一种Septin9甲基化检测组合物及其应用的制作方法

一种septin9甲基化检测组合物及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种septin9甲基化检测组合物及其应用。


背景技术：

2.结直肠癌(crc)是常见的胃肠道恶性肿瘤，随着人们生活习惯的改变，结直肠癌的发病率和死亡率明显上升，严重威胁着人类健康。结肠直肠癌早期症状不明显，随着肿瘤增大而表现出排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则发展为贫血、体重减轻等全身症状。
3.目前，临床主要采用粪便隐血试验(fobt)和结肠镜检查进行结直肠癌筛查。作为常规的筛查方法，fobt易受食物、药物和其他因素的影响，假阳性率高、稳定性较差。结肠镜检查是侵入性检查手段，需要肠道准备确保大肠管腔视野良好，同时，结肠镜检查存在一系列并发症，如肠活检部位容易出现肠穿孔、腹膜炎等。因此，结肠镜检查患者依从性较差。目前急需依从性高、检测方便、结果准确的结直肠癌检测方法以提高筛查准确性。
4.dna甲基化是指在不改变dna序列的前提下，在cpg岛5’端胞嘧啶修饰甲基化基团，造成dna表达沉默，是目前公认的肿瘤发生机制之一。dna异常甲基化的发生通常早于细胞癌变，因此及时检测dna甲基化可以实现恶性肿瘤的早期预警，为肿瘤的早期筛查、早期诊断、预后和治疗评估提供重要依据。
5.septin9基因位于17q25.3染色体上，septin家族是一组高度保守的gtp结合蛋白，广泛存在于人类细胞中，在细胞分裂过程中提供结构支撑。crc早期诊断试剂盒的检测靶点就是sept-v2这一区域。异常甲基化的septin9基因不仅存在于结直肠癌组织和患者外周血中，而且还与乳腺癌、卵巢癌、白血病和淋巴癌等密切相关。grutzmann等对各种肿瘤和非肿瘤疾病患者血浆中的septin9基因甲基化水平进行了系统研究，发现crc患者血浆中的septin9甲基化检出率远高于非结直肠癌肿瘤患者、非肿瘤疾病患者和正常人，说明血浆septin9甲基化对检测crc有较高的灵敏度和特异性，与非结直肠癌肿瘤患者、非肿瘤疾病患者和正常人具有显著性差异，这为septin9甲基化作为crc特有诊断标志物提供了临床依据。
6.虽然septin9甲基化可以作为crc早期筛查的有效生物标记物，但是与甲基化正常的野生型基因相比，septin9异常甲基化的比例极低，根据不同肿瘤分期，这一比例通常仅0.01％～10％。septin9甲基化检测的最大难题在于如何在高野生型基因背景下检测到痕量甲基化异常基因。
7.重亚硫酸盐转化法是最常用的甲基化检测方法，原理是采用重亚硫酸盐处理dna，将胞嘧啶残基转化成尿嘧啶，而被甲基化的胞嘧啶残基不受影响，因此，重亚硫酸盐处理后的dna片段只保留有甲基化胞嘧啶。基于此原理，重亚硫酸盐能在单个核苷酸水平上揭示dna的甲基化情况。已有多种检测方法可以实现对重亚硫酸盐处理后dna序列的分析，分析的实际问题就是重亚硫酸盐使碱基从c到u最终到t造成的区别。
8.但是，重亚硫酸盐转化法也存在诸多不足：(1)重亚硫酸盐测序需要确保重亚硫酸
盐转化反应完全，即每一个未被甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，如果转化反应不完全则会出现假阳性结果；(2)由于只有单链dna的胞嘧啶才能被重亚硫酸盐攻击，在转化前需要对dna进行变性解链，必须严格控制温度、盐浓度等因素，否则会造成转化失败或转化不完全；(3)dna在转化反应过程中有可能被降解，如果孵育时间过长、温度和重亚硫酸盐浓度过高，可能导致高达90％的dna被降解，降解后的dna脱嘌呤形成随机断裂，可能导致pcr扩增失败或dna样本数量少，准确性低，进而出现检测假阴性；(4)重亚硫酸盐处理会显著降低样本的复杂性，使得多重pcr引物设计更加困难，误差增加。
9.因此，发展一种高灵敏度dna甲基化检测方法，不需重亚硫酸盐处理、不需设置对照反应，成为迫切需要解决的问题。


技术实现要素：

10.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种septin9甲基化检测组合物及其应用，基于甲基化依赖型限制性内切酶和通用引物，并采用荧光定量pcr技术，检测与结直肠癌密切相关的septin9基因特殊位点上的甲基化情况，具有不需要重亚硫酸盐转化、操作简单、准确性高和特异性强的优点。
11.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
12.第一方面，本发明提供了一种septin9甲基化检测组合物，所述组合物包括甲基化依赖型限制性内切酶、捕获寡核苷酸和通用引物；
13.所述捕获寡核苷酸从5’端到3’端依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列；
14.所述折叠序列与septin9甲基化位点经甲基化依赖型限制性内切酶酶切后的5’末端序列至少部分相同；
15.所述结合捕获序列可与所检测的septin9甲基化位点所在的片段区域进行特异性的结合。
16.优选地，所述组合物还包括septin9甲基化特异性引物。
17.优选的，所述捕获寡核苷酸还包括第二通用序列。
18.优选地，所述第二通用序列位于结合捕获序列的5’端。
19.本发明中，septin9甲基化检测组合物主要包括甲基化依赖型限制性内切酶和基于通用引物的荧光定量pcr检测试剂两部分：甲基化依赖型限制性内切酶通过对septin9甲基化模板的甲基化位点进行酶切处理，形成5’端序列明确的中间产物；捕获寡核苷酸利用结合捕获序列捕获该中间产物，并以此作为模板进行延伸反应，在捕获寡核苷酸的3’末端添加与septin9甲基化基因互补的核苷酸，从而形成延伸的捕获寡核苷酸，延伸的捕获寡核苷酸通过延伸序列与其自身内部的折叠序列进行完全匹配或非完全匹配的配对，形成半发夹结构产物，半发夹结构产物再进行延伸反应，在3’末端添加与分子内部的第一通用序列互补的核苷酸，进而形成完整的发夹结构产物；所述发夹式结构产物利用通用引物和/或特异性引物进行pcr扩增，结合检测探针实现了septin9甲基化位点的荧光定量pcr检测。
20.优选地，所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断修饰。
21.优选地，所述核酸延伸阻断修饰有spacer、硫代基团或尿嘧啶碱基中的任意一种或至少两种的组合。
22.优选地，所述折叠序列修饰有核酸类似物。
23.优选地，所述核酸类似物包括肽核酸、锁核酸、转置碱基、2'-o,4'-c-methylene bridge rna、2
’‑
o-methyl rna或2
’‑
fluoro rna中的任意一种或至少两种的组合。
24.优选地，所述通用引物的核酸序列与捕获寡核苷酸的第一通用序列相同或部分相同。
25.优选地，所述甲基化依赖型限制性内切酶包括glai、fspei、mspji、lpnpi、aspbhi或msei中的任意一种或至少两种的组合。
26.本发明中，当甲基化依赖型限制性内切酶选择mspji时，mspji的酶切位点较多，靶标分子呈现小片段化，无法进行扩增；本发明在酶切步骤之前，向样本中加入septin9甲基化位点特异性的人工互补链，与甲基化位点互补结合形成局部双链，利用该酶双链特异性的特点，既能对特定的区域进行酶切，又防止了酶切位点过多导致酶切后的靶标分子呈现小片段化而无法扩增的问题。
27.优选地，所述组合物还包括检测探针。
28.优选地，所述检测探针标记有荧光基团和/或淬灭基团。
29.优选地，所述荧光基团标记在检测探针的5’端。
30.优选地，所述淬灭基团标记在检测探针的3’端。
31.优选地，所述荧光基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的任意一种。
32.优选地，所述淬灭基团包括bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的任意一种。
33.优选地，所述捕获寡核苷酸包括seq id no:1、seq id no:6、seq id no:11、seq id no:12或seq id no:13所示的核酸序列。
34.优选地，所述通用引物包括seq id no:2或seq id no:14所示的核酸序列。
35.优选地，所述septin9甲基化特异性引物包括seq id no:3或seq id no:7所示的核酸序列。
36.优选地，所述检测探针包括seq id no:4或seq id no:8所示的核酸序列。
37.优选地，所述septin9甲基化特异性互补链包括seq id no:9所示的核酸序列。
38.第二方面，本发明提供了一种septin9甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的组合物。
39.优选地，所述试剂盒还包括dna聚合酶、dntps或mg
2
中的任意一种或至少两种的组合。
40.优选地，所述试剂盒还包括酶切缓冲液和/或pcr缓冲液。
41.第三方面，本发明提供了一种septin9甲基化检测体系，所述体系包括1～20nm捕获寡核苷酸、100～400nm通用引物、100～300nm检测探针、1～2u/μl taq聚合酶、100～300μm dntp、1～5mm mgcl2和pcr缓冲液。
42.优选地，所述体系还包括100～300nm septin9甲基化特异性引物。
43.第四方面，本发明提供了一种septin9甲基化检测方法，所述方法包括：
44.采用甲基化依赖型限制性内切酶对待测septin9甲基化模板进行酶切处理，将酶切处理后的产物加入第三方面所述的体系中，进行荧光定量pcr。
45.优选地，所述酶切处理的温度为30～40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34
℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃。
46.优选地，所述酶切处理的时间为0.5～2h，例如可以是0.5h、1h、1.5h或2h，优选为1h。
47.优选地，所述荧光定量pcr的程序为92～95℃预变性2～5min；92～95℃变性10～20s，65～70℃退火80～100s，10～15个循环；92～95℃变性10～20s，65～70℃退火20～30s，30～50个循环。
48.优选地，所述方法在采用甲基化依赖型限制性内切酶对待测septin9甲基化模板进行酶切处理前，还包括加入septin9甲基化特异性互补链进行互补结合的步骤。
49.优选地，所述互补结合的条件为92～95℃变性10～15min，60～65℃退火1～2min。
50.第五方面，本发明提供了一种septin9甲基化检测装置，所述装置包括：
51.互补结合单元：用于加入septin9甲基化特异性互补链与待测septin9甲基化模板进行互补结合；
52.酶切处理单元：采用甲基化依赖型限制性内切酶对待测septin9甲基化模板进行酶切处理，获得5’端序列明确的预处理产物；
53.荧光定量pcr单元：利用含有捕获寡核苷酸、通用引物、septin9甲基化特异性引物和检测探针的荧光定量pcr体系对预处理产物进行荧光定量pcr检测。
54.优选地，所述互补结合的条件为92～95℃变性10～15min，60～65℃退火1～2min。
55.优选地，所述酶切处理单元提供的酶切处理温度为30～40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃。
56.优选地，所述酶切处理单元提供的酶切处理时间为0.5～2h，例如可以是0.5h、1h、1.5h或2h，优选为1h。
57.优选地，所述荧光定量pcr单元提供的荧光定量pcr程序为92～95℃预变性2～5min；92～95℃变性10～20s，65～70℃退火80～100s，10～15个循环；92～95℃变性10～20s，65～70℃退火20～30s，30～50个循环。
58.第六方面，本发明提供了第一方面所述的组合物、第二方面所述的试剂盒、第三方面所述的体系或第五方面所述的装置在制备疾病早期诊断试剂和/或设备中的应用。
59.优选地，所述疾病包括肿瘤。
60.优选地，所述肿瘤包括结直肠癌、胃癌或食管癌中的任意一种或至少两种的组合。
61.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
62.(1)本发明的septin9甲基化检测组合物主要包括甲基化依赖型限制性内切酶和基于通用引物的荧光定量pcr检测试剂两部分，不需要对甲基化样本进行连接反应、化学处理等额外步骤，仅需在pcr检测之前对样本进行预处理，得到5’端序列明确的样本，结合基于通用引物的扩增技术，实现了核酸的高特异、高灵敏的多重检测；
63.(2)本发明的septin9甲基化检测组合物中，捕获寡核苷酸与通用引物经过特殊设计，相互配合，在靶标分子存在的情况下，靶标分子触发由捕获寡核苷酸介导的延伸反应，形成发夹式结构产物，并以此作为通用引物扩增反应的模板，由于扩增反应基于5’序列确定的酶切产物，有效避免了假阳性问题；
64.(3)本发明中，当捕获寡核苷酸的3’延伸序列与折叠序列能够形成互补配对，才能引发捕获寡核苷酸的自我折叠形成发夹式结构，有效保证了反应的特异性；
65.(4)本发明的septin9甲基化检测试剂盒在针对不同靶标分子进行检测时，只需要根据靶标分子设计捕获寡核苷酸的折叠序列和结合捕获序列，而保持第一通用序列不变，极大程度降低多重靶标扩增的多种引物间干扰，提高扩增的灵敏度；
66.(5)本发明的septin9甲基化检测试剂盒通过指数扩增过程达到信号放大的目的，不仅能很好地满足dna/rna检测时对灵敏度的需求，而且所述指数扩增过程仅利用延长的捕获寡核苷酸和通用引物来完成，可在保持通用引物的数量和浓度不变的前提下达到对多重靶标分子的等效扩增目的，避免了序列差异导致的扩增效率的偏差；
67.(6)本发明的septin9甲基化检测方法操作简便。
附图说明
68.图1为qpcr检测不同浓度的甲基化样本和非甲基化样本中甲基化septin9基因的扩增曲线；
69.图2为qpcr检测不同比例的甲基化dna模板的扩增曲线；
70.图3为琼脂糖凝胶电泳检测不同比例的甲基化dna模板的扩增产物；
71.图4为ddpcr检测不同浓度的甲基化样本中septin9基因的拷贝数；
72.图5为特异性互补链酶切实验结果；
73.图6a为普通捕获寡核苷酸的检测特异性结果，图6b为lna修饰捕获寡核苷酸的检测特异性结果；
74.图7为基于双通用引物扩增模型的人源dna甲基化检测结果。
具体实施方式
75.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
76.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
77.实施例1人源septin9基因的甲基化dna检测
78.本实施例对人源septin9基因的甲基化dna进行检测，步骤如下：
79.(1)分别提取jurkat细胞系和hela细胞系的基因组dna，测序鉴定septin9基因的甲基化状态；
80.(2)采用甲基化依赖型限制性内切酶glai分别对jurkat细胞系、hela细胞系的基因组dna、阴性对照nc进行酶切反应，反应体系为10
×
酶切缓冲液2μl，5u glai，不同浓度的基因组dna(或阴性对照nc)，体系共20μl；反应条件为37℃孵育1小时；酶切反应结束后，将体系加热至85℃，孵育10分钟，对glai进行热灭活；
81.(3)分别向上述酶切反应体系中加入septin9基因捕获寡核苷酸、通用引物、特异性引物和检测探针，pcr检测septin9基因的甲基化状态，采取的pcr扩增体系包括酶切dna模板、10nm捕获寡核苷酸、200nm通用引物、200nm特异性引物、200nm检测探针、1u/μl taq聚合酶、200μm dntp、4.5mm mgcl2和2
×
pcr缓冲液，终体积为20μl；pcr反应程序为94℃预变
性5min；94℃变性10s，66℃退火90s，10个循环；94℃变性10s，65℃退火20s，40个循环；在roche仪器(480)上进行实时pcr，对相应的荧光数值进行采集；
82.捕获寡核苷酸(seq id no:1)：
83.5-tgtcagccaacggtattcatcgttgaccgcgggctcgccgctgccctccgc；
84.通用引物(seq id no:2)：
85.5-gcctgtcagccaacggtattcatc；
86.septin9特异性引物(seq id no:3)：
87.5-cgacccgctgcccaccag；
88.检测探针(seq id no:4)：
89.5-vic-ccatcatgtcggaccc-mgb；
90.人源septin9基因如seq id no:5所示，其中，下划线为甲基化位置，//为酶切位置：
91.5-gcgc//gttgaccgcggggtccgacatgatggctggtgggcagcgggtcgcgcggagggcagcggcgaggaa。
92.经测序鉴定发现，jurkat细胞系基因组的septin9基因是非甲基化的，而hela细胞系基因组的septin9基因是甲基化的。采用qpcr检测不同浓度的甲基化样本和非甲基化样本中septin9基因的甲基化状态，如图1所示，140拷贝(140copies)和28拷贝(28copies)为septin9甲基化样本的扩增曲线，分别为140拷贝/反应及28拷贝/反应的septin9甲基化基因样本，16000拷贝(16000copies)为非甲基化样本的扩增曲线，nc为ddh2o的扩增曲线。
93.由此说明，本发明能够灵敏、特异地检测septin9基因中的甲基化dna。
94.实施例2人源septin9基因不同甲基化比例dna检测
95.根据实施例1的测序鉴定结果，本实施例采用jurkat细胞系dna作为septin9甲基化阴性样本，hela细胞系dna作为septin9甲基化阳性样本，进行人源septin9基因不同甲基化比例dna的检测。步骤如下：
96.(1)以10000拷贝的jurkat细胞系dna作为背景，向其中掺杂1000拷贝、100拷贝、10拷贝的hela细胞系dna，构建甲基化比例分别为10％、1％、0.1％、0％的混合样本；
97.(2)采用实施例1的酶切反应体系和基于通用引物的荧光定量pcr体系对不同甲基化比例的dna样本进行检测；
98.(3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，称取0.6g琼脂糖粉末，加入20ml 1
×
tea溶液加热溶解，倒入模具冷凝成型，按照样本:上样缓冲液(loading buffer)＝5:1的比例配置混合上样液，加入琼脂糖凝胶的加样孔中，150mv电泳30min，凝胶成像观察扩增产物。
99.qpcr检测结果如图2所示，10％、1％、0.1％、0％的扩增曲线分别对应不同比例的甲基化dna模板，阴性对照为ddh2o的扩增曲线，甲基化比例分别为10％、1％、0.1％的样本可以稳定扩增，0％没有扩增，说明该体系具有优异的灵敏度和特异性；琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，10％、1％、0.1％组凝胶电泳有明显的目的条带，0％组没有条带，说明扩增结果正确。
100.实施例3septin9基因甲基化的ddpcr检测
101.利用实施例1相同的反应条件，在stilla公司naicatm crystal数字pcr仪器上进
行septin9基因的甲基化检测。
102.如图4所示为不同浓度的甲基化样本中septin9基因的拷贝数，左边为100拷贝/反应散点图，右边为10拷贝/反应散点图。其中，虚线以上散点为阳性液滴，虚线以下散点为阴性液滴。
103.由此可见，本发明可以在数字pcr仪上实现高灵敏septin9基因中的甲基化dna检测。
104.实施例4特定位点特异性互补链酶切实验
105.为了实现甲基化定点检测，本实施例选择了酶切位点丰富的甲基化依赖型限制性内切酶mspji，但是由于酶切位点较多，靶标分子呈现小片段化，无法进行扩增。利用该酶双链特异性的特点，通过高温变性，然后针对特定的甲基化位点加入人工互补序列，形成特定的局部双链，既能对特定的区域进行酶切，又防止了酶切位点过多导致酶切后的靶标分子呈现小片段化而无法扩增的问题。
106.步骤如下：
107.(1)分别提取jurkat细胞系和hela细胞系的基因组dna，测序鉴定septin9基因的甲基化状态；
108.(2)在酶切之前先将模板进行变性互补结合，buffer终浓度为1
×
，人工互补链终浓度为100nm，95℃高温变性10min，60℃退火2min，4℃保存；
109.(3)向酶切体系中加入1μl mspji和1μl 30
×
enzyme activator solution，37℃酶切30min，65℃高温灭活；
110.(4)取部分酶切产物加入到pcr体系中，pcr扩增体系包括酶切dna模板、450nm捕获寡核苷酸、450nm通用引物、450nm特异性引物、225nm检测探针、1u/μl taq聚合酶、200μm dntp、4.5mm mgcl2和2
×
pcr缓冲液，终体积为20μl；pcr反应程序为94℃预变性5min；94℃变性10s，66℃退火90s，10个循环；94℃变性10s，65℃退火20s，40个循环；在roche仪器(480)上进行实时pcr，对相应的荧光进行采集；
111.捕获寡核苷酸(seq id no:6)：
112.5-tgtcagccaacggtattcatcgggatcatttcggagggtcctctccagcacgtcc；
113.通用引物(seq id no:2)：
114.5-gcctgtcagccaacggtattcatc；
115.septin9特异性引物(seq id no:7)：
116.5-cggccgcagcagccag；
117.检测探针(seq id no:8)：
118.5-fam-cagcacccaccttcg-mgb；
119.特异性人工互补链(seq id no:9)：
120.5-cgaaatgatcccatccagctgcgcgttgacc-nh2；
121.人源septin9基因如seq id no:10所示，其中，下划线为甲基化位置，//为酶切位置：
122.acgcgcagctggat//gggatcatttcggacttcgaaggtgggtgctgggctggctgctgcggccgcggacgtgctggagaggaccctgc。
123.经鉴定hela细胞系基因组的septin9基因是甲基化的，在同等阳性基因组浓度下，
利用不同的方式对靶标分子进行处理之后扩增，如图5所示，阳性对照正常扩增，阴性对照(ddh2o)无扩增，体系正常工作。基因组进行高温变性(500拷贝基因组变性后酶切)或不酶切的组(500拷贝原始基因组)没有扩增，500拷贝基因组直接酶切扩增的一组有信号，但是500拷贝基因组 互补链组的扩增效率要明显高于直接酶切的。通过扩增发现，不酶切处理的基因组无法引发扩增，同时靶标分子进行高温变性后无法被内切酶识别切割也无法扩增。直接酶切靶标分子会导致模板碎片化有效模板浓度降低。人工互补链的加入可以形成局部双链，对靶标分子进行特定位点的切割，从而提高有效模板数量，提高灵敏度。
124.实施例5人源septin9基因甲基化位点检测特异性优化
125.本实施例采用甲基化转移酶处理的jurkat dna作为人源septin9基因甲基化阳性标准品，jurkat dna作为人源septin9基因甲基化阴性标准品，无核酸酶水作为阴性对照。采用甲基化依赖型限制性内切酶glai对样本进行酶切处理，分别用普通捕获寡核苷酸或lna修饰捕获寡核苷酸以及通用引物、特异性引物和检测探针进行扩增检测。
126.所使用的酶切条件和扩增条件，通用引物、特异性引物和检测探针与实施例1相同。采用的捕获寡核苷酸包括：
127.普通捕获寡核苷酸(seq id no:11)：
128.5-tgtcagccaacggtattcatcgttgaccgcgggctcgccgctgccctccgc；
129.lna修饰捕获寡核苷酸(seq id no:12)：
130.5-tgtcagccaacggtattcatcgttgacc g cgctcgccgctgccctccgc( 后面的碱基代表该碱基修饰锁核酸)；
131.人源septin9基因如seq id no:5所示。
132.结果如图6a和图6b所示，两种捕获寡核苷酸在120拷贝和12拷贝的阳性模板中都能显示阳性结果；但是在普通捕获寡核苷酸体系中，当非甲基化基因组(jurkat dna)添加到100ng的时候，普通捕获寡核苷酸组产生非特异性扩增，是由于捕获寡核苷酸的合成副产物与靶标分子结合延伸所引发的；在捕获寡核苷酸的折叠序列引入lna修饰后，既能保证扩增效率(能检测出120拷贝和12拷贝的阳性)，而且在高浓度非甲基化基因组(100ng)中，不会引发非特异性扩增，其抑制非特异性扩增的机制是，当折叠序列引入核酸类似物修饰后，能在保证折叠区域碱基互补配对的情况下，抑制引物的合成副产物延伸。所以通过结果可以看出，折叠序列的核酸类似物修饰能提高检测体系的特异性。
133.实施例6基于双通用引物扩增模型的人源dna甲基化检测
134.之前实施例的扩增模型，一条引物是通用引物，一条是来自于模板的特异性引物。将体系做进一步改进，在捕获寡核苷酸的捕获区域和折叠区域之间加入一条通用引物序列，利用延伸折叠引发扩增，使得扩增子的两端带有通用引物序列。实现了利用两条通用引物对甲基化模板进行了扩增。
135.采用甲基化转移酶处理的jurkat dna作为人源septin9基因甲基化阳性标准品，其中cg位点为5mcg，进行septin9基因甲基化位点检测。无核酸酶水作为阴性对照。步骤如下：
136.(1)采用甲基化依赖型限制性内切酶glai对阳性标准品(或阴性对照)进行酶切处理，反应体系为10
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酶切缓冲液2μl，5u glai，不同浓度的基因组dna，体系共20μl；反应条件为37℃孵育1小时；酶切反应结束后，将体系加热至85℃，孵育10分钟，对glai进行热灭
活；
137.(2)分别向上述酶切反应体系中加入septin9基因捕获寡核苷酸、通用引物和检测探针，pcr检测septin9基因的甲基化状态，采取的pcr扩增体系包括酶切dna模板、10nm捕获寡核苷酸、200nm第一通用引物、200nm第二通用引物、200nm检测探针、1u/μl taq聚合酶、1u/μl udg酶、300μm dntp、1.5mm mgcl2和2
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pcr缓冲液，终体积为20μl；pcr反应程序为94℃预变性5min；94℃变性10s，66℃退火90s，10个循环；94℃变性10s，65℃退火20s，40个循环；在roche仪器(480)上进行实时pcr，对相应的荧光数值进行采集；
138.捕获寡核苷酸(seq id no:13)：
139.tgtcagccaacggtattcatcgttgaccgcggggtcagatgtggcactgacaagcgaccagctgcccacca；
140.第一通用引物(seq id no:2)：
141.gcctgtcagccaacggtattcatc；
142.第二通用引物(seq id no:14)：
143.cggcgtcagatgtggcactgacaa；
144.检测探针(seq id no:4)：
145.5-vic-ccatcatgtcggaccc-mgb。
146.如图7所示，在双通用引物体系，1200拷贝、120拷贝、40拷贝和12拷贝阳性模板在酶切之后都能扩增且具有明显的浓度梯度。说明在双通用引物体系下，依然能实现septin9甲基化位点的扩增检测，且体系具有较高灵敏度。
147.综上所述，本发明采用甲基化依赖型限制性内切酶和基于通用引物的pcr扩增相结合的方式，不需重亚硫酸盐处理、不需设置对照反应，实现了septin9甲基化dna的精确定量检测，避免了序列差异导致的扩增效率的偏差，特异性好，适于推广应用。
148.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。