识别抗RS病毒的抗体、以及使用了该抗体的免疫测定方法及免疫测定仪器与流程

识别抗rs病毒的抗体、以及使用了该抗体的免疫测定方法及免疫测定仪器
技术领域
1.本发明涉及rs病毒的免疫测定方法和免疫测定仪器以及用于该测定方法和该仪器的抗rs病毒抗体。


背景技术：

2.单克隆抗体由于仅识别特定的抗原，因此正在被广泛地用于该特定的抗原的检测。在rs病毒(respiratory syncytial virus，呼吸道合胞病毒)的包膜中存在作为糖蛋白的g蛋白和与细胞融合相关联的f蛋白(非专利文献1)。已知g蛋白在rs病毒的亚型(a型、b型)间氨基酸序列的差异大(非专利文献1)。另一方面，已知f蛋白即使在rs病毒的亚型(a型、b型)间氨基酸序列的差异也小，大量的rs病毒检查试剂盒检测出了f蛋白。然而，仅通过提高抗体对f蛋白的亲和性，很难开发显示足以能够无遗漏地检测临床分离株这样的实用的阳性检测率的rs病毒检查试剂盒(专利文献1)。
3.另外，rs病毒的n蛋白也称为核蛋白，由391个氨基酸残基构成。n蛋白是被称为核衣壳的核糖核蛋白复合物的构成部分，它围绕着rs病毒的基因组rna并形成螺旋结构。已知n蛋白在rs病毒的亚型(a型、b)间氨基酸序列的差异最小。然而，仅用针对n蛋白的抗体无遗漏地检测临床分离株这点是非常困难的，在能够无遗漏地检测临床分离株这样的rs病毒检查试剂盒的开发中，需要混合针对f蛋白的抗体和针对n蛋白的抗体(专利文献1)。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1日本专利第6454274号公报
7.非专利文献
8.非专利文献1collins pl and karron ra.respiratory syncytial virus.in:knipe dm et al.，eds.fields virology，6th ed.lippincott williams&wilkins，philadelphia:pp 1086-1123(2013).


技术实现要素：

9.目前，正在销售使用了各种抗rs病毒抗体的检查试剂。但是，在利用这些以往的rs病毒检查试剂进行了rs病毒的检测时，灵敏度不够。
10.鉴于上述现状，本发明的目的在于提供一种灵敏度高的抗rs病毒抗体、以及使用了该抗体的检查试剂。
11.本发明人等发现，为了在判定部位高效地捕捉样本中所含有的rs病毒而提高免疫色谱装置的灵敏度，通过使用针对rs病毒的n蛋白(核蛋白)的抗体而能够提高rs病毒的检测灵敏度，从而完成了本发明。
12.即，本发明如下所述。
13.[1]一种抗rs病毒n蛋白单克隆抗体或其抗原结合性片段，包含重链可变区和轻链
可变区，所述重链可变区包含由序列号1所表示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含序列号2、3或4所表示的氨基酸序列。
[0014]
[2]一种抗rs病毒n蛋白单克隆抗体或其抗原结合性片段，包含：重链可变区，包含具有与序列号1所表示的氨基酸序列90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并具有对rs病毒n蛋白的结合活性；以及轻链可变区，包含具有与序列号2、3或4所表示的氨基酸序列90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并具有对rs病毒n蛋白的结合活性。
[0015]
[3]根据[1]或[2]的抗rs病毒n蛋白单克隆抗体或其抗原结合性片段，其中，抗原结合性片段是选自由fab、fab’、f(ab’)2、单链抗体(scfv)、dsfv、双特异性抗体(diabody)和微型抗体(minibody)构成的组中的肽片段。
[0016]
[4]一种rs病毒检测用试剂，包含[1]～[3]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
[0017]
[5]根据[4]所述的rs病毒检测用试剂，其为免疫色谱法试剂。
[0018]
[6]一种rs病毒检测用试剂盒，包含[1]～[3]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
[0019]
[7]一种rs病毒检测方法，使用[1]～[3]中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段通过免疫学检测法进行检测。
[0020]
[8]根据[7]所述的方法，其是免疫色谱法。
[0021]
本说明书包含作为本技术的优先权的基础的日本专利申请号2019-204630号的公开内容。
[0022]
发明的效果
[0023]
本发明的方法由于在免疫测定中使用抗rs病毒n蛋白抗体，因此灵敏度高。另外，通过本发明，提供用于本发明的新型检测方法的免疫测定仪器和单克隆抗体。
具体实施方式
[0024]
通过本发明的方法检测的被检对象为rs病毒，使用将n蛋白识别为抗原的单克隆抗体。
[0025]
在本发明的方法中，使用将n蛋白识别为抗原的单克隆抗体或其抗原结合性片段进行免疫测定。在此，“识别”是指进行特异性反应、即抗原抗体反应这样的意思。“特异性”是指，在蛋白质与该抗体互相混合的液体体系中，该抗体不会与抗原的蛋白质成分在能够检测出的水平上发生抗原抗体反应、或者即使发生了某些结合反应或缔合反应也仅发生比该抗体与抗原的抗原抗体反应明显弱的反应。
[0026]
本发明的方法也可以使用以本发明的单克隆抗体为基础而仅使抗原结合部位分离出的抗原结合性片段。即，在使用通过公知的方法制作的、与rs病毒的n蛋白结合的fab、fab’、f(ab’)2、单链抗体(scfv)、dsfv、diabody、minibody等具有特异性抗原结合性的片段(抗原结合性片段)的情况下，这些片段也包含在单克隆抗体中，包括在本发明的范围内。另外，单克隆抗体的类别并不限定于igg，也可以是igm或igy。
[0027]
本发明的方法中使用的单克隆抗体可以通过下述过程得到：使用公知的免疫学方法，用包含目标抗原的复合物或提取物、或者抗原或它们的部分肽对被免疫动物进行免疫，使用被免疫动物的细胞制作杂交瘤。用于免疫的肽的长度不作特别限定，优选使用5个氨基
酸以上、更优选使用10个氨基酸以上的肽作为免疫原。免疫原也可以从培养液获得，但也可以通过将编码任意抗原的dna嵌入质粒载体中并将该载体导入宿主细胞使其进行表达而获得。作为免疫原的任意的抗原或其部分肽也可以表达为与在以下例示这样的蛋白质的融合蛋白，并在精制后或未精制的状态下用作免疫原。融合蛋白的制作可以利用本领域技术人员一般用作“蛋白质表达/精制标签”的谷胱甘肽s-转移酶(gst)、麦芽糖结合蛋白(mbp)、硫氧还蛋白(trx)、nus标签、s标签、hsv标签、frag标签、多组氨酸标签等。与这些蛋白质的融合蛋白优选使用消化酶将任意的抗原或其部分肽部分和除此以外的标签部分切断，并在进行了分离精制之后用作免疫原。
[0028]
从经免疫的动物进行单克隆抗体的制备可以通过众所周知的kohler等人的方法(kohler et al.，nature，vol，256，p495-497(1975))容易地进行。即，从经免疫的动物中回收脾细胞、淋巴细胞等抗体产生细胞，通过常规方法使该细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而制作杂交瘤，对所得到的杂交瘤通过有限稀释法等进行克隆，选择克隆后的各杂交瘤所产生的单克隆抗体中的、与用于动物免疫的抗原进行抗原抗体反应的单克隆抗体。
[0029]
从腹水、培养上清进行单克隆抗体的精制可以使用公知的免疫球蛋白精制法。例如，可以举出基于使用了硫酸铵、硫酸钠的盐析的分级法、peg分级法、乙醇分级法、deae离子交换色谱法、凝胶过滤法等。另外，根据免疫动物种和单克隆抗体的类别，也可以通过使用了结合有蛋白质a、蛋白质g、蛋白质l中的任一个载体的亲和色谱法进行精制。
[0030]
本发明的识别rs病毒的n蛋白的抗体的重链可变区的氨基酸序列包含序列号1所表示的氨基酸序列。另外，本发明的识别rs病毒的n蛋白的抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含序列号2、3或4所表示的氨基酸序列。
[0031]
重链可变区不仅包括包含序列号1所表示的氨基酸序列的重链可变区，还包括下述的重链可变区，即该重链可变区包含一种蛋白质，该蛋白质包含在序列号1所表示的氨基酸序列中缺失、替换、附加了1个或多个例如1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1或2个、进一步优选为1个氨基酸的氨基酸序列，并具有抗体的重链可变区的活性即对rs病毒的n蛋白的结合活性。轻链可变区不仅包括包含序列号2、3或4所表示的氨基酸序列的轻链可变区，还包括下述的轻链可变区，即该轻链可变区包含一种蛋白质，该蛋白质包含在序列号2、3或4所表示的氨基酸序列中缺失、替换、附加了1个或多个例如1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1或2个、进一步优选为1个氨基酸的氨基酸序列，并具有抗体的轻链可变区的活性、即对rs病毒的n蛋白的结合活性。
[0032]
作为这样的在序列号1、2、3或4的氨基酸序列中缺失、替换或附加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，可举出下述的氨基酸序列：在使用blast(basic local alignment search tool at the national center for biological information(美国国立生物学信息中心的基本局部比对搜索工具))等(例如默认即初始设定的参数)进行计算时，具有与序列号1、2、3或4的氨基酸序列至少85％以上、优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选97％以上的序列同一性。
[0033]
具有这样的在序列号1、2、3或4的氨基酸序列中缺失、替换或附加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质与具有序列号1、2、3或4的氨基酸序列的蛋白质实质上相同。
[0034]
本发明的识别rs病毒的n蛋白的抗体由上述的重链可变区和重链恒定区、以及上述的轻链可变区和轻链恒定区构成。重链恒定区由3个域ch1、ch2及ch3构成。重链恒定区为
igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区。另外，轻链恒定区由1个域c
l
构成。轻链恒定区是κ或λ恒定区。
[0035]
本发明的识别rs病毒的n蛋白的抗体可以通过下述过程产生：将编码上述的重链的dna和编码轻链的dna插入到表达载体，并使用该载体转化宿主细胞，培养该宿主细胞。编码重链可变区和轻链可变区的dna可从序列号1的氨基酸序列中获知。
[0036]
在本发明的免疫测定方法中，通过利用了如上述那样制作的单克隆抗体或其抗原结合性片段(以下，在实施例之前为止的描述中，除了从上下文明显可知不是这样的情况以外，“抗体”均意味着“抗体或其抗原结合性片段”)与样本中的抗原的抗原抗体反应的免疫测定来测定。作为用于此的免疫测定法，可以使用竞争法、凝聚法、蛋白质印迹法、免疫染色法、夹心法等对于本领域技术人员而言众所周知的任意的方法。需要说明的是，在本发明中，“测定”中包含定量、半定量、检测中的任一者。
[0037]
免疫测定优选夹心法。在夹心法中，以用两个抗体夹着抗原的形式形成复合物，检测该复合物。夹心法本身在免疫测定领域中是众所周知的，可以通过例如免疫色谱法或elisa法进行。这些夹心法本身都是众所周知的，本发明的方法除了使用将上述的n蛋白识别为抗原的单克隆抗体的情况以外，均可以通过众所周知的夹心法进行。
[0038]
在夹心法中，使用识别抗原的1种或2种以上的抗体(被固定化于固相的抗体和标记抗体)。在使用2种以上的抗体的情况下，这些2种抗体中的至少任一方是将上述的n蛋白识别为抗原的单克隆抗体。另外，也可以用相同的2个抗体夹着抗原而形成复合物。
[0039]
在以夹心法为检测原理的免疫测定中，作为将抗体固定化的固相，可以使用任何能够通过公知技术固定抗体的固相，可以任意地选择例如具有毛细管作用的多孔性薄膜(膜)、颗粒状物质、试管、树脂平板等公知的固相。另外，作为标记抗体的物质，可以使用酶、放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色颗粒、胶体颗粒等。在利用了上述各种材料的免疫测定法中，特别是从临床检查的简便性和快速性的观点出发，优选作为使用了膜的侧流式免疫测定法的免疫色谱法。
[0040]
在本发明中，还提供能够使用将n蛋白识别为抗原的单克隆抗体侧流式地进行免疫测定的免疫测定仪器。本发明所提供的免疫测定仪器是下述的免疫测定仪器，即，包括：支承体，具有将捕捉测定对象物(抗原)的抗体(抗体1)固定化的检测区域；标记体区域，具有能够移动的标记抗体(抗体2)；样品垫，待滴加样本；吸收带，吸收展开后的样本液；以及后衬片材，用于将这些部件贴合为一体，并且，抗体1和抗体2中的至少一者是本发明的将n蛋白识别为抗原的单克隆抗体。将该免疫测定仪器也称为免疫色谱试验片。
[0041]
支承体是具有对用于捕捉被检测物质(抗原)的抗体进行固定化的性能的材料，且具有不妨碍液体在水平方向上的通行的性能。优选为具有毛细管作用的多孔性薄膜，且为能够通过吸收来输送液体及分散于其中的成分的材料。构成支承体的材质不作特别限定，例如可举出纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚偏氟乙烯(pvdf)、玻璃纤维、尼龙、聚酮等。更优选使用其中的硝化纤维素制成薄膜的材质。将对抗体进行了固定化的膜称为抗体固定化膜。
[0042]
标记体区域由包含标记抗体的多孔基材构成，基材的材质可以使用通常使用的玻璃纤维、无纺布等。为了浸渗大量的标记抗体，该基材优选为厚度0.3mm～0.6mm左右的垫状。将浸渗有标记抗体并干燥后的多孔基材也称为干燥垫。
[0043]
标记抗体的标记大多使用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶之类的酶、胶体金之类的胶体金属、二氧化硅颗粒、纤维素颗粒、着色聚苯乙烯颗粒和着色胶乳颗粒等。在使用胶体金属颗粒、着色聚苯乙烯颗粒或着色胶乳颗粒等着色颗粒的情况下，由于这些标记试剂通过进行凝聚而发生着色，因此对该着色进行测定。将对抗体进行了固定化的颗粒称为抗体固定化颗粒。抗体的固定化量不作特别限定，只要在标记区域存在几ng～几十μg即可。
[0044]
检测区域是指将捕捉被检测物质(抗原)的抗体固定化的支承体的一部分的区域。在检测区域中，至少设置一个将用于捕捉抗原的抗体进行了固定化的区域。检测区域只要包含于支承体即可，只要在支承体上对抗体进行固定化即可。抗体的固定化量不作特别限定，只要在检测区域固定化几ng～几十μg即可。
[0045]
样品垫是用于滴加样本的部位，且是多孔材料。样品垫是位于免疫测定仪器的最上游的部位。该材料可以使用通常使用的滤纸、玻璃纤维、无纺布等。为了在免疫测定中使用大量的样本，优选为厚度0.3mm～1mm左右的垫状。样本中还包含将样本悬浮于其他的溶液而得到的试样等使用样本制备而成的试样。
[0046]
吸收带是用于吸收被供给至支承体且在检测区域不参与反应的成分的部件。材料可以使用由通常的天然高分子化合物、合成高分子化合物等构成的保水性高的滤纸、海绵等，但为了促进样本的展开，优选吸水性高的物质。
[0047]
后衬片材是用于将上述的所有的材料即支承体、样品垫、标记体区域、吸收带等局部重叠地贴附并固定的部件。关于后衬片材，只要这些材料以最佳的间隔配置并固定即可，不一定是必要的，但从制造上或者使用上的便利性来看，优选通常使用后衬片材。
[0048]
本发明的免疫测定仪器可以还存在有对照显示区域(部件)。对照显示区域是表示准确实施了试验的部位。例如，对照显示区域存在于检测区域的下游，当样本试样通过检测区域到达了对照显示区域时，通过着色等发出信号。在对照显示区域中，既可以预先将与结合有标记载体的抗体结合的物质固相化，也可以预先将当样本到达时颜色发生变化的ph指示剂等试剂固相化。在结合有标记载体的抗体是小鼠单克隆抗体的情况下，使用抗小鼠igg抗体即可。
[0049]
虽然免疫测定仪器的大小没有被限定，但例如纵向长度为几cm～十几cm，横向长度为几mm～几cm左右。
[0050]
本发明的免疫测定仪器也可以容纳于存放容器内，通过该存放容器能够防止例如由于紫外线、空气中的湿气所导致的劣化。另外，在使用具有污染性、感染性的样本试样的情况下，通过存放容器能够防止进行分析的试验者的污染或感染。例如，使用适当大小的树脂制壳体作为存放容器，将本发明的仪器收纳于该壳体中即可。有时将存放容器和容纳于其中的免疫测定仪器作为一体而称为免疫测定装置。
[0051]
包含本发明的抗rs病毒n蛋白单克隆抗体的rs病毒检测用试剂包括所述免疫测定仪器。另外，包含本发明的抗rs病毒n蛋白单克隆抗体的rs病毒检测用试剂盒包括所述免疫测定仪器。该试剂盒可以除此以外还包括小册子、样本采集仪器等。
[0052]
在本发明的方法中，在对抗体1进行了固定化的固相支承体，利用毛细管现象，使能够与用着色聚苯乙烯颗粒或胶体金等适当的标记物质进行了标记的被检测物质(标记试剂)结合的抗体2与被检测物质的复合物展开移动。其结果，固定化的物质-被检测物质-标记试剂的复合物形成于固相支承体上，检测从该复合物发出的标记试剂的信号(在为胶体
金的情况下，对能够与被检测物质结合的物质进行了固定化的固相支承体部分变红)，由此能够检测被检测物质。该免疫测定方法可以在5～35℃、优选室温下进行。
[0053]
此外，检测区域的数量以及标记体区域所包含的标记抗体的种类并不限于1个，通过使用与多个测定对象物对应的抗体，能够用同一免疫测定仪器检测2个以上的抗原。
[0054]
通过本发明的方法，能够检测是否感染了rs病毒，在被检体试样中检测出了n蛋白的情况下，能够判断为感染了rs病毒。
[0055]
在使用了本发明的识别n蛋白的抗体的情况下，能够特异性地识别rs病毒，识别n蛋白的抗体不会识别其他病毒例如腺病毒(adenovirus)、克沙奇病毒(coxsackievirus)、埃可病毒(echovirus)、单纯疱疹病毒(herpessimpus virus)、人类偏肺病毒(human metapneumovirus)、流感病毒(influenza virus)、麻疹病毒(measles virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、副流感病毒(parainfluenza virus)，不会误检测这些病毒。
[0056]
另外，即使是在使用了识别rs病毒的f蛋白的抗体的情况下无法检测出的临床分离株，也能够在使用了本发明的识别rs病毒的n蛋白的抗体的情况下进行检测。
[0057]
作为被检体试样，作为样本，使用咽拭子或鼻拭子、咽喉或鼻腔清洗液、鼻吸液、唾液、血清、直肠拭子、粪便、粪便悬浮液、尿、角膜拭子等即可。
[0058]
实施例
[0059]
以下，基于实施例更具体地说明本发明。但是，本发明并不限定于下述实施例。
[0060]
实施例1抗rs病毒n蛋白单克隆抗体的制作
[0061]
1.rs病毒n蛋白抗原的制备
[0062]
使具有感受性的哺乳类细胞感染rs病毒，在培养了数天之后通过紫外线照射使rs病毒感染细胞的培养液灭活，使用灭活后的产物。
[0063]
2.rs病毒n蛋白单克隆抗体的制作
[0064]
将步骤1.的rs病毒灭活抗原对balb/c小鼠进行免疫，通过从饲养了一定期间的小鼠摘出髂骨淋巴结的“小鼠髂骨淋巴结法”(sado y et al.，acta histochem.cytochem.3989-94(2006))，得到多个产生抗rs病毒n蛋白抗体的杂交瘤细胞株。
[0065]
将所取得的细胞株经腹腔给予经降植烷处理过的balb/c小鼠，在大约2周后，采集含抗体的腹水。从所得到的腹水通过使用了蛋白a柱的亲和色谱法精制igg，得到了多个精制抗rs病毒n蛋白单克隆抗体(以下，有时称为“抗n蛋白抗体”)。
[0066]
在以下的实施例中，使用了多个所得到的抗rs病毒n蛋白单克隆抗体中的考虑反应性和特异性而选择的抗体。
[0067]
实施例2测定rs病毒的免疫测定仪器
[0068]
1.抗rs病毒n蛋白抗体向硝化纤维素膜的固定化
[0069]
准备用缓冲液将实施例1中制作的抗n蛋白抗体稀释后的液体及抗小鼠igg抗体，在用pet膜打底的硝化纤维素膜的样品垫侧线状涂敷抗n蛋白抗体，在吸收体侧线状涂敷抗小鼠igg抗体。然后，使硝化纤维素膜在热风下充分干燥，得到抗n蛋白抗体固定化膜。
[0070]
2.抗rs病毒n蛋白抗体向着色聚苯乙烯颗粒的固定化
[0071]
使在实施例1中制作的抗n蛋白抗体与着色聚苯乙烯颗粒共价结合，并悬浮于悬浮液中，通过超声波处理使其充分地分散，得到了抗n蛋白抗体结合着色聚苯乙烯颗粒。在本
单纯疱疹病毒1型-人类偏肺病毒a型-人类偏肺病毒b型-流感病毒a/新喀里多尼亚型/20/99(h1n1)-流感病毒a/北京/262/95(h1n1)-流感病毒a/纽约/55/2004(h3n2)-流感病毒a/广岛/52/2005(h3n2)-流感病毒b/上海361/2002(山形系)-流感病毒b/马来西亚2506/2004(维多利亚系)-麻疹病毒-腮腺炎病毒-副流感病毒1型-副流感病毒2型-副流感病毒3型-副流感病毒4型-[0082]
如表1所示，使用了本发明的抗rs病毒n蛋白抗体的免疫测定仪器虽然与rs病毒反应，但对于其他的呼吸道感染症状的病因病毒不显示交叉反应性，因此能够确认对rs病毒具有特异性反应。
[0083]
实施例3抗rs病毒n蛋白单克隆抗体的可变区分析
[0084]
1.抗n蛋白抗体的可变区的碱基序列分析
[0085]
将产生在实施例1中制作的抗n蛋白抗体的杂交瘤细胞株发送给日本宝生物株式会社(takara bio co.，ltd.)，委托抗n蛋白抗体的可变区的碱基序列分析。由日本宝生物株式会社从杂交瘤细胞株中提取rna，从通过5
’‑
race pcr得到的抗n蛋白抗体可变区的扩增产物得到碱基序列。
[0086]
2.抗n蛋白抗体的可变区的氨基酸序列预测
[0087]
根据在步骤1中得到的碱基序列信息，使用imgt(注册商标)数据库的碱基序列分析工具即imgt/v-quest来预测可变区的氨基酸序列。将结果示于表2。
[0088]
[表2]
[0089][0090]
实施例4抗rs病毒n蛋白抗体的灵敏度比较
[0091]
对于从临床样本分离出并进行培养后的rs病毒3株，比较了使用本发明的抗n蛋白抗体的抗原检测试剂和使用市售的抗f蛋白抗体的抗原检测试剂的检测灵敏度。
[0092]
将从2016年采集的临床样本分离出的rs病毒3株分别接种于vero细胞并使其增殖。使用缓冲液制备rs病毒感染细胞培养上清液的2倍稀释系列，将其中的规定量添加到样本悬浮液中，将如此而得的物质作为试样。
[0093]
将结果示于表3。
[0094]
[表3]
[0095][0096]
使用从临床样本分离出的病毒3株实施灵敏度比较试验，其结果为，在3株中的2株中，使用了抗n蛋白抗体的抗原检测试剂显示出与使用了抗f蛋白抗体的抗原检测试剂同等以上的灵敏度。
[0097]
对于3株中的1株，在使用了抗f蛋白抗体的抗原检测试剂中完全没有发现反应，与此相对，在使用了抗n蛋白抗体的抗原检测试剂中显示出高检测灵敏度。
[0098]
工业适用性
[0099]
使用本发明的抗体，可以特异性地检测出rs病毒感染症。
[0100]
序列表自由文本
[0101]
序列号1～4合成
[0102]
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用直接并入本说明书。