适用于次生盐渍化土壤的土壤修复剂及其制备和应用的制作方法

1.本发明涉及农业微生物应用技术领域，具体地说，本发明涉及一种适用于次生盐渍化土壤的土壤修复剂及其制备和应用的技术领域。


背景技术：

2.随着我国设施栽培面积的逐年增加，土壤次生盐渍化发生越来越严重。由于设施栽培作物种类单一及多年连作，且设施内无雨水冲洗，加上肥料的连年施入，设施内土壤中积累过量肥料造成了土壤次生盐渍化。土壤盐分的积累，特别是硝酸盐的积累，常导致土壤酸化，抑制土壤硝化细菌的活动，作物易发生亚硝酸气体的毒害。土壤酸化不仅危害作物的生长，而且易引发植株体内硝酸盐的累积，降低蔬菜品质，甚至影响食品安全。
3.产生土壤次生盐渍化的众多原因中肥料施用不合理是导致设施蔬菜土壤发生次生盐溃化的主要原因之一，土壤发生次生盐渍化后，会对土壤理化性质、作物发育与生长及生态环境产生严重的不良影响。对土壤理化性质而言，土壤酸化、土壤板结，土壤酶的活性受到抑制，并且随着种植时间的增长，微生物的生长环境恶化愈加严重，对整个土壤环境造成破环；其次对作物生长来说，土壤发生次生盐渍化后，耕层的高含量盐分会直接影响作物生长发育，土壤盐分含量逐步增加，土壤渗透势升高，水势降低，容易引起植物生理干旱，作物根系吸水困难甚至是脱水，土壤微生物的群落结构受到破坏导致土壤环境恶化，土传病虫害问题发生严重等；同时土壤次生盐渍化对生态环境特别是水环境产生不利影响。
4.虽然目前已有多种方法防治土壤次生盐渍化，其中，施用有益微生物菌肥等方法减少土壤硝酸盐累积已受到广泛关注，利用微生物的同化作用降低土壤中的硝酸盐含量，不仅使氮素能被土壤固持且环境友好，在修复土壤次生盐渍化方面有巨大潜力。本技术人前期公开了cn105154353a、cn105154334a和cn105296380a一些列用于温室大棚土壤改良的修复剂，包括经筛选选育驯化了白地霉菌单菌、枯草芽孢杆菌和白地霉及细黄链霉菌复合菌、枯草芽孢杆菌单菌用来制备温室土壤改良修复剂，在降低温室土壤硝酸盐含量及生物性状均有较好的改良效果，可以在温室大棚土壤修复中广泛应用。但是目前能用于次生盐渍化土壤修复的菌株有限，修复效果有待进一步提升，申请人在专利 (cn1904035a)中公开了一种联合固氮解磷解钾的微生物复合肥，复配包括已保藏的巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cgmcc no.1640、胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)cgmcc no.1641和肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种 (klebsiellapneumoniae subsp pneumonaiae)cgmcc no.1642三种菌株制备获得微生物肥料。针对次生盐渍化土壤修复存在的问题，能否利用公司已保存的菌株复配，简化制备过程，丰富次生化土壤修复剂的菌株来源，且提升修复效果，有待研究，且现有文献和专利未见有报道有关巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌复合在次生盐渍化土壤修复中的应用。


技术实现要素：

5.针对现有技术中能用于次生盐渍化土壤修复的菌株有限，修复效果有待进一步提
6.2，总菌数20-25亿 /ml，即获得胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)发酵液。
12.(4)选用步骤(3)制备的巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)发酵液和胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)发酵液按照体积比1:1，制备复合菌种的混合液。
13.(5)将步骤(4)制备的复合菌种混合液充分吸附于载体中，载体选用草炭；辅料采用尿素和磷酸钙，其中尿素与磷酸钙的重量比为1:2；载体和辅料的用量按照重量比为1:1.5配比混合，加水至含水量40-70％，然后按体积比每立方米载体与辅料混合用料加入上述步骤(4)制备的复合菌种混合液100-300g，并混合均匀，制备获得土壤修复剂。
14.本发明选用的菌株xhs0019p为巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium) cgmcc no.1640已于2005年3月7日，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为：cgmcc no.1640，依照伯杰氏系统细菌学手册第八版，经过微生物学鉴定，xhs0019p菌为巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)，具有解磷属性，属于解磷细菌类。该菌种采用常见的固体和液体培养基对于本发明应用制备土壤修复剂是可以的，但是对于次生盐渍化土壤中应用发现不适合，对于次生盐渍化土壤中应用制备土壤修复剂带来应用效果的不显著和不明显，究其原因就是微生物菌种的特殊性和特异性，此菌种对于培养基的选择更为明显。
15.本发明选用的菌株xhs0012k为胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus) cgmcc no.1641已于2005年3月7日，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为：cgmcc no.1641，依照伯杰氏系统细菌学手册第八版，经过微生物学鉴定，xhs0012k菌为胶冻样芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)，具有解钾属性，属于解钾细菌类。该菌种采用常见的固体和液体培养基对于本发明应用制备土壤修复剂是可以的，但是对于次生盐渍化土壤中应用发现不适合，对于次生盐渍化土壤中应用制备土壤修复剂带来应用效果的不显著和不明显，究其原因就是微生物菌种的特殊性和特异性，此菌种对于培养基的选择更为明显。
16.本发明同时提供适用于次生盐渍化土壤的土壤修复剂的使用方法，使用方法步骤如下：将土壤修复剂在空气温度20-30℃下堆制；堆制是在覆盖草帘下进行，堆制开始后每20天翻堆一次，翻堆时补水至含水量50-70％，堆制时间持续 100天；堆制完成后摊晾至干燥后即可直接施用于土壤。
17.本发明提供一种上述获得的土壤修复剂在次生盐渍化土壤中的应用。
18.通过以上技术方案，本发明取得如下技术效果：
19.(1)本发明提供的次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂，利用巨大芽孢杆菌 (bacillus megaterium)cgmcc no.1640和胶冻样芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)cgmcc no.1641两种菌株进行混合，利用专用的培养基分别进行培养扩增，菌种混合液充分吸附于载体中，并与辅料相混合，利用发酵技术制备土壤修复剂，该土壤修复剂可以改良次生盐渍化土壤的品质，改良和活化土壤，降解土壤中的有害物质，改善农作物的生长环境，改善作物品质，提高作物产量和品质。
20.(2)本发明选用的巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cgmcc no.1640 和胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)cgmcc no.1641两种菌株利用本发明提供的专用培养基分别进行培养扩增具有较强的生长繁殖能力，生长速率快，遗传特性稳定，具有转化硝酸盐的基因和能力，主要通过硝酸盐同化途径转化硝酸盐为微生物体内有机氮，对土壤修
复有特定的作用。
21.(3)本发明提供的次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂的制备方法简单，成本低，在次生盐渍化土壤中应用，属于采用已有老菌种巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)cgmcc no.1640和胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus) cgmcc no.1641两种菌株的新用途，增加了土壤微生物数量，降低了土壤ec 值，增加了土壤有机质含量，降低了土壤硝酸盐含量，提高了土壤有机质含量和土壤微生物活性，为设施农业种植减少氮肥施用，调控氮素循环，保护环境促进土壤健康提供有效措施。
具体实施方式
[0022][0023]
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
[0024]
本发明选用的巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cgmcc no.1640和胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)cgmcc no.1641菌种都已作为前期公知菌种，本领域普通技术人员可通过中科院微生物菌种保藏中心(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc)调用或购买获得，都已作为公知材料为本领域科研生产选用。
[0025]
本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
[0026]
实施例1：
[0027]
本发明选用的菌株巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cgmcc no.1640，编号为xhs0019p，已于2005年3月7日，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080，保藏号为：cgmcc no1640。根据受体菌的来源，经过新疆特殊生态环境下筛选、选育和驯化而获得，依照伯杰氏系统细菌学手册第八版，经过微生物学鉴定，xhs0019p菌为巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)，具有解磷属性，属于解磷细菌类。该菌种的培养温度30℃，培养时间2-3天，ph＝7.0，其菌体形态、芽孢椭圆或柱状、中生，形态趋于扭曲状，菌落形态光泽，略微发黄，采用常见的固体和液体培养基对于本发明应用制备土壤修复剂是可以的，但是对于次生盐渍化土壤中应用发现不适合，体现具体情况就是巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cgmcc no.1640属于解磷细菌类，对于次生盐渍化土壤中应用制备土壤修复剂带来应用效果的不显著和不明显，究其原因就是微生物菌种的特殊性和特异性，此菌种对于培养基的选择更为明显。
[0028]
本发明选用的菌株胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)cgmcc no. 1641，编号为xhs0012k，已于2005年3月7日，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080，保藏号为：cgmcc no.1641。根据受体菌的来源，经过新疆特殊生态环境下筛选、选育和驯化而获得，依照伯杰氏系统细菌学手册第八版，经过微生物学鉴定，xhs0012k菌为胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)，具有解钾属性，属于解钾细菌类。该菌种的培养温度30℃，培养时间3-4天，ph＝7.2，培养成熟后，培养基表面有薄薄的一层白色孢子，菌体呈杆状，两段钝圆，芽孢中生或端生，有时成链状排列、或单个排列，较有规则，采用常见的固体和液体培养基对于本发明应用制备土壤修复剂是可以的，但是对于次生盐渍化土壤中应用
16h，至菌含量为11-20亿/ml，ph＝6.0-6.2，获得胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)种子液。
[0044]
(3)将上述步骤(2)培养两种菌种种子液接种于盛有上述步骤(1)提供的专用液体培养基的500ml锥形瓶中，无菌操作，巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)于温度30-31℃、ph＝5.8-6.6、120r/min发酵10-14h，至芽孢含量占60-80％，ph＝6.2-6.4，总菌数28-35亿/ml，即获得巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)发酵液，胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)于29-30℃、 160r/min，发酵26-34h，至芽孢含量占95％以上，ph＝5.8-6.2，总菌数20-25亿 /ml，即获得胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)发酵液。
[0045]
(4)选用步骤(3)制备的巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)发酵液和胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)发酵液按照体积比1:1，制备复合菌种的混合液。
[0046]
(5)将步骤(4)制备的复合菌种混合液充分吸附于载体中，载体选用草炭；辅料采用尿素和磷酸钙，其中尿素与磷酸钙的重量比为1:2；载体和辅料的用量按照重量比为1:1.5配比混合，加水至含水量40-70％，然后按体积比每立方米载体与辅料混合用料加入上述步骤(4)制备的复合菌种混合液100-300g，并混合均匀，制备获得土壤修复剂。
[0047]
上述巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cgmcc no.1640采用常见的固体和液体培养基对于本发明应用制备土壤修复剂是可以的，但是对于次生盐渍化土壤中应用发现不适合，体现具体情况就是巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)cgmcc no.1640属于解磷细菌类，对于次生盐渍化土壤中应用制备土壤修复剂带来应用效果的不显著和不明显，究其原因就是微生物菌种的特殊性和特异性，此菌种对于培养基的选择更为明显。
[0048]
上述胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)cgmcc no.1641采用常见的固体和液体培养基对于本发明应用制备土壤修复剂是可以的，但是对于次生盐渍化土壤中应用发现不适合，体现具体情况就是胶冻样芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)cgmcc no.1641属于解钾细菌类，对于次生盐渍化土壤中应用制备土壤修复剂带来应用效果的不显著和不明显，究其原因就是微生物菌种的特殊性和特异性，此菌种对于培养基的选择更为明显。
[0049]
实施例3：次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂
[0050]
本实施例在实施例1-2的基础上，提供一种次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂，其制备方法中，巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)发酵液为10kg，胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)发酵液为10kg，复合菌剂按照200g/kg 接种获得土壤修复剂。
[0051]
实施例4：次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂
[0052]
本实施例在实施例1-2的基础上，提供一种次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂，其制备方法中，巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)发酵液为10kg，胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)发酵液为5kg，复合菌剂按照100g/kg接种获得土壤修复剂。
[0053]
实施例5：次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂
[0054]
本实施例在实施例1-2的基础上，提供一种次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂，其制备方法中，巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)发酵液为10kg，胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)发酵液为15kg，复合菌剂按照300g/kg接种获得土壤修复剂。
[0055]
实施例6：次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂
[0056]
本实施例在实施例1-2的基础上，提供一种次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂，其
制备方法中，巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)发酵液为10kg，胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)发酵液为17kg，复合菌剂按照250g/kg接种获得土壤修复剂。
[0057]
实施例7：适用于次生盐渍化土壤修复的土壤修复剂性能测定
[0058]
本实施例在实施例1-6的基础上，对本发明提供的土壤修复剂按照gb/t 6679规定的采样方法进行采样，批次随机抽取10-15袋，无菌条件下从每袋中取样200-300g，然后将所有样品混匀，按四份法缩分，取样进行性能指标参数的测试，具体测试结果见表1-2所示。
[0059]
其中微生物胞外多糖含量采用苯酚-硫酸法进行测定。
[0060]
粪大肠菌群的测定按照gb/t19524.1的规定执行。
[0061]
蛔虫卵死亡率按照gb/t19524.2的规定执行。
[0062]
汞、砷、铬、镉、铅的测定按照gb/t 23349的规定执行。
[0063]
硝态氮含量按照gb/t 32737-2016中紫外分光光度法测定氮含量，硝态氮转化率按照其中，ω1：第0天的土壤硝态氮含量，mg/kg；ω2：第15 天的土壤硝态氮含量，mg/kg。
[0064]
表1：本发明产品理化指标测定结果
[0065][0066]
表2：本发明产品生化指标测定结果
[0067][0068]
由表1-2的数据可知，本发明提供的土壤修复剂经测试有效活菌数≥5.2
×
108个/g，杂菌率≤20％；有机质≥47％；硝态氮转化率≥63％；胞外多糖≥6.1mg/g，表明本发明提供的土壤修复剂满足gb/t 20287-2006的要求。
[0069]
实施例8：次生盐渍化土壤修复用土壤修复剂的应用
[0070]
进一步对本发明提供的土壤修复剂进行性能方面的验证，将本发明提供的土壤修复剂应用于次生盐渍化土壤蔬菜种植，同时将未添加任何土壤修复剂的做参照，记作空白；将市售的土壤修复剂(“田美乐”土壤修复剂，主要成分为植物分泌物酶、氨基酸以及植物蛋白及其它有机物和少量的矿质营养元素)做对照组，记作市售；将本公司cn105154353a提供的土壤修复剂做对照组，记作对照1；将本公司cn105154334a提供的土壤修复剂做对照组，记作对照2；本公司cn105296380a提供的土壤修复剂做对照组，记作对照3。本试验共有6 个处理和5个对照，每组4次重复，共16个小区，每个小区45m2，试验采取完全随机区组排列，为
了减少边际效应，小区之间留1.2m的缓冲区。
[0071]
本试验在库尔勒市的塑料温室大棚中进行(30m
×
70m)。表层土壤(0～15cm) 的性质如表3所示。
[0072]
表3：温室土壤的理化性质
[0073][0074]
试验过程
[0075]
将培养15d且生长均一的黄瓜幼苗按45000株每亩移栽入每个小区。在黄瓜生长期间采用沟灌保持田间持水70-80％。在黄瓜结果初期，对黄瓜进行取样测定总生物量、蔓长、茎粗、叶面积指数和叶片数。黄瓜的产量采用累计法测定。
[0076]
试验结果
[0077]
(1)温室大棚土壤修复剂对温室黄瓜生长、产量和品质的影响
[0078]
由表4数据可知，和对照组相比，市售普通土壤修复剂、本发明制备的土壤修复剂均可以显著提高黄瓜的产量。但是市售普通土壤修复剂提高产量15％，对照1土壤修复剂提高产量为49％，对照2土壤修复剂组提高产量为84.4％，对照3土壤修复剂组提高产量为15.9％，本发明土壤修复剂产量较空白提高了一倍，较对照组修复剂提高了15％以上，可见本放制备的土壤修复剂组明显优于对照组，温室大棚土壤修复剂处理均能降低黄瓜中硝酸盐。
[0079]
表4：温室大棚土壤修复剂对温室黄瓜生长、产量和品质的影响
[0080][0081][0082]
(2)温室大棚土壤修复剂对黄瓜营养成分的影响
[0083]
由表5数据可知，本发明提供的土壤修复剂对黄瓜果实中的氮和锰含量均没有显著性影响。和对照组相比，能够显著降低黄瓜中的铜含量。可见本发明提供的土壤修复剂能够改善温室土壤质量，修复温室土壤。
[0084]
表5：温室大棚土壤修复剂对黄瓜营养成分的影响
[0085]
处理空白市售对照1对照2对照3本发明n(g/kg)36.736.335.534.339.036.0p(g/kg)6.476.066.055.997.886.00
k(g/kg)52.950.953.558.269.461.2ga(g/kg)10.6810.6110.2110.0812.579.22mg(g/kg)4.424.224.324.265.744.18na(g/kg)2.141.532.383.193.542.24mn(mg/kg)202019192020cu(mg/kg)402120221911zn(mg/kg)936054109112117
[0086]
上述系列试验通过选择多年前的保藏菌巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium) cgmcc no.1640和胶冻样芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)cgmcc no. 1641，充分利用其具有很好的转化硝酸盐的基因和能力，主要通过硝酸盐同化途径转化硝酸盐为微生物体内有机氮，通过本发明创造性的设置专用培养基和培养方法，制备的土壤修复菌剂的加入增加了土壤微生物数量，降低了土壤ec 值，增加了土壤有机质含量，降低了土壤硝酸盐含量，提高了土壤有机质含量和土壤微生物活性，为设施农业种植减少氮肥施用，调控氮素循环，保护环境促进土壤健康提供有效措施，因此通过老菌种新用途的实践，本发明采用巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cgmcc no.1640和胶冻样芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)cgmcc no.1641分别培养混合制备的土壤修复剂在修复次生盐渍化土壤方面具有广泛而实际的价值。
[0087]
通过上述系列实施例实验验证获得本发明筛选选育驯化获得的巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cgmcc no.1640和胶冻样芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)cgmcc no.1641的菌株具有较强的生长繁殖能力，生长速率快，遗传特性稳定，并对土壤修复有特定的作用，是一种复合菌土壤修复剂，通过实践与公司此前获得的修复菌剂对土壤的改良效果和对产品性能的影响，其能有效改良次生盐渍化土壤，对于降低土壤中的有害物质、解决土壤盐渍化、降低土壤对果蔬的不利影响降低至最低限度，有利于提高蔬菜的产量和品质，获得显著突出的技术效果。
[0088]
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属技术领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。