一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株、方法和应用

1.本发明属于发酵工程技术领域，尤其是一种合成柠檬酸黑曲霉(aspergillus niger)菌株，及其在发酵生产柠檬酸中的应用。


背景技术：

2.柠檬酸(citric acid)是中国工业化生产中产量最大的有机酸，在世界范围内，也是需求量最大的一种有机酸。柠檬酸在医药化工、食品工业、精密仪器清洗、化妆品等方面都有广泛运用(beherabc.crit rev microbiol.2020,46(6):727-749)。
3.黑曲霉为gras(generally recognized as safe)菌株，且具有营养要求简单、耐受低ph、等优势，在工业酶制剂、有机酸发酵等方面都应用广泛(papagianni m.biotechnol adv.2007,25(3):244-63)。
4.目前，全球柠檬酸产量达到150万吨，其中99％的柠檬酸是通过黑曲霉发酵生产而来(郭艳梅等，生物工程学报，2010，26(10):1410-1418)。随着全球对柠檬酸需求量不断增加，而利润空间狭小，因此通过增加柠檬酸的发酵强度和转化率，提高柠檬酸发酵水平是缓解行业困境的研究方向。消除发酵中副产物草酸的合成，有利于提高转化率。通过增强底物摄取能力，强化糖酵解途径，提高柠檬酸外泌能力是提高柠檬酸发酵水平的潜在策略。
5.通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株、方法和应用。
7.本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
8.一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株(aspergillus niger)，所述菌株是通过在黑曲霉中敲除敲除草酰乙酸水解酶基因oaha，单独或共同强化表达柠檬酸转运蛋白编码基因cexa、单独或共同强化表达葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstc、单独或共同强化表达己糖激酶基因hxka，单独或共同强化表达磷酸果糖激酶基因pfka、单独或共同强化表达葡萄糖高亲和力转运蛋白基因msta，单独或共同强化表达透明颤菌血红蛋白编码基因vgb获得而获得的。
9.进一步地，所述柠檬酸胞外转运蛋白基因cexa的dna序列为seq no.3以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seq no.4以及相似性80％以上的氨基酸序列；
10.或者，所述葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstc的dna序列为seq no.5以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seq no.6以及相似性80％以上的氨基酸序列。
11.进一步地，所述己糖激酶基因hxka的dna序列为seq no.7以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seqno.8以及相似性80％以上的氨基酸序列。
12.进一步地，所述磷酸果糖激酶基因pfka的dna序列为seq no.9以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seq no.10以及相似性80％以上的氨基酸序列。
13.进一步地，所述葡萄糖高亲和力转运蛋白基因msta的dna序列为seq no.11以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seq no.12以及相似性80％以上的氨基酸序列；
14.或者，所述透明颤菌血红蛋白编码基因vgb的dna序列为seq no.13以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seq no.14以及相似性80％以上的氨基酸序列。
15.进一步地，生产柠檬酸的黑曲霉的出发菌株为黑曲霉s469；黑曲霉s469是发明人前期获得的授权专利(中国专利，专利号：zl201810985901.9)中所用菌株。
16.或者，控制基因转录的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子pgpda和丙酮酸激酶基因启动子ppkia，其他的可在黑曲霉中发挥转录作用的启动子也可实现使上述基因表达上调的目的；
17.或者，敲除草酰乙酸水解酶编码基因oaha是利用oaha基因上下游同源序列，通过同源重组的方式将oaha基因表达盒从基因组中删除。
18.进一步地，所述oaha基因上下游同源序列片段序列分别为seq no.1以及相似性为70％以上的dna序列、seq no.2以及相似性为70％以上的dna序列。
19.如上所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株在柠檬酸发酵生产中的应用。
20.利用如上所述的黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸的方法，步骤如下：
21.将黑曲霉菌株接种在能够使黑曲霉产孢子的培养基上，在0～45℃条件下培养，直至产生新鲜孢子；
22.收集孢子，以1
×
105～2
×
106个/ml的孢子浓度接种于种子培养基，然后进行种子液的培养，种子液的培养条件是：10～45℃，100～350rpm条件下振荡培养0～30h，得到种子液；
23.将种子液以0～15％的接种量接种至发酵培养基中，在0～35℃，100～350rpm条件下发酵，即得柠檬酸；
24.其中，种子培养基的配方是：0％～55％玉米淀粉浊液，0％～10％(nh4)2so4，溶剂为水；
25.所述述发酵培养基为：0％～85％玉米淀粉清液，0％～50％玉米淀粉浊液，溶剂为水；
26.上述百分数均为质量百分数。
27.进一步地，所述能够使黑曲霉产孢子的培养基为pda培养平板。
28.本发明取得的有益效果是：
29.1、本发明从消除发酵中副产物草酸的合成，从而提高底物合成柠檬酸的转化率。
30.2、本发明通过增强细胞对底物的摄取能力，强化糖酵解途径，提高柠檬酸外泌能力等多个维度提高柠檬酸的发酵水平和生产强度。
31.3、本发明黑曲霉菌株最优条件35℃，250rpm振荡培养72h、120h条件下，发酵液中柠檬酸浓度为81.5g/l、143.2g/l，发酵强度为1.19g/l/h。
32.4、本发明对产柠檬酸菌株普遍适用，可使柠檬酸发酵产量提高近20％。利用δoaha(cexa，mstc，hxka，pfka，msta，vgb)/oe菌株发酵，3天柠檬酸产量提升32.8％，5天柠檬酸产量提升18.3％，整体生产强度提高了近20％，发酵周期缩短了10小时。
附图说明
33.图1为本发明中构建的oaha敲除质粒plh398图谱；
34.图2为本发明中对oaha敲除质粒plh398的双酶切验证图(ecor i/hindⅲ，7543bp/3850bp)，其中m为dnamarker，1为ecor i/hindⅲ双酶切验证质粒；
35.图3为本发明中构建的cexa表达质粒plh664图谱；
36.图4为本发明中对cexa表达质粒plh664的双酶切验证图(ecor i/kpn i，9981bp/1582bp)，其中m为dna marker，1为ecor i/kpn i双酶切验证质粒；
37.图5为本发明中构建的mstc表达质粒plh684图谱；
38.图6为本发明中对mstc表达质粒plh684的双酶切验证图(ecor i/bglⅱ，1689bp/10110bp)，其中m为dnamarker，1为ecor i/bglⅱ双酶切验证质粒；
39.图7为本发明中构建的hxka和pfka表达质粒plh1536图谱；
40.图8本发明中对hxka和pfka表达质粒plh1536的单酶切验证图(hindⅲ，4670bp/7692bp)，其中m为dnamarker，1为hindⅲ单酶切验证质粒；
41.图9为本发明中对hxka和pfka表达质粒plh1536的单酶切验证图(apaⅰ，3267bp/12462bp)，其中m为dnamarker，1为apaⅰ单酶切验证质粒；
42.图10为本发明中质粒plh1517图谱；
43.图11为本发明中对msta和vgb表达质粒plh1517的单酶切验证图(hindⅲ，903bp/1220bp/11709bp)，其中m为dna marker，1为hindⅲ单酶切验证质粒；
44.图12为本发明中单过表达菌株柠檬酸发酵产量分析图；
45.图13为本发明中菌株柠檬酸发酵液进行高效液相色谱法分析图；
46.图14为本发明中菌株发酵生产强度分析图。
具体实施方式
47.为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
48.本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
49.一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株(aspergillus niger)，所述菌株是通过在黑曲霉中敲除敲除草酰乙酸水解酶基因oaha，单独或共同强化表达柠檬酸转运蛋白编码基因cexa、单独或共同强化表达葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstc、单独或共同强化表达己糖激酶基因hxka，单独或共同强化表达磷酸果糖激酶基因pfka、单独或共同强化表达葡萄糖高亲和力转运蛋白基因msta，单独或共同强化表达透明颤菌血红蛋白编码基因vgb获得而获得的。
50.较优地，所述柠檬酸胞外转运蛋白基因cexa的dna序列为seq no.3以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seq no.4以及相似性80％以上的氨基酸序列；
51.或者，所述葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstc的dna序列为seq no.5以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seq no.6以及相似性80％以上的氨基酸序列。
52.较优地，所述己糖激酶基因hxka的dna序列为seq no.7以及相似性70％以上的dna
序列，其氨基酸序列为seq no.8以及相似性80％以上的氨基酸序列。
53.较优地，所述磷酸果糖激酶基因pfka的dna序列为seq no.9以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seqno.10以及相似性80％以上的氨基酸序列。
54.较优地，所述葡萄糖高亲和力转运蛋白基因msta的dna序列为seq no.11以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seq no.12以及相似性80％以上的氨基酸序列；
55.或者，所述透明颤菌血红蛋白编码基因vgb的dna序列为seq no.13以及相似性70％以上的dna序列，其氨基酸序列为seq no.14以及相似性80％以上的氨基酸序列。
56.较优地，生产柠檬酸的黑曲霉的出发菌株为黑曲霉s469；黑曲霉s469是发明人前期获得的授权专利(中国专利，专利号：zl201810985901.9)中所用菌株。
57.或者，控制基因转录的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子pgpda和丙酮酸激酶基因启动子ppkia，其他的可在黑曲霉中发挥转录作用的启动子也可实现使上述基因表达上调的目的；
58.或者，敲除草酰乙酸水解酶编码基因oaha是利用oaha基因上下游同源序列，通过同源重组的方式将oaha基因表达盒从基因组中删除。
59.较优地，所述oaha基因上下游同源序列片段序列分别为seq no.1以及相似性为70％以上的dna序列、seqno.2以及相似性为70％以上的dna序列。
60.如上所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株在柠檬酸发酵生产中的应用。
61.利用如上所述的黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸的方法，步骤如下：
62.将黑曲霉菌株接种在能够使黑曲霉产孢子的培养基上，在0～45℃条件下培养，直至产生足够的新鲜孢子；
63.收集孢子，以1
×
105～2
×
106个/ml的孢子浓度接种于种子培养基，然后进行种子液的培养，种子液的培养条件是：10～45℃，100～350rpm条件下振荡培养0～30h，得到种子液；
64.将种子液以0～15％的接种量接种至发酵培养基中，在0～35℃，100～350rpm条件下发酵，即得柠檬酸；
65.其中，种子培养基的配方是：0％～55％玉米淀粉浊液，0％～10％(nh4)2so4，溶剂为水；
66.所述述发酵培养基为：0％～85％玉米淀粉清液，0％～50％玉米淀粉浊液，溶剂为水；
67.上述百分数均为质量百分数。
68.进一步地，所述能够使黑曲霉产孢子的培养基为pda培养平板。
69.具体地，相关的制备及检测如下：
70.具体地，所述高产柠檬酸的黑曲霉菌株的构建步骤如下：
71.实施例1-oaha敲除质粒的构建：质粒plh398(图1)是由plh314(xuyongxue,et al.applied microbiology andbiotechnology,2019,103(19):8105-8114)载体改造而来。
72.具体获取过程如下：以黑曲霉基因组为模板，poaha-l-f、poaha-l-r和poaha-r-f、poaha-r-r为引物进行pcr扩增oaha上下游同源臂片段oaha-l和oaha-r，所述上下游同源臂序列片段的核苷酸序列分别为seq no.1，seq no.2，长度分别为1100bp、1241bp；然后应用诺唯赞c113-clonexpress-multis one step cloning kit试剂盒将oaha-l和oaha-r依次
与经ecor i/bamh i、spe i/hind i ii双酶切线性化后的出发载体plh314进行连接，连接产物经转化大肠杆菌jm109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图2)获得质粒plh398。为扩增oaha-l和oaha-r设计引物poaha-l-f、poaha-l-r和poaha-r-f、poaha-r-r(表1)。
73.实施例2-敲除oaha基因菌株的获得：将质粒plh398上的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的oaha基因敲除菌株δoaha。
74.实施例3-cexa表达质粒的构建：质粒plh664(图3)是由plh454(发明人前期授权专利，专利号：zl201810985901.9)载体经改造而来。所述基因cexa序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子pgpda控制转录。
75.具体获取过程如下：以黑曲霉cdna为模板，pcexa-f、pcexa-r为引物进行pcr扩增cexa基因序列片段，核苷酸序列为seq no.3，长度为1575bp；然后应用诺唯赞c113-clonexpress-multis one step cloning kit试剂盒将cexa基因序列片段与经ecor i和kpn i双酶切线性化后的出发载体plh454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌jm109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图4)获得质粒plh664。为扩增cexa基因序列片段设计引物pcexa-f、pcexa-r(表1)。
76.实施例4-过表达cexa基因菌株的获得：将质粒plh664上的表达框扩增下来，与黑曲霉δoaha菌株的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的cexa基因过表达菌株δoaha(cexa)/oe。
77.实施例5-mstc表达质粒的构建：质粒plh684(图5)是由plh454(发明人前期授权专利，专利号：zl201810985901.9)载体经改造而来。所述基因mstc序列片段由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子ppkia控制转录。
78.具体获取过程如下：以黑曲霉cdna为模板，pmstc-f、pmstc-r为引物进行pcr扩增mstc基因序列片段，其核苷酸序列为seqno.5，长度为1683bp；然后应用诺唯赞c113-clonexpress-multis one step cloning kit试剂盒将mstc基因序列片段与经ecor i和bglⅱ双酶切线性化后的出发载体plh454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌jm109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图6)获得质粒plh684。为扩增mstc基因序列片段设计引物pmstc-f、pmstc-r(表1)。
79.实施例6-过表达mstc基因菌株的获得:将质粒plh684上的表达框扩增下来，与黑曲霉δoaha(cexa)/oe菌株的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的mstc基因过表达菌株δoaha(cexa，mstc)/oe。
80.实施例7-hxka、pfka表达质粒的构建：质粒plh1536(图7)是由plh331(发明人前期授权专利，专利号：cn201910283994.5)载体经改造而来。所述基因hxka序列片段由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子ppkia控制转录，所述基因pfka序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子pgpda控制转录。
81.具体获取过程如下：以黑曲霉cdna为模板，phxka-f、phxka-r为引物进行pcr扩增hxka基因序列片段，ppfka-f、ppfka-r为引物进行pcr扩增pfka基因序列片段，其核苷酸序列分别为seq no.7、seq no.9，长度为1473bp、2352bp。先用诺唯赞c113-clonexpress-multis one step cloning kit试剂盒将pfka基因序列片段经sac i/bamh i双酶切线性化后的载体plh454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌jm109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证获得质粒plh838。再用诺唯赞c113-clonexpress-multis one step cloning kit试剂盒将hxka基因序列片段经ecor i单酶切线性化后的载体plh509(发明人前期授权专利，专利号：zl201810985901.9)进行连接，连接产物经转化大肠杆菌jm109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经酶切验证获得质粒plh667。再以质粒plh838为模板，p2968、p2969为引物扩增pgpda-pfka-ttrpc序列片段，以质粒plh667为模板p2970、p2971为引物进行pcr扩增ppkia-hxka-ttrpc序列片段，然后应用诺唯赞c113-clonexpress-multis one step cloning kit试剂盒分别将pgpda-pfka-ttrpc和ppkia-hxka-ttrpc依次经ecor i/bamh i、apa i酶切线性化后的出发载体plh331进行连接，连接产物经转化大肠杆菌jm109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，分别经酶切验证(图8、图9)获得质粒plh1536。为扩增hxka基因序列片段设计引物phxka-f、phxka-r，为扩增pfka基因序列片段设计引物ppfka-f、ppfka-r，为扩增pgpda-pfka-ttrpc序列片段设计引物p2968、p2969，为扩增ppkia-hxka-ttrpc序列片段设计引物p2970、p2971(表1)。
82.实施例8-过表达hxka、pfka基因菌株的获得：将质粒plh1536上的表达框扩增下来，与黑曲霉δoaha(cexa,mstc)/oe菌株的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的hxka、pfka基因共过表达菌株δoaha(cexa，mstc，hxka，pfka)/oe。
83.实施例9-msta、vgb表达质粒的构建：质粒plh1517(图10)是由载体plh509(发明人前期授权专利，专利号：zl201810985901.9)经改造而来，质粒plh1466是在华大基因合成的。所述基因msta序列片段由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子ppkia控制转录，所述基因vgb序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子pgpda控制转录。
84.具体获取过程如下：以黑曲霉cdna为模板，pmsta-f、pmsta-r为引物进行pcr扩增hxka基因序列片段，以质粒plh1466为模板，pvgb-f、pvgb-r为引物进行pcr扩增vgb基因序列片段，其核苷酸序列分别为seq no.11、seqno.13，长度为1593bp、441bp。用诺唯赞c113-clonexpress-multis one step cloning kit试剂盒将msta基因序列片段经sac i/ecor i双酶切线性化后的载体plh509进行连接，连接产物经转化大肠杆菌jm109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经酶切验证获
得质粒plh668。用诺唯赞c113-clonexpress-multis one step cloning kit试剂盒将vgb基因序列片段与经ecor i/bamh i双酶切线性化后的载体plh454(发明人前期授权专利，专利号：zl201810985901.9)进行连接，连接产物经转化大肠杆菌jm109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经酶切验证获得质粒plh1261。再以质粒plh1261为模板，pvgb/oe-p1、pvgb/oe-p2为引物扩增pgpda-vgb-ttrpc序列片段，然后应用诺唯赞c113-clonexpress-multis one step cloning kit试剂盒将pgpda-vgb-ttrpc与经hindⅲ单酶切线性化后的载体plh668进行连接，连接产物经转化大肠杆菌jm109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经hindⅲ单酶切验证(图11)获得质粒plh1517。为扩增msta基因序列片段设计引物pmsta-f、pmsta-r，为扩增vgb基因序列片段设计引物pvgb-f、pvgb-r，为扩增pgpda-vgb-ttrpc序列片段设计引物pvgb/oe-p1、pvgb/oe-p2(表1)。
85.实施例10-过表达msta、vgb基因菌株的获得：将质粒plh1517上的表达框扩增下来，与黑曲霉δoaha(cexa，mstc，hxka，pfka)/oe菌株的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的msta、vgb基因共过表达菌株δoaha(cexa，mstc，hxka，pfka，msta，vgb)/oe。
86.实施例11-单独过表达cexa基因菌株的获得：将实施例3中的质粒plh664上的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的cexa基因过表达菌株cexa/oe。
87.实施例12-单独过表达mstc基因菌株的获得:将实施例5中的质粒plh684上的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的mstc基因过表达菌株mstc/oe。
88.实施例13-过表达hxka基因菌株的获得：将实施例7中的质粒plh1536上hxka基因的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌菌株的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的hxka基因过表达菌株hxka/oe。
89.实施例13-过表达pfka基因菌株的获得：将实施例7中的质粒plh1536上pfka基因的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌菌株的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的pfka基因过表达菌株pfka/oe。
90.实施例14-过表达msta基因菌株的获得：将实施例9中的质粒plh1517上msta基因的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平
板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的msta基因过表达菌株msta/oe。
91.实施例15-过表达vgb基因菌株的获得：将实施例9中的质粒plh1517上vgb基因的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌的原生质体在peg的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素b的pda平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/ml多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的vgb基因过表达菌株vgb/oe。
92.实施例16-利用如上所述的生产柠檬酸的黑曲霉菌株制备柠檬酸的方法，步骤如下：
93.首先，将黑曲霉菌株接种在pda培养平板上，在0～45℃条件下培养4-5天直至产生足够的新鲜分生孢子；
94.然后，将孢子粉接到种子培养基中，孢子的终浓度为1
×
105～2
×
106个孢子/ml，在10～35℃，100～350rpm条件下发酵0～30h后，再转接0％～15％种子液至发酵培养基中，在0～35℃，100～350rpm条件下发酵0～120h，即得柠檬酸；
95.其中，所述培养基的组成为：种子培养基为：0％～55％玉米淀粉浊液，0％～10％(nh4)2so4，溶剂为水；发酵培养基为：0％～85％玉米淀粉清液，0％～50％玉米淀粉浊液，溶剂为水。
96.实施例17-本发明高产柠檬酸的黑曲霉(aspergillus niger)菌株的相关应用检测：
97.柠檬酸样品制备：摇匀发酵液，取1ml发酵液离心取上清，稀释20倍，经0.22μm滤膜过滤后滤液用于hplc检测。
98.柠檬酸的测定方法：aminex hpx-87h柱(300mm
×
7.8mm)，uv检测器。流动相：5mm h2so4。流速0.6ml/min，柱温65℃，波长210nm，进样体积为20μl。
99.1、分别将出发菌s469和获得的黑曲霉cexa/oe、mstc/oe、hxka/oe、pfka/oe、msta/oe、vgb/oe菌株的分生孢子接种于含有50ml发酵培养基的250ml的三角瓶中，在10～45℃，100～350rpm条件下进行发酵测试。在最优条件下，经过5天柠檬酸摇瓶发酵，与出发菌株s469相比，cexa/oe、mstc/oe、hxka/oe、pfka/oe、msta/oe、vgb/oe菌株的柠檬酸产量在3天时分别提升了22.56％、11.47％、8.05％、14.41％、7.07％、17.67％，在5天时分别提升了13.31％、9.75％、8.43％、9.09％、6.12％、11.74％(见图12)。表明单独使柠檬酸胞外转运蛋白基因cexa、葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstc、己糖激酶基因hxka、磷酸果糖激酶基因pfka、葡萄糖高亲和力转运蛋白基因msta和透明颤菌血红蛋白编码基因vgb的表达量上调而获得的黑曲霉菌株均柠檬酸的产量均有不同程度的提高。
100.2、分别将出发菌株s469和获得的黑曲霉δoaha(cexa，mstc，hxka，pfka，msta，vgb)/oe菌株的分生孢子接种于含有50ml发酵培养基的250ml的三角瓶中，在10～45℃，100～350rpm条件下进行发酵测试。在最优条件下，经过5天柠檬酸摇瓶发酵，与出发菌株s469相比，δoaha(cexa，mstc，hxka，pfka，msta，vgb)/oe菌株柠檬酸产量为0～143.2g/l(图13)，柠檬酸产量在3天和5天分别提升了32.8％、18.3％；生产强度达到1.19g/l/h(图14)，且在整个发酵周期中都较s469高出近20％，发酵周期缩短了10小时。由此可见，本发明黑曲
霉菌株是一株高产柠檬酸的黑曲霉菌株。
101.其中，上述lb培养基组分为：
102.胰蛋白胨0～10.0g/l，nacl 0～10.0g/l，酵母浸出物0～5.0g/l，ph调至7.0-7.2，固体培养基加1.5％(w/v)的琼脂粉。121℃灭菌20min。灭菌完毕冷却至60℃左右时加入卡那霉素至终浓度100μg/ml。
103.表1所用引物序列
[0104][0105]
本专利申请中所使用到的序列如下：
[0106]
seq no.1：oaha基因上游同源臂的核苷酸序列1100bp
[0107]
aattcgagccctggcagtctatcggtgcagatctgctccctcggccaagcgccaatcacgtccgattcatcccattcctcatccagctggcgaactccggaggttgattgctcgctcgctctcagttggccaccaaacttactcgtccccctccttcaccctccctcctctgccaatgctacagagtacttggctaggctactatcttctcagctgggtgaagaacaacgggccccgtgcgtgatgagcaaaagcgtctgacatgcagcaactgcagtatactggagcccgcggctaccgaggaactcgtgctcgtgtgccaccacatcgaagtgagttgatgcgtcttgtccatgcagtgtcggcgtggcctaaagtacgggccaaacctgtctgacttcatcccacactattaccccctccctcattctcccctgattcggcccaataaggaaatcacttagtcaatcaatcctgccattaccggcgcgtaatctgaaactacgcgcggactgtctcttactcccctcgcggtgggcggcccagccagccccatccttactagatttagcgaattactggtcattagccctgtacgggggaggggcgggaaaacaaaaatgcgaataatagaataaatttaataaagaaaaaagagggggggggagcttatctaggcccctgctgcattgcattcggacatttttcgacttgtcacaggcacaaatcatagtccgccgatggcgtcgattgaccattttcttttcttttctcggcgctgggatggtggccaagaaaattgaatggcaatggttcgttcaccggagtagggtgtacgtgcattgtgtggattgacgatgattctcggccaagggcttgcgttgcaatcccaccaggaggggaatgttgcagacagacagaaagcaaaagaagtattggagggaaaaaaacaattcttgaaaaatgatcttctcaggtaatgaatattggttgctggcgggctgatcttctcccgacacgtctatataaactggtcaccttctggcccttcctttctatctcttccttctcatcatcagtctcaaacaagcctctttctg
[0108]
seq no.2：oaha基因下游同源臂的核苷酸序列1241bp
[0109]
ctagttttgtttcacccagcagaaccttattgcattaacaatcatattctcagtaagcacgagacacagaaacgagaaaagtattctagaccctgacagaacaccctgatcgacagtcacttacccaacaaagtaagtggtctctaccctctgattacagttaaggcaggcagtagtaagcaagaataagaaagaaagaataattaactactaagttgctcgctactgcatgcacgaccacggagtcgccgtgcaaaaacaattggtgcgtgctcagctagctgcactctgcacactgccaccctcgccctacaaaagaaaccatgctgtttctccactatactgttcccgcgatgaaactagggccaataaccatgcagttactattggtcccactggggtgggttgggtagccttatggtattaaaaggagtaggggtctttgtcgatcgcttttccattattatttttgtatttttatttttgttggtttctgtttgtgttatgttgggccgtttttgtttttctttgggtaacgagggatgggaatatattcatatggaaatggaaatggattatgctattgattgatgaatggtgatgatctgcgtggaaattaatgtcagagtcttgtctgattcaaactccgtcgtccgtctgatgtcagccagccacaatcacacatccacgcaagcacattcaaccccctgaatggaaaagcagggtccaaagaaaaaaagaaaaaatgataaaaatgtaacaagaaatagaatattcatcagcgaactgcatcaaaacaaatcatgattcgttcattctctccatcccctactgtcactccttccctccccctctcattgtcccccccctgcatctgaatctcaggatctcacattaatgtctcctgatgcaccacaatccgccactctccatcacttgcctgactccatgtcgtcgacccggtgccccggtacgtctcctcgccgcgccgcgcattgatcttgtatgttactgatccggccatcaggtcgatgacgatcacgcgcacttcctgcagttcgtactcgtcgaagtgatggaagggtggcttcagcgcctcgctgattgatggcttcgaatgcaggtgcagaatctcgcgctgcgggaaaagtaagttggcttcttcgttacacatcttcttgatttcgggccccggatcggcggaggtgagcgccgtccagagacgacgctccttgccgata
[0110]
seq no.3：cexa基因的核苷酸序列1575bp
[0111]
atgtcttcaaccacgtcttcatcaagatcagaccttgaaaaggtccccgtaccacaggtcatccctagagacagtgactccgataagggatccctctctccggagccttcgaccctagaggctcagtcatccgagaagccaccgcatcatatcttcacacggtctcgcaagctgcaaatggtttgcatcgtctccctcgctgccatattttctccgctttcgtcgaacatttacttccctgccctggatgatgtctcgaaatccctcaacatcagcatgtcgctcgcaacactcaccatcacggtgtacatgatcgtccaaggcctcgctcccagcttctggggttccatgtcagacgccacaggtagacggcctgtctttattggaacattcattgtttacctcgtagccaatattgctctggccgaatccaagaactatggtgagctcatggccttccgagccttgcaggctgctggtagcgcggccaccatctcaatcggagctggagtgattggtgatatcacaaactcggaagaaagaggtagcttggtgggtatcttcggtggagttcgcatgcttggacagggaatcgggccggttttcggcggcattttcacccagtatctcggatatcgatctatcttttggttcctcacgattgctggaggcgtgagtctcctgtccattctggtgcttcttccggagacattgagaccaattgctggaaatggaactgtgaagctcaatggcattcataagcccttcatctacacgatcaccggccagacgggggttgtcgagggagcgcaaccggaagcgaaaaagaccaaaaccagctggaagtctgtttttgctcctttgacattcctcgtcgaaaaggacgttttcatcaccctgttctttggaagtatcgtgtacacagtgtggagcatggtgacatccagtaccaccgacctcttcagcgaagtgtacggcctgtcatccctggacattggactcactttcctaggcaatggctttggatgtatgtctggctcttatctggtcggctaccttatggattacaaccaccgtcttaccgaacgcgaatattgcgagaaacacggttatccggcaggcacacgtgtcaatctgaaatcacaccccgacttccccattgaggtcgcccggatgcgcaatacctggtgggtgattgcgatcttcatcgtgacagttgctttgtacggcgtgtctttgcggacacatctggcggtgcctatcattctgcagtacttcattgcgttctgctcaacaggactcttcaccatcaacagcgccctggtcatcgatctttacccaggtgctagcgccagtgcgacagcagtgaacaatctgatgcggtgcctgcttggagctggcggtgtggctatcgtgcaacctatcctggacgccttgaagccggattatactttcctcttgcttgccggcatcaccctcgtgatgactccgttgctgtacgtcgaagatcgatggggtcctggctggcgaca
tgcccgcgaaaggagactcaaggccaaagccaacggcaactag
[0112]
seq no.4：cexa基因的氨基酸序列524aa
[0113]
mssttsssrsdlekvpvpqviprdsdsdkgslspepstleaqssekpphhiftrsrklqmvcivslaaifsplssniyfpalddvskslnismslatltitvymivqglapsfwgsmsdatgrrpvfigtfivylvanialaesknygelmafralqaagsaatisigagvigditnseergslvgifggvrmlgqgigpvfggiftqylgyrsifwfltiaggvsllsilvllpetlrpiagngtvklngihkpfiytitgqtgvvegaqpeakktktswksvfapltflvekdvfitlffgsivytvwsmvtssttdlfsevyglssldigltflgngfgcmsgsylvgylmdynhrltereycekhgypagtrvnlkshpdfpievarmrntwwviaifivtvalygvslrthlavpiilqyfiafcstglftinsalvidlypgasasatavnnlmrcllgaggvaivqpildalkpdytflllagitlvmtpllyvedrwgpgwrharerrlkakangn
[0114]
seq no.5：mstc基因的核苷酸序列1683bp
[0115]
atgggtgtctctaatatgatgtcccggttcaagcctcaggcggaccactctgagtcctccactgaggctcctactcctgctcgctccaactccgccgtcgagaaggacaatgtcttgctcgatgacagtcccgtcaagtacttgacctggcgctccttcatcctgggtatcgtcgtgtccatgggtggtttcatcttcggttactctactggtcaaatctctggtttcgagactatggatgacttcctccaacgtttcggtcaggaacaggcggatggatcctatgctttcagcaacgtccgtagtggtctcattgtcggtctgctgtgtatcggtactatgatcggtgccctggttgctgctcctatcgcagaccgcatgggccgcaagctctccatctgtctctggtctgtcatccacatcgtcggtatcatcattcagattgccaccgactccaactgggtccaggtcgctatgggtcgttgggttgccggtctgggtgttggtgccctctccagcattgtccccatgtaccagagtgaatctgctccccgtcaggtccgtggtgccatggtcagtgccttccagctgttcgttgccttcggtatcttcatctcctacatcatcaacttcggtaccgagagaatccagtcgactgcttcctggcgtatcaccatgggcattggcttcgcctggcccttgattctggctgttggctctctcttcctgcccgagtctcctcgtttcgcctaccgtcagggtcgtatcgatgaggcccgtgaggttatgtgcaagctgtacggtgtcagcccgaaccaccgcgtcatcgcccaggagatgaaggacatgaaggacaagctcgacgaggagaaggccgccggtcaggctgcctggcacgagctgttcaccggccctcgcatgctctaccgtaccctgctcggtattgctctgcagtccctccagcagctgaccggtgccaactttatcttctactacggaaacagtatcttcacctccactggtctgagcaacagctacgtcactcagatcattctgggtgctgtcaacttcggtatgaccctgcccggtctgtacgtcgtcgagcacttcggtcgtcgtaacagtctgatggttggtgctgcctggatgttcatttgcttcatgatctgggcttccgttggtcacttcgctctggatcttgccgaccctcaggccactcctgccgctggtaaggccatgatcatcttcacttgcttcttcattgtcggtttcgccaccacctggggtcctatcgtctgggccatctgtggtgagatgtaccccgcccgctaccgtgctctctgcattggtattgccaccgctgccaactggacctggaacttcctcatctccttcttcacccccttcatctctagctccattgacttcgcctacggctacgtctttgctggatgctgtttcgccgccatcttcgttgtcttcttcttcgtcaatgagacccagggtcgcactcttgaggaggttgacaccatgtacgtgctccacgtcaagccctggcagagtgccagctgggttcccccggagggcattgtccaggacatgcaccgccccccttcctcttccaagcaggagggtcaggctgagatggctgagcacaccgagcccactgagctccgcgagtaa
[0116]
seq no.6：mstc基因的氨基酸序列560aa
[0117]
mgvsnmmsrfkpqadhsessteaptparsnsavekdnvllddspvkyltwrsfilgivvsmggfifgystgqisgfetmddflqrfgqeqadgsyafsnvrsglivgllcigtmigalvaapiadrmgrklsiclwsvihivgiiiqiatdsnwvqvamgrwvaglgvgalssivpmyqsesaprqvrgamvsafqlfvafgifisyiinfgteriqstaswritmgigfawplilavgslflpesprfayrqgridearevmcklygvspnhrviaqemkdmkdkldeekaagqaawhelftgprmlyrtllgialqslqqltganfifyygnsiftstglsnsyvtqiilgavnfgmtlpglyvvehfgrrnslmvgaawmficfmiwasvghfaldladpqatpaagkamiiftcffivgfattwgpivwaicgemyparyralcigiata
anwtwnflisfftpfisssidfaygyvfagccfaaifvvfffvnetqgrtleevdtmyvlhvkpwqsaswvppegivqdmhrppssskqegqaemaehteptelre
[0118]
seq no.7：hxka基因的核苷酸序列1473bp
[0119]
atggttggaatcggtcctaagcgtcccccctcccgcaagggttccatggccgatgttccccagaacctcttgcagcagatcaaggacttcgaggaccaattcaccgtcgatcgctccaagctcaagcagattgtcaaccactttgtcaaggaattggaaaagggtctctctgtcgagggtggaaacatccctatgaacgtcacctgggttctgggattccccgatggcgacgaacagggtactttcctcgccctcgacatgggtggcaccaacctgcgtgtttgtgagatcaccctgacccaggagaagggtgccttcgacatcacccagtccaagtaccgcatgcccgaggaattgaagaccggtaccgccgaggagctgtgggaatacatcgccgactgcctgcagcaattcatcgagtcccaccacgagaacgagaagatctccaagctgcccctgggtttcaccttctcctaccccgccacccaggattacatcgaccacggtgtcctgcagcgctggaccaagggtttcgacattgatggtgtcgagggccacgacgtcgtcccgccgttggaggccatcctgcagaagcgcggcctgcccatcaaggtggctgcactgatcaacgacaccaccggaaccctcatcgcctcttcttacaccgactccgacatgaagatcggctgcatcttcggtaccggtgtcaacgccgcctacatggagaacgccggctccatccccaagctggctcacatgaacctgcccgccgacatgcccgtggctatcaactgcgagtacggtgctttcgacaacgagcacatcgtgctgcctctgaccaagtacgaccacatcatcgaccgcgactcgccccgtcccggtcagcaggccttcgagaagatgaccgccggtctgtacctgggtgagatcttccgtctggccctgatggacctggtggagaaccgccccggcctcatcttcaacggccaggacaccaccaagctgcgcaagccctacatcctggatgcctccttcctggcagccatcgaggaggacccctacgagaacctggaggagaccgaggagctcatggagcgcgagctcaacatcaaggccaccccggcggagctggagatgatccgccgcctggccgagctgatcggtacgcgtgccgctcgcctgtcggcctgcggtgttgccgccatttgcacgaagaagaagatcgactcgtgccacgttggtgccgacggctccgtcttcaccaagtaccctcacttcaaggcgcgcggagccaaggctctgcgcgagatcctggactgggctccggaggagcaggacaaggtgaccatcatggcggccgaggatggatctggtgtgggagctgcgctgattgcggcgctgaccctgaagcgggtcaaggccggcaacctggccggtatccgaaacatggctgacatgaagaccctgctataa
[0120]
seq no.8：hxka基因的氨基酸序列490aa
[0121]
mvgigpkrppsrkgsmadvpqnllqqikdfedqftvdrsklkqivnhfvkelekglsveggnipmnvtwvlgfpdgdeqgtflaldmggtnlrvceitltqekgafditqskyrmpeelktgtaeelweyiadclqqfieshhenekisklplgftfsypatqdyidhgvlqrwtkgfdidgveghdvvppleailqkrglpikvaalindttgtliassytdsdmkigcifgtgvnaaymenagsipklahmnlpadmpvainceygafdnehivlpltkydhiidrdsprpgqqafekmtaglylgeifrlalmdlvenrpglifngqdttklrkpyildasflaaieedpyenleeteelmerelnikatpaelemirrlaeligtraarlsacgvaaictkkkidschvgadgsvftkyphfkargakalreildwapeeqdkvtimaaedgsgvgaaliaaltlkrvkagnlagirnmadmktll
[0122]
seq no.9：pfka基因的核苷酸序列2352bp
[0123]
atggctcccccccaagctcccgtgcaaccgcccaagagacgccgcatcggtgtcttgacctctggtggcgatgctcccggtatgaacggtgtcgtccgggccgtcgtccggatggctatccactccgactgtgaggctttcgccgtctacgaaggttacgagggtctcgtcaatggcggcgacatgatccgtcagcttcactgggaggatgttcgcggctggttgtcccgtggtggtaccttgatcggttccgcccgctgcatgaccttccgtgagcgccccggtcgtctgcgggctgccaagaacatggtcctccgtggcattgacgcccttgtcgtctgtggtggtgatggcagtttgactggtgccgacgtttttcgttccgagtggcccggtctgttgaaggaattggtcgagacgggcgagttgaccgaagagcaggtcaagccataccagattctgaacatcgtcggtttggtgggttcgatcgataacgacatgtccggcaccgacgccaccatcggttgctac
tcctccctcactcgcatctgtgacgccgtcgacgacgtcttcgatactgccttttcccaccagcgtggattcgtcattgaggtcatgggtcgtcactgcggttggctggccttgatgtctgctatcagtaccggtgccgactggctgttcgtgcccgagatgccgcccaaggacggatgggaggatgacatgtgcgctatcattaccaagaacagaaaggagcgtggaaagcgtaggacgatcgtcatcgtggccgagggtgcccaggatcgccatctcaacaagatctcgagttcgaagatcaaggatattttgacggagcggttgaacctggatacccgtgtgactgtgttgggtcacactcagagaggtggagccgcctgtgcgtacgaccgctggctgtccacactgcagggtgtcgaggctgtccgcgcggtgctggacatgaagcccgaagccccgtccccggtcatcaccatccgtgagaacaagatcttgcgcatgccgttgatggacgccgtgcagcacaccaagactgtcaccaagcacattcagaacaaggagttcgccgaagccatggccctccgcgactcggaattcaaagagtaccacttttcctacatcaacacttccacgcccgaccacccgaagctgctcctcccagagaacaagagaatgcgcatcggtattattcacgttggcgcccccgctggtggtatgaaccaggctacccgcgcggccgttgcctactgcctgactcgtggccacacccccctggccattcacaacggtttccccggtctgtgccggcactatgatgacaccccgatctgctctgtgcgcgaggtggcatggcaggaatcggacgcctgggtcaacgagggtggttcggatatcggtaccaaccgtggtctgcccggcgatgacctcgcgaccacggcgaagagcttcaagaagttcggattcgatgcgttgttcgtcgtgggtggatttgaggcgttcaccgccgtcagccagcttcgccaggcgcgcgagaagtaccccgaattcaagattcccatgaccgtgctgccggcgaccatttccaacaacgtgccgggcacagaatactctctgggtagcgacacctgccttaacaccttgatcgacttctgcgacgccatccgccagtcggcctcgtcctctcgtcgccgtgtgttcgtcatcgagacgcagggtggcaagtcgggttacatcgccacgacggctggtctgtcggtgggcgcggtagccgtgtacattcccgaggagggcatcgacattaagatgctggcccgcgacattgacttcctgcgtgacaactttgcgcgcgacaagggagcgaaccgcgccggtaagatcatcctgcgtaacgagtgcgcgtccagcacgtacacgacacaggtggtggccgacatgatcaaggaggaagccaagggacgtttcgagagtcgtgcggcggtgccgggacacttccagcagggtggcaagccgtcgccgatggaccgtatccgggcgttgcggatggccaccaagtgtatgctgcacctggagagctatgcgggcaagtcggcggatgagattgcggccgatgagctgtctgcgtcggtcattggtatcaagggctcgcaggtgttgttctcgccgatgggtggagagaccggcctggaggcgaccgagacggactgggcgcgccgtcgacccaagacggagttctggctggagctgcaggacacggtgaacattctgtcgggacgggcgagcgtgaacaacgcgacgtggagttgctatgagaatgcttaa
[0124]
seq no.10：pfka基因的氨基酸序列783aa
[0125]
mappqapvqppkrrrigvltsggdapgmngvvravvrmaihsdceafavyegyeglvnggdmirqlhwed
[0126]
vrgwlsrggtligsarcmtfrerpgrlraaknmvlrgidalvvcggdgsltgadvfrsewpgllkelvetgelteeqvkpyqilnivglvgsidndmsgtdatigcyssltricdavddvfdtafshqrgfvievmgrhcgwlalmsaistgadwlfvpemppkdgweddmcaiitknrkergkrrtivivaegaqdrhlnkissskikdilterlnldtrvtvlghtqrggaacaydrwlstlqgveavravldmkpeapspvitirenkilrmplmdavqhtktvtkhiqnkefaeamalrdsefkeyhfsyintstpdhpklllpenkrmrigiihvgapaggmnqatraavaycltrghtplaihngfpglcrhyddtpicsvrevawqesdawvneggsdigtnrglpgddlattaksfkkfgfdalfvvggfeaftavsqlrqarekypefkipmtvlpatisnnvpgteyslgsdtclntlidfcdairqsasssrrrvfvietqggksgyiattaglsvgavavyipeegidikmlardidflrdnfardkganragkiilrnecasstyttqvvadmikeeakgrfesraavpghfqqggkpspmdriralrmatkcmlhlesyagksadeiaadelsasvigikgsqvlfspmggetgleatetdwarrrpktefwlelqdtvnilsgra svnnatwscyena
[0127]
seq no.11：msta基因的核苷酸序列1593bp
[0128]
atggctgaaggcttcgttgacgcctcgcgcgtcgaggccccagtcaccctcaagacctacttgatgtgt
gcctttgcggcttttggtggtatcttcttcggttatgactctggttatatcagcggtgtcatgggaatgagatacttcatcgaggagtttgagggcttggactataacactacccccaccgattccttcgtcctcccgtcctggaaaaaatcgttgatcacgtcgatcctctcggctggaaccttctttggtgccctcattgctggtgacttggcagactggttcggtcgtcgcactaccattgtcagtggttgtgttgtcttcatcgttggtgttatcctgcagaccgcttcgacctccttgggtctgcttgttgccggccgtctggtcgcgggatttggtgtgggcttcgtctccgccatcattatcctgtacatgtctgagattgcacctcgcaaggttcgcggtgctattgtctcagggtaccagttctgcatcaccatcgggctcatgttggcctcgtgcgtcgactacggcactgagaaccgtctcgactctggctcctaccgtatcccaatcggcctccagctcgcctgggccttgatcctgggaggtggtctgctctgcctgcccgagtcccctcgttactttgttaaaaagggcgacctggctaaggctgcggaggttcttgcccgcgttcgtggtcaaccccaagactcggattatatcaaggatgagctggcggagattgtggcaaatcatgagtacgagatgcaggtgattccggaaggtggatatttcgtcagctggatgaactgcttccgtggcagtatattctcgcccaacagcaatctccgtcggactgtcctaggtacttctctgcagatgatgcaacagtggaccggtgtcaactttgtcttctactttggaacgacctttttccagtcgctgggaaccatcgatgaccccttcctcatcagcatgattaccactatcgtcaacgtctgctcgacccccgtctcgttctacacaattgagaagtttggccgccgttcgctccttttgtggggagcacttggtatggtcatctgccagttcattgtcgctatcgtcggcaccgtggacggtagcaataagcacgctgtcagtgcagagatttctttcatctgcatttacatcttcttctttgctagcacgtggggcccgggcgcctgggttgtgattggcgagattttccccctacctattcggtcgcgtggtgtggctctgtcgacggcatcgaactggctgtggaattgcatcatcgctgtcatcaccccttacatggtcgacaaggacaagggtgacttgaaggccaaggtgttcttcatctggggctcgctgtgtgcctgcgcttttgtctacacgtacttcctaattccggagaccaagggtcttactcttgagcaggtggacaagatgatggaagagaccacgcctcgcacctcagccaagtggactccacatggcaccttcacggccgagatgggtcttactgcgaatgccgtggccgaaaaggctactgcggttcaccaggaggtgtga
[0129]
seq no.12：msta基因的氨基酸序列530aa
[0130]
maegfvdasrveapvtlktylmcafaafggiffgydsgyisgvmgmryfieefegldynttptdsfvlpswkkslitsilsagtffgaliagdladwfgrrttivsgcvvfivgvilqtastslgllvagrlvagfgvgfvsaiiilymseiaprkvrgaivsgyqfcitiglmlascvdygtenrldsgsyripiglqlawalilgggllclpespryfvkkgdlakaaevlarvrgqpqdsdyikdelaeivanheyemqvipeggyfvswmncfrgsifspnsnlrrtvlgtslqmmqqwtgvnfvfyfgttffqslgtiddpflismittivnvcstpvsfytiekfgrrslllwgalgmvicqfivaivgtvdgsnkhavsaeisficiyifffastwgpgawvvigeifplpirsrgvalstasnwlwnciiavitpymvdkdkgdlkakvffiwgslcacafvytyflipetkgltleqvdkmmeettprtsakwtphgtftaemgltanavaekatavhqev
[0131]
seq no.13：vgb基因的核苷酸序列441bp
[0132]
atgctggatcagcagaccatcaacatcatcaaggccaccgtccccgtcctgaaggagcacggtgtcactattaccaccaccttctacaagaacctgttcgccaagcaccccgaggtccgccctttgtttgatatgggccgccaggagtccctggagcagcctaaagctctggctatgaccgtcctggctgctgctcaaaatatcgagaacctgcccgctattctgcccgccgtcaaaaagatcgccgtcaagcactgccaggccggcgttgccgctgctcattatcctattgtcggtcaggagctgctgggcgccattaaggaagtcctgggcgatgccgccaccgatgatatcctggatgcctggggcaaggcctacggcgttattgccgatgtctttatccaggtcgaggccgatctgtacgcccaggccgttgaa
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seq no.14：vgb基因的氨基酸序列146aamldqqtiniikatvpvlkehgvtitttfyknlfakhpevrplfdmgrqesleqpkalamtvlaaaqni
[0134]
enlpailpavkkiavkhcqagvaaahypivgqellgaikevlgdaatddildawgkaygviadvfiqveadlyaqave
[0135]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。