具有IDO1/TDO抑制活性的小檗碱衍生物的制备及用途

具有ido1/tdo抑制活性的小檗碱衍生物的制备及用途
技术领域
1.本发明属于药物化学领域，具体涉及一种具有ido1/tdo抑制活性的小檗碱衍生物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.色氨酸（trp）是蛋白质合成所必须的氨基酸，是人体所必需的氨基酸。色氨酸在体内的代谢途径主要有犬尿氨酸途径和5-羟色胺途径两种代谢途径。其中犬尿氨酸途径是色氨酸代谢的最主要途径，约95%的色氨酸都是通过该途径进行代谢
[1-2]
。ido1/tdo与肿瘤的免疫逃逸相关。肿瘤免疫治疗通过激活或调动机体自身的免疫系统，从而控制与清除肿瘤，是继手术、放疗和化疗后又一重要肿瘤治疗手段，包括免疫检查点抑制剂、肿瘤疫苗、过继免疫细胞治疗等多种方法
[3]
。
[0003]
ido1是催化色氨酸代谢的限速酶，色氨酸的过度消耗会抑制t细胞免疫反应。ido1 在多种肿瘤组织中过度表达，诱发机体免疫系统对其免疫耐受，发生免疫逃逸
[4]
。ido1和tdo催化色氨酸分解代谢，可以维持机体正常的免疫反应幅度和持续时间，防止健康细胞产生不受抑制的免疫激活
[5]
。但在恶性肿瘤中ido1和tdo的表达上调，导致色氨酸耗竭和犬尿氨酸等下游产物的积累，创造了一个免疫抑制微环境，使肿瘤细胞逃避有效的免疫应答。研究表明 ido1 和 tdo 在多种癌症细胞如乳腺癌、宫颈癌、脑癌等上调表达，与肿瘤的侵袭性和患者的不良预后相关
[6,7]
，其抑制剂已成为癌症免疫治疗的新策略。在过去的 20多年里，通过高通量筛选、天然产物结构修饰、基于结构的药物设计等方式，已经有多种结构类型的 ido1抑制剂被报道，基本骨架种类包括如：吲哚、芳基咪唑、n-羟基脒、喹啉、醌等。并且有多个 ido1 抑制剂进入临床研究，如 indoximod、pf-06840003、navoximod、epacadostat、linrodostat等。
[0004]
ido1/tdo活化与多种疾病发病机制密切相关，是肿瘤、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、抑郁症等相关疾病领域的重要靶点，因此在治疗广泛类型肿瘤方面具有的极大潜力，但至今仍没有ido/tdo抑制剂上市，因此，寻找和开发新型高效的ido抑制剂具有重要的理论意义和应用价值。
[0005]
小檗碱是中药黄连中的主要药效成分，作为抗菌药物已拥有悠久的药用历史
[8]
。随着研究水平的不断提高以及分子生物技术的发展，人们逐渐发现小檗碱还具有降血糖
[9]
、降血脂
[10]
、抗炎
[11]
、抗肿瘤
[12]
等多种药理活性，其中小檗碱的抗肿瘤活性一直被广为研究，作为具有多靶点的天然产物，其具体的作用靶点和机制还尚待阐明。ido1和tdo是肿瘤免疫治疗的重要靶标。我们通过活性筛选技术发现小檗碱类衍生物具有很好的ido1/tdo酶抑制活性，因此对小檗碱进行更多的结构修饰和改造，对开发新的ido1/tdo抑制剂具有重要研究价值。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种小檗碱衍生物及其制备方法和其作为ido1/tdo抑制剂的用途。
[0007]
本发明提供一种小檗碱衍生物，其立体异构体、溶剂合物或其药学上可接受的盐，或同位素标记化合物，所述结构通式如结构i-vi所示：
。
[0008]
其中，r1和r2各自独立地为氢、羟基或甲氧基、c
2-c6的烷基链；r3和r4各自独立地为氢、甲氧基，或r3和r4连接为亚甲二氧基；r5为等甲胺基；a环独立地为未取代的或取代的苯环或者噻吩环；d环独立地为未取代的或取代的苯环或者噻吩环；b环为六元碳环或者含n、o、s杂原子的七元环。
[0009]
本发明提供一种制备合成如结构式v所示小檗碱衍生物的方法，其特征在于，它包括如下工艺流程：本发明还提供一种小檗碱类衍生物在制备tdo和/或ido1抑制剂上的用途，其特征在于，所述的小檗碱类衍生物为权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物。
[0010]
进一步地，所述抑制剂是用于预防或治疗由ido1/tdo介导的肿瘤、代谢紊乱疾病、自身免疫病、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、抑郁症等相关疾病的药物。
[0011]
实验结果证明，本发明所制备的化合物对ido1/tdo酶具有较好的抑制效果，在制备用于预防或治疗由ido1/tdo介导的相关疾病领域具有广阔的应用前景。
[0012]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
[0013]
图1 为本发明化合物ber-1的核磁氢谱图。
[0014]
图2 为本发明化合物ber-5的核磁氢谱图。
具体实施方式
[0015]
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照本文或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件也均为本领域技术人员容易获得的。
[0016]
实施例1：化合物ber-1的合成参照文献（new j. chem., 2020, 44, 1761
‑‑
1771）的方法：将市售的盐酸小檗碱置于烧瓶中，在20-30mmhg 的减压条件下190度加热搅拌得红棕色粉末。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.11 (s, 1h), 8.02 (s, 1h), 7.62 (s, 1h), 7.24 (d, j = 7.8 hz, 1h), 6.96 (s, 1h), 6.40 (d, j = 7.8 hz, 1h), 6.10 (s, 2h), 4.50 (t, j = 6.1 hz, 2h), 3.74 (s, 3h), 3.04 (t, j = 6.0 hz, 2h)。
[0017]
实施例2-4：化合物ber-2、ber-3和ber-4的合成实施例2：化合物ber-2的合成参照我们之前的发明的方法合成（cn 111808121 a）。所合成的化合物数据及图谱与其一致。
[0018]
以2,3-二甲氧基苄胺和3,4-亚甲二氧基溴苯为初始原料，经过酰化、碘代、sonogashira偶联、c-h活化/环化、亲核取代、环合等步骤得到目标化合物5-氧杂高b环小檗碱（ber-2）。
[0019] （1）化合物3的合成：向干燥的50 ml双颈瓶中加入2,3-二甲氧基苄胺1（4 mmol）和2-吡啶羧酸2（4 mmol，1.0 equiv.），氩气置换3次，注入dcm（20 ml）溶解，将反应液至于-10
ꢀ°
c预冷5分钟。加入et3n（8 mmol，2.0 equiv.），搅拌均匀后，缓慢滴加pocl3（8 mmol，2.0 equiv.）。滴毕，于-10
°
c反应5小时后移至室温过夜。tlc监测反应完毕后，移入分液漏斗，依次用饱和na2co3溶液、h2o、饱和nacl溶液反洗，经无水na2so4干燥、减压浓缩得粗品。粗品经柱层析纯化（洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯 = 5/1）得化合物3，收率为84 %，白色固体。
[0020]
（2）化合物5的合成：向500 ml圆底瓶中加入3,4-亚甲二氧基溴苯4（6.0 g，3.0 mol）、agtfa（7.24 g，3.3 mol），注入70 ml dcm溶解。降温至-20
ꢀ°
c，向反应体系缓慢滴加i2的dcm/et2o（150 ml / 70 ml）溶液，滴毕室温过夜。反应液经减压浓缩、柱层析（洗脱液为石油醚）得目标化合物5，收率为85 %，化合物5为白色固体。
[0021]
（3）化合物6的合成：向100 ml双颈瓶中加入化合物5（13.2 mmol）、pd(pph3)2cl2（0.66 mmol，0.07 equiv.）、cui（1.3 mmol，0.1 equiv.），ar换气3次。注入干燥的et3n （40 ml），室温搅拌均匀后，加入三甲基硅乙炔（14.5 mmol，1.1 equiv.）。室温过夜反应。tlc监测反应完成后，直接减压浓缩除去溶剂。然后向残留物中加入水和乙酸乙酯进行萃取，合并乙酸乙酯层，并用饱和nacl溶液反洗、无水na2so4干燥，减压浓缩后得到深棕色油状物。最后通过硅胶柱层析（洗脱液为石油醚）分离纯化得到目标化合物6，收率为58%，白色固体。
[0022]
（4）化合物7的合成：于15 ml封管中依次加入化合物3（0.2 mmol）、化合物6（0.3 mmol）、co(oac)2·
4h2o （0.31 mmol）、kpf6（0.1 mmol）和2.5 ml peg-400。反应液氧气置换3次后置于140
ꢀ°
c油浴反应24小时。tlc监测反应完成后，加入乙醚萃取。合并乙醚层，无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂，残留物采用硅胶柱层析（洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯 = 20/1）分离纯化得
目标产品7，收率为51%，黄色固体。
[0023]
（5）化合物8的合成：将化合物7（0.26 mmol）、cucl2（0.013 mmol，0.05 equiv.）、k2co3（0.78 mmol，3.0 equiv.）、乙二醇4.0 ml依次加入到10 ml圆底瓶中。反应液置于130
ꢀ°
c反应20小时。tlc监测反应完成后，直接柱层析（洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯 = 2/1）分离纯化得化合物8，收率为60%，黄色固体。
[0024]
（6）化合物ber-2的合成：向圆底瓶中加入化合物8（0.283 mmol）、socl2（3 ml），室温搅拌3小时。搅拌下将反应液缓慢倾倒入冰水中，室温搅拌5分钟。然后加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和nacl溶液反洗，无水na2so4干燥。减压浓缩后通过硅胶柱层析（洗脱剂为二氯甲烷/甲醇 = 10/1）分离纯化得目标产品ber-2，收率为63%，黄色固体。
[0025]
实施例3：化合物ber-3的合成如上合成路线所示，以关键中间体7为原料，经亲核取代、环合等步骤得到目标化合物5-氮杂高b环小檗碱（ber-3）。
[0026]
（1）化合物9的合成：将化合物7（0.26 mmol）、cucl（0.026 mmol，0.1 equiv.）、koh（0.52 mmol，2.0 equiv.）和4.0 ml氨基乙醇依次加入到10 ml圆底瓶中。反应液置于90
ꢀ°
c反应8小时。tlc监测反应完成后，直接柱层析（洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯 = 2/1）分离纯化得化合物9，收率为45%，黄色固体。
[0027]
（2）化合物ber-3的合成：向圆底瓶中加入化合物9（0.283 mmol）、socl2（3 ml），室温搅拌3小时。搅拌下将反应液缓慢倾倒入冰水中，室温搅拌5分钟。然后加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和nacl溶液反洗，无水na2so4干燥。减压浓缩后通过硅胶柱层析（洗脱剂为二氯甲烷/甲醇 = 10/1）分离纯化得目标产品ber-3，收率为50%，黄色固体。
[0028]
实施例4：5-硫杂高b环小檗碱（ber-4）的合成如上合成路线所示，以关键中间体7为原料，经亲核取代、环合等步骤得到目标化合物5-硫杂高b环小檗碱（ber-4）。
[0029]
（1）化合物10的合成：将化合物7（0.13 mmol）、cuo（0.26 mmol，2.0 equiv.）、巯基乙醇（1.3 mmol，10.0 equiv.）和二氧六环2.0 ml依次加入到15 ml封管中。反应液于130
°
c反应24小时。tlc监测
7.46 (s, 1h), 6.96 (s, 1h), 6.05 (s, 2h), 4.32
–
4.28 (m, 2h), 3.97
–
3.93 (m, 2h)。
[0035]
实施例6：化合物ber-6的合成参照实施例3的方法合成。本实例的合成示意图与步骤与实施例3的区别仅在于：将实施例3的原料化合物7替换为化合物12，化合物9替换为化合物14。黄色固体，收率50%。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.23 (s, 1h), 8.44 (t, j = 6.0 hz, 1h), 8.21
ꢀ–ꢀ
8.16 (m, 1h), 8.13 (d, j = 5.4 hz, 1h), 7.54 (d, j = 5.4 hz, 1h), 7.27 (s, 1h), 6.54 (s, 1h), 5.96 (s, 2h), 3.79 (t, j = 5.9 hz, 2h), 3.49 (q, j = 5.9 hz, 2h).
13
c nmr (151 mhz, dmso-d6) δ 153.0, 149.1, 146.7, 143.5, 142.88, 139.0, 134.7, 133.2, 123.9, 116.2, 114.6, 109.4, 101.0, 94.3, 45.6, 44.6。实施例7：化合物ber-7的合成参照化合物ber-1的合成方法。将所合成的化合物ber-2置于烧瓶中，在20-30mmhg 的减压条件下190度加热搅拌得红棕色粉末，收率86%。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.44 (d, j = 4.4 hz, 1h), 7.75 (d, j = 3.9 hz, 1h), 7.43 (d, j = 7.9 hz, 1h), 7.24 (s, 1h), 6.88 (s, 1h), 6.68 (d, j = 8.3 hz, 1h), 6.14 (s, 2h), 4.57 (dd, j = 13.1, 5.0 hz, 2h), 3.80 (s, 3h), 3.59
ꢀ–ꢀ
3.46 (m, 2h)。
[0036]
实施例8：化合物ber-8的合成将市售的盐酸小檗碱1g置于烧瓶中，在20-30mmhg 的减压条件下190度加热搅拌得红棕色粉末。然后不经纯化直接将该粗品溶于无水乙醇20 ml中，室温搅拌下加入4-甲基哌嗪1.54 g及37%甲醛水溶液1.26 ml并升温至80℃反应24 h。减压浓缩除去溶剂，快速硅胶柱层析（二氯甲烷：甲醇=20：1）纯化后得暗红色固体，将此固体溶于二氯甲烷中，0℃下缓慢滴加氯化氢的乙醇溶液，室温搅拌1 h，抽滤，滤饼干燥可得橙色固体508 mg。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.96 (s, 1h), 8.74 (s, 1h), 8.58 (s, 1h), 8.10 (s, 1h), 7.09 (s, 1h), 6.19 (s, 2h), 4.88 (d, j = 8.7 hz, 4h), 4.11 (s, 3h), 3.22
ꢀ–ꢀ
3.14 (m, 3h), 3.13
ꢀ–ꢀ
3.06 (m, 2h), 1.76 (d, j = 12.9 hz, 2h), 1.68
ꢀ–ꢀ
1.46 (m, 4h), 0.91 (d, j = 5.8 hz, 3h)。
[0037]
实施例9：化合物ber-9的合成
= 5.1 hz, 1h), 4.19 (s, 3h), 4.09 (s, 3h), 3.77 (t, j = 6.5 hz, 2h), 3.39 (t, j = 6.6 hz, 2h)。
[0041]
实施例10：化合物ber-10的合成参照化合物ber-1的合成方法，将市售的化合物18置于烧瓶中，在20-30mmhg 的减压条件下190度加热搅拌得红棕色粉末。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.81 (s, 1h), 8.83 (s, 1h), 7.97 (d, j = 8.7 hz, 1h), 7.68 (s, 1h), 7.54 (d, j = 8.7 hz, 1h), 7.06 (s, 1h), 4.85 (t, j = 6.2 hz, 2h), 3.99 (s, 3h), 3.93 (s, 3h), 3.86 (s, 3h), 3.20 (t, j = 6.3 hz, 2h)。
[0042]
实施例11：化合物ber-11的合成（1）化合物19的合成将2 g化合物4溶于thf，冷却至-78℃，缓慢滴加正丁基锂4.5 ml（2.5 m的正己烷溶液），搅拌1.5 h后加入过量的环氧乙烷，搅拌0.5 h后，缓慢升至室温。反应结束后加入饱和氯化铵溶液，乙醚萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂，残留物采用硅胶柱层析（洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯 = 10/1）分离纯化得目标产品，收率为89%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 6.78
ꢀ–ꢀ
6.65 (m, 3h), 5.93 (s, 2h), 3.81 (t, j = 6.5 hz, 2h), 2.78 (t, j = 6.5 hz, 2h)。
[0043]
（2）化合物20的合成将1.4 g化合物19和3 g agtfa溶于60 mlthf，0℃滴加i2（2.4 g）的thf溶液90 ml，滴毕后移至室温过夜反应。反应结束后加入na2s2o3溶液搅拌，ea萃取，有机层用饱和食盐水反洗。合并有机层，无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂，残留物采用硅胶柱层析（洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯 = 10/1）分离纯化得目标产品，收率为53%。
[0044]
（3）化合物21的合成向100 ml双颈瓶中加入化合物20（2.6 g）、pd(pph3)2cl2（140 mg）、cui（58 mg），ar换气3次。注入干燥的et3n （40 ml），室温搅拌均匀后，加入三甲基硅乙炔（1.6 ml）。室温过夜反应。tlc监测反应完成后，直接减压浓缩除去溶剂。然后向残留物中加入水和乙酸乙酯进行萃取，合并乙酸乙酯层，并用饱和nacl溶液反洗、无水na2so4干燥，减压浓缩后得到黄色油状物。最后通过硅胶柱层析（洗脱液为石油醚）分离纯化得到目标化合物21，收率为85%。
[0045]
（4）化合物22的合成将0.5 g化合物21溶于thf中，加入四丁基氟化铵溶液（1m in thf）110μl，反应结束后加入稀盐酸溶液和ea，有机层用纯水和饱和食盐水洗涤，合并有机层，无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂，残留物采用硅胶柱层析（洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯 = 10/1）分离纯化得目标产品，收率为89%。
[0046]
（5）化合物24的合成向50 ml双颈瓶中加入140 mg市售的化合物23、 pd(pph3)2cl2（9 mg，0.02 equiv.）、cui（3.7 mg，0.03 equiv.），ar换气3次。注入干燥的et3n （20 ml），室温搅拌均匀后，加入化合物22（14.5 mmol，1.1 equiv.）。室温过夜反应。tlc监测反应完成后，直接减压浓缩除去溶剂。然后向残留物中加入水和乙酸乙酯进行萃取，合并乙酸乙酯层，并用饱和nacl溶液反洗、无水na2so4干燥，减压浓缩后得到深棕色油状物。最后通过硅胶柱层析（洗脱液为石油醚/乙酸乙酯 = 2/1）分离纯化得到目标化合物24，收率为36%。
[0047]
（6）化合物25的合成向50 ml双颈瓶中加入76.4 mg化合物24，27.2 mg乙酸铵，4 mg硝酸银和叔丁醇2 ml，ar换气3次，室温搅拌过夜。反应结束后加入饱和nh4cl溶液，ea萃取，合并乙酸乙酯层，无水na2so4干燥，减压浓缩后通过硅胶柱层析（洗脱液为石油醚/乙酸乙酯 = 2/1）分离纯化得到目标化合物24，收率为88%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 9.62 (t, j = 0.9 hz, 1h), 7.74 (d, j = 1.0 hz, 1h), 7.64 (t, j = 8.0 hz, 1h), 7.40 (d, j = 8.2 hz, 1h), 6.97
ꢀ–ꢀ
6.86 (m, 3h), 6.00 (s, 2h), 4.05 (s, 3h), 3.98 (t, j = 5.7 hz, 2h), 2.82 (t, j = 5.7 hz, 2h)。
[0048]
（7）化合物ber-11的合成参照实施例2（6）化合物ber-2的合成，本实例的合成步骤与实施例2（6）的区别仅在于：将实施例2 （6）的原料化合物8替换为化合物25，收率为80%。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.94 (s, 1h), 8.96 (s, 1h), 8.13 (t, j = 8.0 hz, 1h), 7.86 (s, 1h), 7.75 (d, j = 8.2 hz, 1h), 7.41 (d, j = 7.8 hz, 1h), 7.10 (s, 1h), 6.19 (s, 2h), 4.93 (d, j = 6.7 hz, 2h), 4.14 (s, 3h), 3.17 (d, j = 4.9 hz, 2h). 13
c nmr (100 mhz, dmso-d6) δ 157.7, 150.7, 148.2, 146.1, 140.45, 139.7, 139.0, 131.8, 120.7, 120.4, 119.2, 118.2, 109.3, 108.9, 106.2, 102.7, 57.2, 55.3, 26.8。
[0049]
实施例12：化合物ber-12和ber-13的合成
6.4 hz, 4h), 1.42 (d, j = 6.9 hz, 2h), 1.34 (s, 2h)。
[0052]
实施例14：化合物ber-15的合成参照文献（bioorg. med. chem. 2013, 21, 62
–
69.）的方法合成。将1.5 g化合物ber-1溶于甲醇中，加热回流至溶解，室温下分批加入0.76 g nabh4，搅拌2 h后过滤，滤饼用甲醇冲洗得到粗品，用乙酸乙酯重结晶得到白色固体，收率76%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 6.76
ꢀ–ꢀ
6.71 (m, 2h), 6.67 (d, j = 8.3 hz, 1h), 6.59 (s, 1h), 5.92 (s, 2h), 5.67 (s, 1h), 4.25 (d, j = 15.6 hz, 1h), 3.87 (s, 3h), 3.54 (d, j = 18.7 hz, 2h), 3.28
ꢀ–ꢀ
3.13 (m, 3h), 2.85 (s, 1h), 2.67 (d, j = 13.8 hz, 2h)。
[0053]
实施例15：本发明化合物对ido1/tdo酶抑制活性评价1.实验方法人n末端ido1和tdo在大肠杆菌中表达，镍亲合层析纯化而得。使用重组hido1，htdo和l-色氨酸作为底物通过紫外吸收进行测定。为了检测化合物对tdo和ido1酶的抑制活性，将重组htdo(100nm)和hido1(100nm)与一定浓度的化合物在室温下在含有400mm色氨酸，40mm抗坏血酸，200μg/ml的过氧化氢酶，20μm亚甲基蓝，ca
2
，mg
2 -无磷酸钾缓冲液培育系统中培养。对于阴性对照(空白)，加入5μl测定缓冲液代替酶，加入10％dmso代替抑制剂。对于阳性对照，加入epacadostat代替抑制剂。温育1小时后，向每个系统中加入30％三氯乙酸，并在65℃温育15分钟以终止酶反应并将n-甲酰基犬尿氨酸转化为犬尿氨酸。然后，将来自各系统的100μl上清液与等体积的含有dmab(二甲基氨基苯甲醛，3％，w/v)的乙酸混合，并使用multiscan光谱mk3(thermo fisher)在480nm波长下检测光密度。从l-犬尿氨酸标准曲线确定犬尿氨酸浓度。最后，使用graphpad prism 5 .0软件处理数据。通过以上实验方法，测试了各化合物针对tdo和ido1的抑制活性。
[0054]
2.实验结果表1所示为本发明合成的化合物对ido1/tdo酶的抑制活性数据。可以看出，本发明制备的化合物能够有效地抑制tdo和ido1，特别是化合物ber-1和ber-7，对tdo和（或）ido1具有明显的抑制效果。
[0055]
表1.本发明化合物对ido1/tdo抑制活性数据
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