一种通过特异调控家蚕内源丝蛋白提高蚕丝机械性能的方法及其家蚕品种

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过特异调控家蚕内源丝蛋白提高蚕丝机械性能的方法及其家蚕品种。


背景技术：

2.蚕丝是当前产量最大、使用最广的天然动物丝，其具有良好的生物相容性、可降解性、结构可调性以及抗菌性等特点。基于以上优势，蚕丝除了广泛应用于传统纺织行业外，在医学、材料学、光电学领域也呈现出巨大的应用潜力。但是，与蛛丝等相比，家蚕丝的机械性能不够突出，限制了其在各领域的拓展应用。如何提高家蚕丝的机械性能，是蚕学、材料学等领域关注的重点内容之一。
3.在现代生物性状改良中，转基因技术发挥了不可或缺的作用，它可以将人为选择的基因高效导入生物体基因组中，达到基因过表达或失活的作用。近些年来，利用转基因技术对蚕丝进行遗传改良的方法已有报道，如将外源蛛丝蛋白重复基序转入家蚕基因组中，但机械性能提高效果并不显著。虽然通过转基因技术改良家蚕丝机械性能在理论上可行，但实际实施效果仍不尽人意。
4.因此，现实的工业生产需要进一步促使技术人员，进一步研究和寻找更优化的提高蚕丝机械性能的方法，以大规模生产机械性能更加优异的蚕丝。


技术实现要素：

5.基于现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种通过特异调控家蚕内源丝蛋白提高蚕丝机械性能的方法及其家蚕品种，所述家蚕品种包括调控家蚕fibl基因(seq id no.1)的转基因家蚕和调控家蚕p25(seq id no.2)基因的转基因家蚕。
6.依据本发明技术方案的第一方面，提供一种通过特异调控家蚕内源丝蛋白提高蚕丝机械性能的方法，其通过家蚕fibh基因启动子(seq id no.3)、家蚕fibl基因启动子(seq id no.4)调控家蚕内源丝蛋白fibl基因(seq id no.1)、p25基因(seq id no.2)，育成四种蚕丝机械性能优异的家蚕品系，育成之品系由于丝素蛋白含量和组装的差异，使蚕丝机械性能较其改造前大幅提升。
7.所述通过特异调控家蚕内源丝蛋白提高蚕丝机械性能的方法包括以下步骤：
8.步骤s1，获得基于特异调控家蚕丝蛋白fibl基因(seq id no.1)提高蚕丝力学性能的家蚕转基因系统；
9.步骤s2，获得基于特异调控家蚕丝蛋白p25基因(seq id no.2)提高蚕丝力学性能的家蚕转基因系统；
10.步骤s3，获得多种产高力学性能蚕丝的家蚕品系以扩展蚕丝在各领域当中的应用。
11.其中，获得基于特异调控家蚕丝蛋白fibl基因(seq id no.1)提高蚕丝力学性能
id no.1)的转基因家蚕和调控家蚕p25(seq id no.2)基因的转基因家蚕。
20.相比较于现有技术，本发明一种通过特异调控家蚕内源丝蛋白提高蚕丝机械性能的方法的有益效果如下：
21.1、本发明公开了一种通过转基因技术有效提高家蚕丝机械性能的方法及其家蚕品系，即通过调控家蚕丝蛋白fibl(seq id no.1)或p25基因(seq id no.2)，育成蚕丝机械性能大幅提高的家蚕品系。
22.2、育成之品系生产的蚕丝具有优异的综合力学性能，相较改良前提高幅度最大可达1倍以上，该蚕丝可作为一种良好的材料应用于医学、军工、光电等各个领域，具有重要的应用价值。
附图说明
23.附图1a和附图1b分别为调控表达家蚕fibl(seq id no.1)转基因阳性筛选图以及基因组pcr电泳图；附图1a为以家蚕fibh启动子(seq id no.3)表达fibl(seq id no.4)的转基因系统；附图1b为以家蚕fibl启动子(seq id no.4)表达fibl(seq id no.1)的转基因系统示意图；
24.附图2a和附图2b分别为调控表达家蚕p25(seq id no.2)转基因阳性个体筛选图以及基因组pcr电泳检测图，其中附图2a为以家蚕fibh启动子(seq id no.3)调控表达家蚕p25(seq id no.2)的转基因系统；附图2b为以家蚕fibl启动子(seq id no.4)调控表达家蚕p25(seq id no.2)的转基因系统示意图；
25.附图3为各品系家蚕后部丝腺荧光定量结果，证明调控家蚕内源fibl(seq id no.1)、p25(seq id no.2)蛋白成功被调控表达结果图；
26.附图4为各品系家蚕表型观察结果，包括丝腺形态观察和茧壳形态观察结果图；
27.附图5为各系统茧壳丝力学拉伸曲线图，验证机械性能提高效果结果图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本技术方案的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术方案的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，不应当将本发明的保护范围仅仅限制至下述具体步骤或具体参数。
29.本发明提出一种通过特异调控家蚕内源丝蛋白提高蚕丝机械性能的方法，其通过家蚕特异启动子fibh(seq id no.3)、fibl(seq id no.4)调控家蚕内源丝蛋白fibl(seq id no.1)、p25(seq id no.2)基因，育成四种蚕丝机械性能优异的家蚕品系，育成之品系由于丝素蛋白含量和组装的差异，使蚕丝机械性能较其改造前大幅提升。本发明为蚕丝机械性能的改良提供了新手段和方法，获得的改良蚕丝由于其优异的力学性能，在医学、军工、光电等领域具有重要的应用价值。
30.一种通过特异调控家蚕内源丝蛋白提高蚕丝机械性能的方法，其包括以下步骤：
31.步骤s1，获得基于特异调控家蚕丝蛋白fibl(seq id no.1)提高蚕丝力学性能的家蚕转基因系统；
no.7)，该序列是由3倍重复的p3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了青色荧光蛋白(ecfp)组成；随后在3
×
p3-ecfp序列5’端和3’端分别组装上piggybac右臂(seq id no.8)和piggybac左臂(seq id no.9))和pbac[3
×
p3-dsred]骨架载体连接，(该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3
×
p3-dsred序列(seq id no.10)，该3
×
p3-dsred序列(seq id no.10)是由3倍重复的p3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了红色荧光蛋白(dsred)序列组成；随后在3
×
p3-dsred序列5’端和3’端分别组装上piggybac右臂(seq id no.8)和piggybac左臂(seq id no.9))获得最终表达载体pb[fibh-p25 cds-lbs,3
×
p3-dsred]、pb[fibl-p25cds-lpa,3
×
p3ecfp]。
[0044]
其中步骤s3，多种产高力学性能蚕丝的家蚕品系以扩展蚕丝在各领域当中的应用包括以下步骤：
[0045]
步骤s3-1，改良蚕丝家蚕的制备方法，通过在家蚕中调控fibl基因(seq id no.1)、p25基因(seq id no.2)，筛选纯合突变个体，获得改良蚕丝家蚕品系。
[0046]
步骤s3-2，进一步的，将上述四种重组载体质粒分别与转座酶表达载体质粒按1：1混合，显微注射产卵后1h-3h的305早期胚胎，注射第一代(g0代)孵化幼虫饲育至羽化后进行自交或回交制种。
[0047]
步骤s3-3，获得的注射第二代(g1)代蚕卵于点青期前1天(d)左右置于体视荧光显微镜下检测，筛选在胚胎眼睛或神经组织发荧光的转基因阳性个体，并以蛾圈为单位单独饲养至成虫。
[0048]
步骤s3-4，通过阳性个体扩大培养获得改良蚕丝转基因品系。
[0049]
步骤s3-5，将基于多化系统305的转基因系与qb杂交3代及以上，获得基于qb的转基因系统，有利于规模化饲养。
[0050]
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0051]
实例一，本实例所述一种通过特异调控家蚕内源丝蛋白提高蚕丝机械性能，获得调控fibl基因(seq id no.1)的转基因家蚕，具体步骤为：
[0052]
步骤s1从ncbi获得家蚕fibl(seq id no.1)的全长cdna序列以及fibh启动子(seq id no.3)、fibl(seq id no.4)的启动子序列，以家蚕fibl基因(seq id no.1)的全长cdna序列为基础，由南京金斯瑞生物科技有限公司直接合成。
[0053]
步骤s2采用bamh i和not i双酶切fibl cds合成质粒并回收目的片段,装到经同样酶切的亚克隆载体p57s[fibh-mcs-lbs]中，同样地，fibl cds质粒回收片段装到亚克隆载体p57s[fibl-mcs-lpa]中,构建获得p57s[fibh-fibl cds-lbs]p57s[fibl-fibl cds-lpa]两种载体。
[0054]
步骤s3利用asc i单酶切上述两种载体质粒，将回收的目的片段分别与经同样酶切的pbac[3
×
p3ecfp]，(该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3
×
p3-ecfp序列(seq id no.7)，该序列是由3倍重复的p3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了青色荧光蛋白(ecfp)组成；随后在3
×
p3-ecfp序列5’端和3’端分别组装上piggybac右臂(seq id no.8)和piggybac左臂(seq id no.9))和pbac[3
×
p3-dsred]骨架载体连接，(该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3
×
p3-dsred序列(seq id no.10)，该3
×
p3-dsred序列(seq id no.10)是由3倍重复的p3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了红色荧光蛋白
(dsred)序列组成；随后在3
×
p3-dsred序列5’端和3’端分别组装上piggybac右臂(seq id no.8)和piggybac左臂(seq id no.9))，获得最终表达载体pb[fibh-fibl cds-lbs,3
×
p3ecfp]、pb[fibl-fibl cds-lpa,3
×
p3-dsred]。表达载体质粒测序由深圳华大基因科技股份有限公司完成。
[0055]
步骤s4将上述制备的2个piggybac重组载体质粒分别与辅助质粒(a4helper)以浓度450ng/μl(纳克每微升)进行等比例混合，通过eppendorf显微注射仪注射，以多化性家蚕305(一年内可以饲养多批次蚕种材料)为注射受体，注射前需要将蚕蛾交配6小时，4度放置一天后拿出室温产卵，取刚产卵一小时的胚胎，将其用浆糊粘在玻璃片上，使用eppendorf显微注射仪注射，通过无毒胶水将其封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃，相对湿度85％的环境中孵化，将孵化出的g0代(注射第一代)蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，获得的g0代蚕蛾，通过自交或回交得到g1代(注射第二代)蚕卵，用olympus荧光显微镜筛选，筛选在胚胎眼睛或神经组织发青色荧光的转基因阳性个体命名为hl，结果如附图1a所示，胚胎眼睛或神经组织发红色荧光的转基因阳性个体命名为ll，结果如附图1b所示，并以蛾圈为单位单独饲养至成虫。
[0056]
步骤s5将上述获得的阳性个体提取基因组，提取步骤如下：
[0057]
(1)分别收集阳性蚕蛾hl和ll及野生型蚕蛾305，并将研钵及研磨棒进行清洗后，置于烘箱中180℃高温灭菌2小时-3小时。在研磨操作进行前需对蚕蛾、研钵及研磨棒进行液氮预冷处理。预冷后对蚕蛾进行研磨至粉末后转移至1.5ml(毫升)的离心管中，保存于液氮或-80℃备用。
[0058]
(2)将1ml的dna抽提buffer(缓冲液)加入离心管中，3000rpm(每分钟转速)涡旋混匀。按100μl/ml(微升/毫升)的工作浓度加入rna酶，置于37℃恒温水浴锅中消化1小时后加入蛋白酶k，55℃水浴消化过夜。
[0059]
(3)将等体积的tris饱和酚添加至离心管中后充分旋转振荡10min(分钟)，随后4℃、13400rpm离心10min，取600μl(微升)上清液至新的离心管中。
[0060]
(4)将600μl tris酚/氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min后，将上清转移至新的离心管中。
[0061]
(5)将于上清等体积的氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min，收集上清液。
[0062]
(6)将在4℃预冷的无水乙醇等体积加入离心管中，轻轻上下颠倒直至出现均匀的白色絮状沉淀后静置5min。
[0063]
(7)用无菌枪头小心挑出沉淀后转移至新的1.5ml离心管中，加入4℃预冷的75％乙醇清洗1次-2次，4℃、13400rpm离心10min，弃上清液。
[0064]
(8)打开离心管盖子，室温静置至乙醇挥发殆尽，加入30μl-50μl eb缓冲液溶解dna沉淀。
[0065]
(9)利用分光光度计检测dna纯度及浓度及琼脂点凝胶电泳检验后置于-80℃长期保存备用。
[0066]
步骤s6基因组pcr：
[0067]
(1)利用primer5软件设计引物，该引物由华大基因合成，引物合成后加超纯水溶解稀释后4℃保存。
no.10)是由3倍重复的p3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了红色荧光蛋白(dsred)序列组成；随后在3
×
p3-dsred序列5’端和3’端分别组装上piggybac右臂(seq id no.8)和piggybac左臂(seq id no.9))获得最终表达载体pb[fibh-p25 cds-lbs,3
×
p3-dsred]、pb[fibl-p25cds-lpa,3
×
p3ecfp]。表达载体质粒测序由深圳华大基因科技股份有限公司完成。
[0079]
步骤s4将上述制备的2个piggybac重组载体质粒分别与辅助质粒(a4helper)以浓度450ng/μl进行等比例混合，通过eppendorf显微注射仪注射，以多化性家蚕305(一年内可以饲养多批次蚕种材料)为注射受体，注射前需要将蚕蛾交配6小时，4度放置一天后拿出室温产卵，取刚产卵一小时的胚胎，将其用浆糊粘在玻璃片上，使用eppendorf显微注射仪注射，通过无毒胶水将其封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃，相对湿度85％的环境中孵化，将孵化出的g0代(注射第一代)蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，获得的g0代蚕蛾，通过自交或回交得到g1代(注射第二代)蚕卵，用olympus荧光显微镜筛选，筛选在胚胎眼睛或神经组织发发红色荧光的转基因阳性个体命名为hp结果如附图2a所示，胚胎眼睛或神经组织发青色荧光的转基因阳性个体命名为lp，并以蛾圈为单位单独饲养至成虫。
[0080]
步骤s5将上述获得的阳性个体提取基因组，提取步骤如下：
[0081]
(1)收集阳性蚕蛾hp和lp及野生型家蚕305，并将研钵及研磨棒进行清洗后，置于烘箱中180℃高温灭菌2-3小时。在研磨操作进行前需对蚕蛾、研钵及研磨棒进行液氮预冷处理。预冷后对蚕蛾进行研磨至粉末后转移至1.5ml的离心管中，保存于液氮或-80℃备用。
[0082]
(2)将1ml的dna抽提buffer加入离心管中，3000rpm涡旋混匀。按100μl/ml(微升每毫升)的工作浓度加入rna酶，置于37℃恒温水浴锅中消化1小时后加入蛋白酶k，55℃水浴消化过夜。
[0083]
(3)将等体积的tris饱和酚添加至离心管中后充分旋转振荡10min，随后4℃、13400rpm离心10min，取600μl上清液至新的离心管中。
[0084]
(4)将600μl tris酚/氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min后，将上清转移至新的离心管中。
[0085]
(5)将于上清等体积的氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min，收集上清液。
[0086]
(6)将在4℃预冷的无水乙醇等体积加入离心管中，轻轻上下颠倒直至出现均匀的白色絮状沉淀后静置5min。
[0087]
(7)用无菌枪头小心挑出沉淀后转移至新的1.5ml离心管中，加入4℃预冷的75％乙醇清洗1次-2次，4℃、13400rpm离心10min，弃上清液。
[0088]
(8)打开离心管盖子，室温静置至乙醇挥发殆尽，加入30μl-50μl eb缓冲液溶解dna沉淀。
[0089]
(9)利用分光光度计检测dna纯度及浓度及琼脂点凝胶电泳检验后置于-80℃长期保存备用。
[0090]
步骤s6基因组pcr：
[0091]
(1)利用primer5软件设计引物，该引物由华大基因合成，引物合成后加超纯水溶解稀释后4℃保存。
[0092]
(2)以上述提取的基因组为模板进行pcr扩增目的片段，反应体系如下：
[0093][0094][0095]
(3)pcr扩增条件如下：
[0096][0097]
(5)上述反应结束后，制备1％的琼脂糖凝胶，取5μl pcr扩增产物进行电泳检测。检测结果分别如附图2a，附图2b所示，证明转基因家蚕hp、lp制作成功。。
[0098]
步骤s7后续为了对改良家蚕大规模进行饲养，将基于305的多化品种的转基因系统导入到滞育种qb中，获得基于qb的蚕丝性能改良品系。
[0099]
实例三
[0100]
本实例所述为验证调控表达内源基因是否成功，具体步骤为：
[0101]
步骤s1取导入qb的五龄第六天(5l6d)转基因家蚕后部丝腺用于rna的提取(omega)，然后测定rna浓度。
[0102]
步骤s2对总rna(1m g(毫克))进行反转，使用takara试剂盒进行反转录。
[0103]
步骤s3 qrt-pcr采用qtower 2.0pcr系统和sybr预混料ex taq ii(takara)进行荧光定量pcr，反应结束后进行熔解曲线分析，临界循环数值(ct值)由系统7500system sds software自动获取，采用2
‑△△
ct
相对定量法对数据进行分析。最终荧光定量结果如附图3所示。
[0104]
实例四
[0105]
本实例所述为蚕丝改良家蚕的表型观察，具体步骤为：
[0106]
步骤s1获得的转基因品系用新鲜的桑叶进行饲养，并在饲养至5l6d时解剖阳性个体，取出完整丝腺后观察拍照，结果如附图4所示，发现转基因阳性个体与对照无明显形态差异，说明该4种改良方法均不对家蚕正常生活和吐丝结茧产生严重影响。
[0107]
步骤s2随后将阳性个体继续饲养至上簇，收集茧壳进行观察，结果如附图4所示，发现与实验组相比，改良后的家蚕茧在形态上不会产生显著差异，进一步说明转基因对家蚕正常发育无不利影响。
[0108]
实例五
[0109]
本实例所述为改良蚕丝的力学性能检测，具体步骤为：
[0110]
步骤s1选择基于qb的转基因品系作为实验组，各选取正常上簇蚕茧10个，将蚕茧浸没在100℃沸水中，30s(秒)，立即置于45℃温水中，1min；再次将蚕茧浸没在100℃沸水中，30s，立即置于45℃温水中，1min。
[0111]
步骤s2随后将蚕茧置于45℃温水中进行缫丝。缫取每个蚕茧的中间区段进行样品检测，每个蚕茧进行5次样品重复。扫描电镜scanning electron microscope(sem)【飞纳，荷兰】。
[0112]
步骤s3将上述样品置于60度烘箱中烘干12h，将样品喷金后，置于10千k v(伏)电压，放大倍数为2500倍下观察蚕丝形态。通过digital photo,pixel-ratio method(fs-dp)方法，将每张蚕丝的电镜照片用image j计算出每种蚕茧的最大长轴直径l，短轴直径看做l/2，进而通过横截面积一致即π*(l/4)*(l/2)＝π*(r/2)*(r/2)，计算得到平均直径r。
[0113]
步骤s4采用单纤维强力仪【trapezium lite，日本shimadzu】对蚕丝进行拉伸试验，直径设置为计算所得r，设置拉伸速率为10mm/min(毫米每分钟)，间距为10mm(毫米)。测试前将待测蚕丝放在恒温恒湿(25℃，65％湿度)实验室24h(小时)，每种蚕茧获得50组数据，将数据导入origin软件作图，计算50组数据的平均曲线。结果如附图5所示，结果显示，相较于两种未改造蚕丝，改良蚕丝的力学性能有显著提升，较qb而言，以家蚕fibh启动子(seq id no.3)表达fibl基因(seq id no.1)和p25基因(seq id no.10)两种改良蚕丝甚至提高了1倍以上。
[0114]
序列表：
[0115]
seq id no.1 fibl基因
[0116]
atgaagcctatatttttggtattactcgtcgctacaagcgcctacgctgcaccatcggtgaccatcaatcaatacagtgataatgaaattccacgcgacattgatgatggaaaagctagttccgtaatctcacgtcgatgggactacgtcgatgacactgacaaaagcatcgccatcctcaacgttcaagagatcttgaaggacatggccagccagggcgattatgcaagtcaagcatcagcggtggcccaaaccgccggaattatcgcccatctatctgccggtatccccggtgatgcctgtgcagccgctaacgtcattaactcttacacagacggcgtcaggtccggaaacttcgccggcttcagacaatctctcggtcccttcttcggacacgtgggacaaaacttgaatcttatcaatcaactcgtcatcaaccctggtcaactccgatactctgtcggaccagccctgggttgtgccggaggtggaagaatctatgacttcgaagccgcttgggatgcaatcttagccagcagtgactctagtttcttaaatgaagagtactgcatcgtcaagagattgtacaactctcgcaacagccaaagcaacaacatcgctgcctacataaccgctcacttacttcctccggttgctcaagtgttccaccaatcagctggatcaatcacagacctcctgagaggcgttggcaacggtaatgacgcgaccggcttagttgctaatgctcaaagatatattgcacaagcagccagccaggttcacgtctaa
[0117]
seq id no.2 p25基因
[0118]
atgctggcgcggtgtctagctgtagccgctgtggcagttttggcttctgcagggccgccgagtccgatctacaggccctgctacttggacgattacaaatgcatctccgaccacctggccgcgaactcgaaatgtatcccgggcagagggcagatcccctcgcagtacgagataccggtgttccagtttgaaataccatacttcaacgccacctacgtcgaccataatctcattacccgtaatcacgatcagtgccgtgtcagcgaattttatgacaatgtgagaactttaaaaacagttttaaccgtggactgtccgtggctgaactttgaatccaaccggaccttggctcagcacatgtcgttcaaggaagacgtcgtcttaagcttctacatcaatggatcttatcctttgatcaggctaacgacagtgtttgataagggcaaca
atttcgacttgtgttcggctttcacgttcgcagacctggccgggggtctgcccatcttccacattaaccctaatgaccaacgcacagcgcagtggttgtctaaagatctgaccctgctgcacatttacgagagagagcacatcttcggaaagaggaactggctggcgaggtccttcatcagcagaacactctgcgacttcggttgccagcactga
[0119]
seq id no.3 fibh启动子序列
[0120]
cctgcgtgatcaggaaaaatgtggaaagcttaacgattttgtcacattttacttatcacaacttgtttttataataattcgcttaaatgagcagctattacttaatctcgtagtggtttttgacaaaatcagcttctttagaactaaaatatcatttttttcgtaatttttttaatgaaaaatgctctagtgttatacctttccaaaatcaccattaattaggtagtgtttaagcttgttgtacaaaactgccacacgcatttttttctccactgtaggttgtagttacgcgaaaacaaaatcgttctgtgaaaattcaaacaaaaatattttttcgtaaaaacacttatcaatgagtaaagtaacaattcatgaataatttcatgtaaaaaaaaaatactagaaaaggaatttttcattacgagatgcttaaaaatctgtttcaaggtagagatttttcgatatttcggaaaattttgtaaaactgtaaatccgtaaaattttgctaaacatatattgtgttgttttggtaagtattgacccaagctatcacctcctgcagtatgtcgtgctaattactggacacattgtataacagttccactgtattgacaataataaaacctcttcattgacttgagaatgtctggacagatttggctttgtatttttgatttacaaatgtttttttggtgatttacccatccaaggcattctccaggatggttgtggcatcacgccgattggcaaacaaaaactaaaatgaaactaaaaagaaacagtttccgctgtcccgttcctctagtgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaaaattgaacgatattataaaattctttaaaatattaaaagtaagaacaataagatcaattaaatcataattaatcacattgttcatgatcacaatttaatttacttcatacgttgtattgttatgttaaataaaaagattaatttctatgtaattgtatctgtacaatacaatgtgtagatgtttattctatcgaaagtaaatacgtcaaaactcgaaaattttcagtataaaaaggttcaactttttcaaatcagcatcagttcggttccaactctcaag
[0121]
seq id no.4 fibl启动子序列tgcatattggacatcccttttcttgacatcgtataaattcggtaattctcggtacggttcgtaaagttcacctgcggctatattccgactcgccaagttacgtcagtcgtattgtaatgagcgatttagtgggcaacttcattctgttaattttgtgtcacggtgcgcgcgcatcgtaaaacttcactctcatagatttttcataacgcgcctaaagaagtataacttcaataatttaaatttaaaaaaaaacatgcatagaataattatatgaattatttaaaatgtcatttaccgacattgacataacagacgacgttaacactacaaaacattttaattccacattgttacatattcaacagttaaatttgcgttaattctcgatgcgaacaaatataagaacaatcggatcaattagatcgctttgtttcgaacaacacttagtttaactagaggcgtacacctcaagaaatcatcttcattagaaactaaaccttaaaatcgcaataataaagcatagtcaattttaactgaaatgcaaagtcttttgaacgttagatgctgtcagcgttcgttggtacagttgtttgatatttattttaattgtctttttatatataaatagtggaacattaatcacggaatcctgtatagtatataccgattggtcacataacagaccactaa
[0122]
seq id no.5 lbs序列
[0123]
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[0124]
seq id no.6 lpa序列
[0125]
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[0126]
seq id no.7 3
×
p3ecfp序列
[0127]
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[0128]
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[0129]
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[0130]
seq id no.9 piggybac左臂
[0131]
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[0132]
seq id no.10 3
×
p3-dsred序列
[0133]
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[0134]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。