纳米纤维素稳定的皮克林乳液喹乙醇印迹微球制备方法

1.本发明属于高分子特异性吸附材料制备技术领域，具体涉及一种新型pikering（皮克林）乳液分子印迹聚合方法，及基于该聚合方法的纳米纤维素稳定的喹乙醇印迹微球的制备方法。


背景技术：

2.喹乙醇（olaquindox，ola）是一种抗菌促生长剂，不但能促进蛋白同化，提高饲料转换率，使动物生长加快，还具有较强的抑菌作用，欧洲国家早在20世纪70年代就作为饲料添加剂用于动物生产。近年来研究表明喹乙醇药物具有明显的蓄积毒性，长期食用残留该药物的食品可引起致癌、致畸或致突变。我国于2019年禁止将喹乙醇药物用于畜禽生产过程中。
3.目前，喹乙醇检测方法有酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、电化学检测法、荧光检测法和高效液相色谱-质谱法等。复杂的食品样品基质对检测方法的灵敏度、检测结果的准确度及稳定性有较大的影响，提取、净化与富集食品中喹乙醇及其代谢物是检测前的关键样品前处理步骤。样品前处理方法有固相萃取法、基质分散固相萃取法和固相微萃取法等。样品前处理方法效率主要取决于吸附材料在萃取装置中的吸附性能，具有选择性好、吸附速率快等特性的吸附材料是提高食品中喹乙醇残留检测方法分析性能的基础。
4.分子印迹技术是合成高分子吸附材料的简单有效方法，具有优异选择性、理化稳定性、重复利用性等显著优点。pikering乳液印迹聚合方法使用固体颗粒代替乳化剂作为稳定剂，有机溶剂用量更少，降低了对环境的破坏。与传统乳液聚合法相比，pikering乳液印迹聚合方法制备的聚合物粒径更均一，分散性更好。现有技术是以二氧化硅为固体稳定剂制备了印迹聚合物；和以生物炭为固体稳定剂制备了四环素印迹微球。目前以二氧化硅、生物炭等作为固体稳定剂的印迹聚合物获得了均一的微球结构，但制备印迹微球的孔穴数量与结构仍有待改进，这影响了印迹微球对目标物的吸附性能。


技术实现要素：

5.发明目的本发明针对现有pikering乳液聚合分子印迹技术合成的印迹吸附材料孔穴数量少、吸附速率慢等缺陷，提出了一种基于纳米纤维素稳定的皮克林乳液喹乙醇印迹微球的制备方法。
6.技术方案纳米纤维素稳定的皮克林乳液喹乙醇印迹微球制备方法，制备过程如下：(1) 将1.5~3.0 mg纳米纤维素分散于1ml去离子水中作为水相；(2) 将模板分子喹乙醇、功能单体甲基丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈溶于甲苯中作为油相；喹乙醇、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为1：3~7：6~9；偶氮二异丁腈与喹乙醇的质量摩尔比为35~45mg：1mmol；
(3) 将步骤(2)得到油相加入到步骤(1)得到的水相中，在14000~16000转/min的均质器中均质制备皮克林乳液。
7.(4) 将步骤(3)制备的皮克林乳液置于60~80 ℃水浴锅中热聚合16~20 h，聚合反应结束后用去离子水清洗3~4次，获得的聚合物在50 ℃下真空干燥，然后以甲醇/醋酸混合溶液为洗脱液经索氏提取器去除模板分子，50 ℃下真空干燥后获得喹乙醇印迹微球。
8.在步骤(1)中，纳米纤维素的长径比为18~19。
9.在步骤(2)中，模板分子喹乙醇与致孔剂甲苯的摩尔质量体积比为1mmol：400~600 μl。
10.在步骤(3)中，将步骤(2)得到油相加入到步骤(1)得到的水相中，油相水相体积比为1：4~6。
11.其特征在于：在步骤(4)中，甲醇与醋酸的体积比为7~8：2~3；洗脱时间为72~80 h。
12.优点及效果本发明提供的纳米纤维素稳定的皮克林乳液喹乙醇印迹微球制备方法，主要提高了喹乙醇印迹微球表面的孔穴结构和数量，从而能快速的吸附目标物，具有合成简单、成本低廉、产物得率高的优点；采用的稳定剂纳米纤维素取材范围广，绿色无环境污染性；该方法制备的喹乙醇分子印迹微球，比表面积大，吸附快速稳定，适宜作为固相萃取柱的填充材料应用于精准高效净化、富集动物源性食品和饲料中喹乙醇及其代谢物残留监测过程的样品前处理中，应用前景巨大。
附图说明
13.图1（a）为喹乙醇印迹微球扫描电镜图，（b）为喹乙醇非印迹微球扫描电镜图；图2为喹乙醇印迹（mip）和非印迹微球（nip）对喹乙醇的等温吸附曲线；图3为喹乙醇印迹（mip）和非印迹（nip）微球对喹乙醇的吸附动力学曲线；图4为喹乙醇印迹微球不同再生次数吸附能力。
具体实施方式
14.下面参照附图对本发明进行详细的说明：本发明是一种纳米纤维素稳定的皮克林乳液喹乙醇印迹微球制备方法，将纳米纤维素分散于去离子水中作为水相，将模板分子喹乙醇、功能单体甲基丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈溶于甲苯中为油相，通过高速匀质获得稳定乳液后加热条件下制备喹乙醇印迹聚合物。本发明中，纳米纤维素只作为乳液稳定剂，并未参加聚合反应，模板分子洗脱过程中纳米纤维素可随同模板分子一起从聚合物中洗脱出来，增加了印迹微球的孔穴结构，提高了印迹微球对目标物的吸附速率和稳定性。
15.本发明纳米纤维素稳定的皮克林乳液喹乙醇印迹微球制备方法，其制备步骤如下：(1) 将1.5~3.0 mg纳米纤维素分散于1ml去离子水中作为水相；(2) 将模板分子喹乙醇、功能单体甲基丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、引发剂偶氮二异丁腈溶于甲苯中作为油相；喹乙醇、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为1：3~7：6~9；偶氮二异丁腈与喹乙醇的质量摩尔比为35~45mg：1mmol；
(3) 将步骤(2)得到油相加入到步骤(1)得到的水相中，在14000~16000转/min的均质器中均质制备皮克林乳液。
16.(4) 将步骤(3)制备的皮克林乳液置于60~80 ℃水浴锅中热聚合16~20 h，聚合反应结束后用去离子水清洗3~4次，获得的聚合物在50 ℃下真空干燥，然后以甲醇/醋酸混合溶液为洗脱液经索氏提取器去除模板分子，50 ℃下真空干燥后获得喹乙醇印迹微球。
17.上述步骤(1)中，纳米纤维素的长径比为18~19。
18.上述步骤(2)中，模板分子喹乙醇与致孔剂甲苯的摩尔质量体积比为1mmol：400~600 μl。
19.上述步骤(3)中，将步骤(2)得到油相加入到步骤(1)得到的水相中，油相水相体积比为1：4~6。
20.上述步骤(4)中，甲醇与醋酸的体积比为7~8：2~3；洗脱时间为72~80 h。
21.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
22.实施例1本发明纳米纤维素稳定的皮克林乳液喹乙醇印迹微球制备方法，其制备步骤如下：(1) 将1.5 mg长径比为18的纳米纤维素分散于1ml去离子水中作为水相；(2) 将1 mmol模板分子喹乙醇、3mmol功能单体甲基丙烯酸、6mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、35 mg引发剂偶氮二异丁腈溶于400 μl甲苯中作为油相；(3) 将1ml步骤(2)得到油相加入到4 ml步骤(1)得到的水相中，在14000转/min的均质器中均质制备皮克林乳液；(4) 将步骤(3)制备的皮克林乳液置于60 ℃水浴锅中热聚合16 h，聚合反应结束后用去离子水清洗3次，获得的聚合物在50 ℃下真空干燥，然后以甲醇/醋酸体积比为7：3混合溶液为洗脱液经索氏提取器去除模板分子，洗脱时间为72h，50 ℃下真空干燥后获得喹乙醇印迹微球。
23.实施例2本发明纳米纤维素稳定的皮克林乳液喹乙醇印迹微球制备方法，其制备步骤如下：(1) 将2.5 mg长径比为18.5的纳米纤维素分散于1ml去离子水中作为水相；(2) 将1 mmol模板分子喹乙醇、4 mmol功能单体甲基丙烯酸、8 mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、40 mg引发剂偶氮二异丁腈溶于500 μl甲苯中作为油相；(3) 将1ml步骤(2)得到油相加入到5 ml步骤(1)得到的水相中，在15000转/min的均质器中均质制备皮克林乳液；(4) 将步骤(3)制备的皮克林乳液置于70 ℃水浴锅中热聚合18 h，聚合反应结束后用去离子水清洗3次，获得的聚合物在50 ℃下真空干燥，然后以甲醇/醋酸体积比为7：3混合溶液为洗脱液经索氏提取器去除模板分子，洗脱时间为78 h，50 ℃下真空干燥后获得喹乙醇印迹微球。
24.实施例3本发明纳米纤维素稳定的皮克林乳液喹乙醇印迹微球制备方法，其制备步骤如下：
(1) 将3.0 mg长径比为19的纳米纤维素分散于1ml去离子水中作为水相；(2) 将1 mmol模板分子喹乙醇、7 mmol功能单体甲基丙烯酸、9 mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、45 mg引发剂偶氮二异丁腈溶于600 μl甲苯中作为油相；(3) 将1ml步骤(2)得到油相加入到6 ml步骤(1)得到的水相中，在16000转/min的均质器中均质制备皮克林乳液；(4) 将步骤(3)制备的皮克林乳液置于80 ℃水浴锅中热聚合20 h，聚合反应结束后用去离子水清洗3次，获得的聚合物在50 ℃下真空干燥，然后以甲醇/醋酸体积比为8：2混合溶液为洗脱液经索氏提取器去除模板分子，洗脱时间为80 h，50 ℃下真空干燥后获得喹乙醇印迹微球。
25.由图1可见，喹乙醇印迹微球表面有丰富的孔穴结构，有利于提高印迹微球对目标物的吸附速率。
26.以下实施例4：非印迹微球的制备（nip）：实施条件与实施例1相同，但是不添加模板分子喹乙醇。
27.实施例4：取7ml初始浓度分别为5mg/l，10mg/l，20mg/l，30mg/l，40mg/l，60mg/l，80mg/l，100mg/l，120mg/l的喹乙醇（ola）溶液与25 ml容量瓶中，然后分别加入10 mg由实施例1和实施例4制备的喹乙醇印迹微球（mip）和非印迹微球（nip），室温下在摇床上120 r/min震荡吸附4 h。时间结束后，过0.45 μm滤膜后收集澄清溶液，未吸附的喹乙醇浓度用紫外-可见分光光度法测定，根据结果计算吸附容量。结果如图2所示，图2为mip和nip的等温吸附曲线，由图2可知，mip和nip的吸附容量随着初始浓度的增加而增加，浓度为在100 mg/l时，mip对喹乙醇的吸附容量为4.52 mg/g，nip最大吸附容量为2.05 mg/g。mip对喹乙醇的吸附容量显著高于nip对喹乙醇的吸附容量，说明合成的mip对喹乙醇具有特异选择特性。
28.实施例5：将7份10 mg mip分别加入含有10 ml浓度为20 mg/l的喹乙醇甲醇溶液中，然后室温下把该7份混合物在水平振荡器上以120 r/min转速下振荡5 min、10 min、20 min、40 min、60 min、80 min、120 min。振荡时间结束后，过0.45 μm滤膜后收集澄清溶液，未吸附的喹乙醇浓度用紫外-可见分光光度法测定，根据结果计算吸附容量。结果如图3所示，可知制备的mip对目标物喹乙醇具有较快的吸附速率，在实验浓度下能在60 min内达到吸附平衡。
29.实施例6：将实施例1的喹乙醇分子印迹微球应用于测定牛肉、虾、和鸡蛋中喹乙醇残留的具体案例如下：称取5g牛肉、虾及鸡蛋样品，加入10ml 0.1mol/l磷酸氢二钠-乙酸乙酯（v：v；9：1）提取液提取，混合均匀，超声处理20 min，超声功率和温度为400 w，40 ℃，然后4000 r/min，离心10 min后取上清液。该操作重复操作两次，合并两次上清液。将合并后的上清液使用氮气在40 ℃下吹干，用10 ml甲醇水溶液重新溶解，通过固相萃取之后进行液相色谱分析。
30.固相萃取的方法如下：将100 mg实施例1a中所获得的印迹微球装入聚四氟乙烯小柱中，用6 ml甲醇/水（60：40；v/v）对聚四氟乙烯柱进行活化，以甲醇溶液配置标准样品，并取10 ml上样。之后，
以2 ml甲醇/冰乙酸（80：20；v/v）进行洗脱，然后用液相色谱进行测定，聚四氟乙烯柱使用甲醇/水（60：40；v/v）进行再生，以重复使用。
31.由图4可知，制备的mip重复使用5次后对吸附能力没有影响。
32.结论：以本发明的吸附材料作为固相萃取吸附剂，对牛肉、虾以及鸡蛋中的喹乙醇及其代谢物进行吸附，通过hplc检测，对喹乙醇和喹乙醇代谢物3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的加标回收率分别为82.17％~97.64％，相对标准偏差为3.73％~5.01％，富集倍数为15～20倍。本发明中制备的喹乙醇印迹微球可用于动物源食品中喹乙醇残留检测中。
33.以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。