18l1de
137-138
/59des-mut2嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no.28所示。编码18l1de
137-138
/59des-mut2的多核苷酸序列经大肠杆菌密码
pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut1，pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut2， pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut3，pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut4， pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut5，pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut6；用于昆虫细的表达载体共16个，分别为：pfastbac1-18l1δcde
137-138
/59des， pfastbac1-18l1δcde
137-138
/59de，pfastbac1-18l1δch4
432-433
/59de， pfastbac1-18l1δch4
434-435
/59de，pfastbac1-18l1δcde
134-135
/59des， pfastbac1-18l1δcde
134-135
/59de，pfastbac1-18l1δcde
131-138
/59de， pfastbac1-18l1δcde
121-124
/59de，pfastbac1-18l1δch4
431-433
/59de， pfastbac1-18l1δch4
432-435
/59de，pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut1， pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut2，pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut3， pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut4，pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut5， pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut6。上述酶切、连接及克隆构建的方法都是公知的，例如专利cn101293918b。
[0113]
本发明中使用的多肽的氨基酸序列如下所示：
[0114]
hpv18型l1全长氨基酸
[0115][0116]
hpv59型l2全长氨基酸序列
[0117][0118][0119]
hpv 59型l2 aa.17-37
[0120]
lyktckqagtcpsdvinkveg
ꢀꢀ
seq id no.3
[0121]
hpv 59型l2 aa.17-32
[0122]
lyktckqagtcpsdvi
ꢀꢀ
seq id no.4
[0123]
hpv 59型l2 aa.16-35
[0124]
dlyktckqagtcpsdvinkv
ꢀꢀ
seq id no.5
[0125]
hpv 59型l2 aa.16-37
[0126]
dlyktckqagtcpsdvinkveg
ꢀꢀ
seq id no.6
[0127]
18l1de
137-138
/59des
[0128][0129]
18l1δcde
137-138
/59des
[0130][0131]
18l1de
137-138
/59de
[0132][0133][0134]
18l1δcde
137-138
/59de
[0135][0136]
18l1h4
432-433
/59de
[0137][0138]
18l1δch4
432-433
/59de
[0139][0140]
18l1h4
434-435
/59de
[0141][0142][0143]
18l1δch4
434-435
/59de
[0144][0145]
18l1de
134-135
/59des
[0146][0147]
18l1δcde
134-135
/59des
[0148][0149]
18l1de
134-135
/59de
[0150][0151][0152]
18l1δcde
134-135
/59de
[0153][0154]
18l1de
131-138
/59de
[0155][0156]
18l1δcde
131-138
/59de
[0157][0158]
18l1de
121-124
/59de
[0159][0160][0161]
18l1δcde
121-124
/59de
[0162][0163]
18l1h4
431-433
/59de
[0164][0165]
18l1δch4
431-433
/59de
[0166][0167][0168]
18l1h4
432-435
/59de
[0169][0170]
18l1δch4
432-435
/59de
[0171][0172]
18l1de
137-138
/59des-mut1
[0173][0174]
18l1de
137-138
/59des-mut2
[0175]
[0176][0177]
18l1de
137-138
/59des-mut3
[0178][0179]
18l1de
137-138
/59des-mut4
[0180][0181]
18l1de
137-138
/59des-mut5
[0182][0183]
18l1de
137-138
/59des-mut6
[0184][0185]
编码本发明嵌合蛋白的核苷酸序列如下所示：
[0186]
18l1δcde
137-138
/59des nt
[0187][0188]
[0189]
18l1δcde
137-138
/59de nt
[0190][0191]
18l1δcde
134-135
/59des nt
[0192]
[0193][0194]
18l1δcde
134-135
/59de nt
[0195]
[0196][0197]
18l1δcde
131-138
/59de nt
[0198]
[0199][0200]
18l1de
137-138
/59des-mut1 nt
[0201][0202]
18l1de
137-138
/59des-mut2 nt
[0203]
[0204][0205]
18l1de
137-138
/59des-mut3 nt
[0206][0207]
18l1de
137-138
/59des-mut4 nt
[0208][0209]
18l1de
137-138
/59des-mut5 nt
[0210]
[0211][0212]
18l1de
137-138
/59des-mut6 nt
[0213][0214]
实施例3：嵌合l1蛋白的基因的重组bacmid及重组杆状病毒的构建
[0215]
分别使用包含嵌合l1基因的重组表达载体pfastbac1-18l1δcde
137-138
/59des，pfastbac1-18l1δcde
137-138
/59de， pfastbac1-18l1δch4
432-433
/59de，pfastbac1-18l1δch4
434-435
/59de， pfastbac1-18l1δcde
134-135
/59des，pfastbac1-18l1δcde
134-135
/59de， pfastbac1-18l1δcde
131-138
/59de，pfastbac1-18l1δcde
121-124
/59de， pfastbac1-18l1δ
ch4
431-433
/59de，pfastbac1-18l1δch4
432-435
/59de， pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut1，pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut2， pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut3，pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut4， pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut5，pfastbac1-18l1de
137-138
/59des-mut6转化大肠杆菌dh10bac感受态，筛选获得重组bacmid，然后用重组bacmid转染昆虫细胞sf9，在sf9内扩增重组杆状病毒。重组bacmid的筛选及重组杆状病毒的扩增方法都是公知的，例如专利cn101148661b。
[0216]
实施例4：嵌合l1蛋白的基因在sf9细胞中的表达
[0217]
sf9细胞分别接种16种嵌合l1基因的重组杆状病毒，进行嵌合l1蛋白的表达，27℃培养约88h后收发酵液，3000rpm离心15min，弃上清，用pbs洗涤细胞后，用于表达鉴定及纯化。感染表达的方法是公开的，例如专利cn 101148661 b。
[0218]
实施例5：嵌合l1蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
[0219]
分别使用包含嵌合l1基因的重组表达载体pet22b-18l1de
137-138
/59des， pet22b-18l1de
137-138
/59de，pet22b-18l1h4
432-433
/59de， pet22b-18l1h4
434-435
/59de，pet22b-18l1de
134-135
/59des， pet22b-18l1de
134-135
/59de，pet22b-18l1de
131-138
/59de， pet22b-18l1de
121-124
/59de，pet22b-18l1h4
431-433
/59de， pet22b-18l1h4
432-435
/59de，pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut1， pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut2，pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut3， pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut4，pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut5， pet22b-18l1de
137-138
/59des-mut6转化大肠杆菌bl21(de3)。
[0220]
挑单克隆接种到3ml含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃培养过夜。将过夜培养的菌液按1：100的比例加入lb培养基中，37℃培养3h左右，待od600达到0.8-1.0之间，加iptg至终浓度0.5μm，16℃培养约12h，收取菌液。
[0221]
实施例6：嵌合l1蛋白的表达鉴定
[0222]
取实施例4及实施例5中所述表达不同嵌合l1蛋白的细胞各1
×
106个，重悬于200μl pbs溶液中，加入6
×
loading buffer 50μl，75℃变性8分钟，分别取10 μl进行sds-page电泳及western blot鉴定。结果如图1a-图1b所示，26种嵌合l1蛋白均可在昆虫细胞或原核表达系统中高水平表达，其中 18l1de
137-138
/59des，18l1de
137-138
/59de，18l1h4
432-433
/59de， 18l1h4
434-435
/59de，18l1de
134-135
/59des，18l1de
134-135
/59de， 18l1de
131-138
/59de，18l1de
121-124
/59de，18l1h4
431-433
/59de， 18l1h4
432-435
/59de，18l1de
137-138
/59des-mut1，18l1de
137-138
/59des-mut2， 18l1de
137-138
/59des-mut3，18l1de
137-138
/59des-mut4， 18l1de
137-138
/59des-mut5，18l1de
137-138
/59des-mut6大小约59kda，其余10种蛋白大小约55kda。sds-page电泳及western blot鉴定的方法是公开的，例如专利 cn101148661b。
[0223]
实施例7：嵌合l1蛋白在昆虫细胞中的表达量比较
[0224]
取c端截短32个氨基酸的18l1骨架蛋白的表达细胞以及实施例4中所述的以c端截短32个氨基酸的18l1为骨架或以6种18l1突变体为骨架的嵌合l1蛋白表达细胞各1
×
106个，重悬于200μl pbs溶液中，采用超声破碎法(宁波新芝超声破碎仪，2#探头，100w，超声5s，间隔7s，总时间3min)破碎细胞， 12000rpm高速离心10分钟。收取裂解上清，采用夹心elisa法检测上清中的l1 含量，该方法是公知的，例如专利cn104513826a。
[0225]
使用本发明人制备的hpv18 l1单克隆抗体包被酶标板，80ng/孔，4℃孵育过夜；使用5％bsa-pbst室温封闭2h，再用pbst洗板3次。用pbs将裂解上清进行连续2倍稀释，并且将
hpv18l1 vlp标准品也进行梯度稀释，浓度从2μ g/ml-0.0625μg/ml，分别加入酶标板，每孔100μl，37℃孵育1h。用pbst洗板3次，加入1：3000稀释的hpv18l1兔多抗，每孔100μl，37℃孵育1h。用 pbst洗板3次，加入1：3000稀释的hrp标记的山羊抗小鼠igg(1：3000稀释，中杉金桥公司)，37℃孵育45分钟。用pbst洗板5次，每孔加入100μl opd底物(sigma公司)，37℃显色5分钟，用50μl 2m硫酸终止反应，在490nm处测定吸光值。依据标准曲线计算裂解上清中hpv18l1蛋白及18l1嵌合蛋白的浓度。
[0226]
结果如表3所示，本发明的18l1δcde
134-135
/59des、 18l1δcde
137-138
/59des、18l1δch4
431-433
/59de及18l1δch4
432-435
/59de的表达量很高，与hpv18l1骨架的相当；此外，以c端氨基酸置换的18l1突变体为骨架的嵌合蛋白18l1de
137-138
/59des-mut1、18l1de
137-138
/59des-mut4、 18l1de
137-138
/59des-mut5的表达量均高于hpv18l1骨架及相应的c端截短的嵌合蛋白。
[0227]
表3.嵌合l1蛋白表达量分析
[0228][0229][0230]
实施例8：嵌合l1蛋白的纯化及动态光散射粒径分析
[0231]
取嵌合l1的细胞发酵液适量，使用10ml pbs重悬细胞，加pmsf至终浓度 1mg/ml，超声破碎(宁波新芝超声破碎仪，6#探头，200w，超声5s，间隔7s，总时间10min)，取破碎上清进行纯化，纯化步骤在室温进行。在裂解液中加入 4％β-巯基乙醇(w/w)对vlp进行解聚，然后使用0.22μm滤器过滤样品，依次使用dmae阴离子交换层析或cm阳离子交换层析(20mm tris,180mm nacl,4％β-me,ph7.9洗脱)、tmae阴离子交换层析或q阳离子交换层析(20mm tris,180 mm nacl,4％β-me,ph7.9洗脱)及羟基磷灰石层析(100mm nah2po4，30mmnacl，4％β-me，ph 6.0洗脱)纯化。纯化产物采用planova超滤系统进行浓缩，并更换缓冲液(20mm nah2po4，500mm nacl，ph6.0)促使vlp组装。以上纯化方法均是公开的，例如专利cn101293918b、cn1976718a等。
[0232]
嵌合蛋白纯品组装过程中发现，18l1h4
431-433
/59de、18l1h4
432-435
/59de、 18l1δch4
431-433
/59de及18l1δch4
432-435
/59de严重凝集，其他嵌合蛋白组装后未观察到凝集现象。取组装后的嵌合蛋白溶液进行dls粒径分析(zetasizer nano zs 90动态光散射仪，malvern公司)，结果如表4所示，其中18l1δcde
134-135
/59de、 18l1δcde
134-135
/59des、18l1δcde
137-138
/59de、18l1δcde
137-138
/59des的dls 分析图如图2a至图2d所示。
[0233]
表4.嵌合l1蛋白dls分析
[0234][0235][0236]
实施例9：嵌合vlp的透射电镜观察
[0237]
按实施例8所述的层析纯化方法，分别纯化嵌合蛋白，使用组装后嵌合制备铜网，并用1％醋酸铀进行染色，充分干燥后使用jem-1400电镜(奥林巴斯)进行观察。结果显示，大肠杆菌及昆虫细胞表达的嵌合蛋白均可组装成直径约为 50nm的cvlp。其中18l1δcde
134-135
/59de、18l1δcde
134-135
/59des、 18l1δcde
137-138
/59de、18l1δcde
137-138
/59des cvlp的电镜图片如图3a至图3d 所示。铜网制备及电镜观察的方法均是公开的，例如专利cn 101148661 b。
[0238]
实施例10：嵌合vlp的小鼠免疫及中和抗体滴度测定
[0239]
取4-6周龄的balb/c小鼠，随机分组，每组5只，用10μg cvlp联合 al(oh)
3 50μg及mpl佐剂5μg免疫小鼠。皮下注射，于第0，4，7，10周免疫，共4次。第4次免疫后2周尾静脉采血，分离血清。
[0240]
使用24种hpv假病毒对免疫血清的中和抗体滴度进行检测，结果显示大肠杆菌及
昆虫细胞表达体系生产的各种cvlp免疫小鼠后，诱发的交叉中和抗体水平及中和范围各有不同。其中，如表5所示，昆虫细胞表达的 18l1δcde
134-135
/59des及18l1δcde
137-138
/59des cvlp抗血清可中和至少23个型别的假病毒，18l1δcde
134-135
/59de及18l1δcde
137-138
/59de cvlp免疫血清可中和至少19个型别的假病毒。值得一提的是，18l1δcde
134-135
/59des及18l1δcde
137-138
/59des cvlp抗血清可中和所有的6种检测用的α7-hpv，特别是 18l1δcde
137-138
/59des cvlp，交叉中和α7-hpv的抗体滴度都在250以上，是目前报道的交叉中和α7-hpv能力最强的cvlp。
[0241]
此外，本发明中采用c端截短32个氨基酸的18l1突变体构建的cvlp，采用上述策略免疫小鼠后，也可诱发的高水平的中和抗体，其中 18l1de
137-138
/59des-mut4诱发的各型中和抗体水平均与18l1δcde
137-138
/59des的相当，值得注意的是，18l1de
137-138
/59des-mut4免疫血清的hpv39和hpv59中和抗体滴度均大于103(如表5、图4所示)。
[0242]
假病毒制备及假病毒中和实验的方法均是公开的，例如专利cn104418942a。
[0243]
表5不同cvlp在小鼠中诱发的中和抗体滴度
[0244]
[0245][0246]
*nd表示在最低稀释度下未检测到中和抗体。