一种水解酶和一种(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的合成方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种水解酶和一种(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的合成方法。
背景技术：
2.神经病理性疼痛（np）是由躯体感觉系统的病灶或疾病所导致的疼痛，欧洲研究资料显示，普通人群神经病理性疼痛患病率高达8%。临床比较常见的类型包括：带状疱疹后遗神经痛、糖尿病神经病变引起的疼痛、癌性神经病理性疼痛、三叉神经痛等。而针对糖尿病性np、疱疹后神经痛和中枢性神经病理性痛这些适应症，普瑞巴林都属于一线用药。
3.从全球的抗癫痫药市场来看，普瑞巴林占比最高，达33.43%，其次为丙戊酸钠，达30.15%。而在我国癫痫药物市场规模不大，但糖尿病患者群巨大，该药仅用于治疗糖尿病性外周神经病相关神经病性疼痛就有望获得不错的销售，在加上其他的适应症，该药预期市场规模可观。
4.2017年按照销售额来看，辉瑞的lyrica在中国普瑞巴林市场份额约79.8%，其余市场被重庆赛维药业的占据。预计2018-2022年辉瑞的lyrica仍将在中国市场仍将占据主导地位，但由于遭遇来自价格较低的中国国产药的竞争，其市场份额将不断下降。
5.美国辉瑞公司研制开发的r-氨基丁酸(gaba)受体拮抗剂普瑞巴林的关键中间体是(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，其制备方法主要可分为不对称合成法、手性源合成法、外消旋体拆分法（化学拆分、酶拆分）、去对称合成法等，其中，化学拆分因其工艺成熟的优点，是现在工业生产的主要方法，但该法存在反应周期长、原料成本高且利用率低缺点。
6.如申请号为cn201910303983.9的一种光学纯（r）-3-氨甲酰甲基-5-甲基己酸的合成方法专利，该专利公开的化学拆分方法包括五个反应步骤：步骤一，合成2-氰基-5-甲基-2-烯己酸乙酯；步骤二，合成3-异丁基-2-氰基-4-乙氧羰基-戊二酸乙酯；步骤三，合成3-异丁基戊二酸酐；步骤四，合成(
±
)-3-氨甲酰甲基-5-甲基己酸；步骤五，合成(r)-3-氨甲酰甲基-5-甲基己酸。虽然该专利提供的方法原料成本有所降低，但是相对来说中间的实验步骤仍然繁琐，且会产生较多的化学废液，对环境不友好。
技术实现要素：
7.本发明的目的是提供一种水解酶，并应用该水解酶进行不对称水解催化合成(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，解决了目前化学拆分存在的拆分再消旋步骤的繁琐步骤、原料利用率低以及环境污染问题。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：一种水解酶，所述水解酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.一种(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的合成方法，其特征在于，以3-异丁基
戊二酰亚胺为底物，在水解酶的催化下合成产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；其中，所述水解酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.进一步地，所述合成反应包括以下步骤：s1：向反应容器中加入3-异丁基戊二酰亚胺和水解酶制剂，控制反应体系的ph在7.0-9.0之间，在一定温度条件下进行反应；s2：s1步骤反应完成后，将反应液进行加热冷却处理，之后加入助滤剂，经过滤，浓缩，再过滤，干燥后得(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。
11.进一步地，所述步骤s1中3-异丁基戊二酰亚胺的浓度为10-300g/l。
12.进一步地，所述步骤s1中水解酶制剂包括酶液、酶粉、湿菌体、固定化酶。
13.进一步地，所述水解酶酶液占反应体系总体积的5~20%。
14.进一步地，所述步骤s1中还包括pb缓冲液，所述pb缓冲液的浓度为0.05m，且所述pb缓冲液的ph=7-8；反应过程中用氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠控制反应体系的ph；所述反应温度为25-50℃；优选地，反应过程中用氨水控制反应体系的ph在7.9-8.0之间；优选地，所述反应温度为40℃。
15.进一步地，所述步骤s2后处理操作进行浓缩时，加入盐酸或硫酸调解浓缩液的ph为2.5-4之间。
16.进一步地，所述水解酶制剂的制备方法包括以下步骤：p1：将表达所述水解酶的重组大肠杆菌湿菌体与缓冲液混合；p2：在一定压力下进行均质破碎，得到酶液粗品；p3：将酶液粗品离心，取上清液，即得所述水解酶酶液。
17.p4：将水解酶酶液冷冻干燥，即得所述水解酶酶粉。
18.p5：将水解酶酶粉与固定化载体使用共价键进行连接，即得重组大肠杆菌固定化酶。
19.进一步地，在步骤p1中，所述水解酶的重组大肠杆菌湿菌体与所述缓冲液的混合比例为1g：6ml。本发明的有益效果为：1、本发明提供的水解酶来源于pseudomonas fluorescens，是经过基因工程化改造获得的工程菌表达的酶，参与生物催化反应时具有极高的手性选择性。
20.2、本发明利用基因工程化改造获得的水解酶催化底物3-异丁基戊二酰亚胺一步反应，即可成功合成了高浓度的(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，合成方法的整体工艺简单，反应条件温和，活性好，酶液的使用量低，且作为反应底物的3-异丁基戊二酰亚胺的浓度可以高达300g/l，且不会抑制酶的活性。
21.3、本发明提供的合成(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的反应过程未使用任何有机试剂，绿色环保，容易实施，而且且该目标产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的ee值可达到100%，适合工业化生产，应用前景广阔。
具体实施方式
22.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照生产厂商所建议的条件，需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
23.实施例1 水解酶酶库筛选以3-异丁基戊二酰亚胺为底物，对大量水解酶进行筛选，检测催化生成(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的结果。
24.筛选条件：10g/l 3-异丁基戊二酰亚胺，水解酶酶液，0.1m pb（ph7.5），反应温度为40℃，反应时间24h。
25.筛选结果显示来源于pseudomonas fluorescens 的水解酶表现出优异的(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸产物选择性。之后表达该水解酶的菌种进行基因工程化改造，最终获得氨基酸序列如seq id no.1所示的重组大肠杆菌菌株。
26.将重组大肠杆菌菌株进行扩大培养，获得重组大肠杆菌湿菌体。
27.实施例2重组大肠杆菌水解酶酶制剂的制备将实施例1中表达水解酶的重组大肠杆菌湿菌体与0.1m pb（ph7.6）按照1：6（g：ml）进行混合，接着用ats品牌的均质机在800bar的压力下进行均质破碎，得到酶液粗品；然后，以8000rpm的转速离心，取上清液，即得所述重组大肠杆菌水解酶酶液。
28.将上述重组大肠杆菌水解酶酶液置于冷冻冰箱中冷冻，冷冻后在冻干机中冻干得重组大肠杆菌水解酶酶粉；将重组大肠杆菌水解酶酶液与固定化载体处理一定时间，得重组大肠杆菌固定化水解酶。
29.实施例3 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺10g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v）（所述酶液体积占反应体系总体积的体积比），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.5-7.6，反应温度为40℃，反应1h后，转化率达到99.9%。
30.具体转化率的分析方法如下：转化率检测方法（液相分析）：流动相:0.4%高氯酸:乙腈=7：3（体积比）色谱柱: gemini 250*4.6mm 5um流速: 1ml/min柱温: 40℃检测波长: 210nm分析时间:13.5min溶剂：50%乙腈进样量：10uls2：反应完成之后实施的后处理包括：将反应液在75℃温度条件下处理2h，后冷却至25℃，加入硅藻土搅拌1h后进行抽滤得滤饼一和滤液，并用少量水冲洗滤饼一，将冲洗滤饼一的液体与滤液合并后，在60℃下减压浓缩到反应体积到90ml，然后加入盐酸调ph至2.9-3.0，搅拌1h后进行抽滤得滤饼二，滤饼二用少量水冲洗并抽干，将滤饼二在65℃烘箱
中烘干，产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
31.实施例4 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.5-7.6，反应温度为40℃，反应30h后，转化率达到99.5%。
32.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
33.实施例5 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应24h，转化率达到99.3%。
34.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
35.实施例6 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液20%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应6h，转化率达到99.2%。
36.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
37.实施例7 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为25℃，反应35h，转化率达到99.0%。
38.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
39.实施例8 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为50℃，反应20h，转化率达到99.8%。
40.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为99.7%。
41.实施例9 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.0-7.1，反应温度为40℃，反应40h，转化率达到99.4%。
42.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
43.实施例10 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆
菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在8.9-9.0，反应温度为40℃，反应21h，转化率达到99.1%。
44.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为99.6%。
45.实施例11 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌全细胞10g/l，0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应24h，转化率达到99.2%。
46.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
47.实施例12 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶粉1.67g/l，0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应24h，转化率达到99.4%。
48.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
49.实施例13 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌固定化酶20g/l，0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应24h，转化率达到99.7%。
50.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
51.实施例14 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺300g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应36h，转化率达到99.3%。
52.s1：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
53.以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种水解酶和一种(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的合成方法。
背景技术：
2.神经病理性疼痛（np）是由躯体感觉系统的病灶或疾病所导致的疼痛，欧洲研究资料显示，普通人群神经病理性疼痛患病率高达8%。临床比较常见的类型包括：带状疱疹后遗神经痛、糖尿病神经病变引起的疼痛、癌性神经病理性疼痛、三叉神经痛等。而针对糖尿病性np、疱疹后神经痛和中枢性神经病理性痛这些适应症，普瑞巴林都属于一线用药。
3.从全球的抗癫痫药市场来看，普瑞巴林占比最高，达33.43%，其次为丙戊酸钠，达30.15%。而在我国癫痫药物市场规模不大，但糖尿病患者群巨大，该药仅用于治疗糖尿病性外周神经病相关神经病性疼痛就有望获得不错的销售，在加上其他的适应症，该药预期市场规模可观。
4.2017年按照销售额来看，辉瑞的lyrica在中国普瑞巴林市场份额约79.8%，其余市场被重庆赛维药业的占据。预计2018-2022年辉瑞的lyrica仍将在中国市场仍将占据主导地位，但由于遭遇来自价格较低的中国国产药的竞争，其市场份额将不断下降。
5.美国辉瑞公司研制开发的r-氨基丁酸(gaba)受体拮抗剂普瑞巴林的关键中间体是(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，其制备方法主要可分为不对称合成法、手性源合成法、外消旋体拆分法（化学拆分、酶拆分）、去对称合成法等，其中，化学拆分因其工艺成熟的优点，是现在工业生产的主要方法，但该法存在反应周期长、原料成本高且利用率低缺点。
6.如申请号为cn201910303983.9的一种光学纯（r）-3-氨甲酰甲基-5-甲基己酸的合成方法专利，该专利公开的化学拆分方法包括五个反应步骤：步骤一，合成2-氰基-5-甲基-2-烯己酸乙酯；步骤二，合成3-异丁基-2-氰基-4-乙氧羰基-戊二酸乙酯；步骤三，合成3-异丁基戊二酸酐；步骤四，合成(
±
)-3-氨甲酰甲基-5-甲基己酸；步骤五，合成(r)-3-氨甲酰甲基-5-甲基己酸。虽然该专利提供的方法原料成本有所降低，但是相对来说中间的实验步骤仍然繁琐，且会产生较多的化学废液，对环境不友好。
技术实现要素：
7.本发明的目的是提供一种水解酶，并应用该水解酶进行不对称水解催化合成(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，解决了目前化学拆分存在的拆分再消旋步骤的繁琐步骤、原料利用率低以及环境污染问题。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：一种水解酶，所述水解酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.一种(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的合成方法，其特征在于，以3-异丁基
戊二酰亚胺为底物，在水解酶的催化下合成产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；其中，所述水解酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.进一步地，所述合成反应包括以下步骤：s1：向反应容器中加入3-异丁基戊二酰亚胺和水解酶制剂，控制反应体系的ph在7.0-9.0之间，在一定温度条件下进行反应；s2：s1步骤反应完成后，将反应液进行加热冷却处理，之后加入助滤剂，经过滤，浓缩，再过滤，干燥后得(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。
11.进一步地，所述步骤s1中3-异丁基戊二酰亚胺的浓度为10-300g/l。
12.进一步地，所述步骤s1中水解酶制剂包括酶液、酶粉、湿菌体、固定化酶。
13.进一步地，所述水解酶酶液占反应体系总体积的5~20%。
14.进一步地，所述步骤s1中还包括pb缓冲液，所述pb缓冲液的浓度为0.05m，且所述pb缓冲液的ph=7-8；反应过程中用氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠控制反应体系的ph；所述反应温度为25-50℃；优选地，反应过程中用氨水控制反应体系的ph在7.9-8.0之间；优选地，所述反应温度为40℃。
15.进一步地，所述步骤s2后处理操作进行浓缩时，加入盐酸或硫酸调解浓缩液的ph为2.5-4之间。
16.进一步地，所述水解酶制剂的制备方法包括以下步骤：p1：将表达所述水解酶的重组大肠杆菌湿菌体与缓冲液混合；p2：在一定压力下进行均质破碎，得到酶液粗品；p3：将酶液粗品离心，取上清液，即得所述水解酶酶液。
17.p4：将水解酶酶液冷冻干燥，即得所述水解酶酶粉。
18.p5：将水解酶酶粉与固定化载体使用共价键进行连接，即得重组大肠杆菌固定化酶。
19.进一步地，在步骤p1中，所述水解酶的重组大肠杆菌湿菌体与所述缓冲液的混合比例为1g：6ml。本发明的有益效果为：1、本发明提供的水解酶来源于pseudomonas fluorescens，是经过基因工程化改造获得的工程菌表达的酶，参与生物催化反应时具有极高的手性选择性。
20.2、本发明利用基因工程化改造获得的水解酶催化底物3-异丁基戊二酰亚胺一步反应，即可成功合成了高浓度的(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，合成方法的整体工艺简单，反应条件温和，活性好，酶液的使用量低，且作为反应底物的3-异丁基戊二酰亚胺的浓度可以高达300g/l，且不会抑制酶的活性。
21.3、本发明提供的合成(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的反应过程未使用任何有机试剂，绿色环保，容易实施，而且且该目标产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的ee值可达到100%，适合工业化生产，应用前景广阔。
具体实施方式
22.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照生产厂商所建议的条件，需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
23.实施例1 水解酶酶库筛选以3-异丁基戊二酰亚胺为底物，对大量水解酶进行筛选，检测催化生成(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的结果。
24.筛选条件：10g/l 3-异丁基戊二酰亚胺，水解酶酶液，0.1m pb（ph7.5），反应温度为40℃，反应时间24h。
25.筛选结果显示来源于pseudomonas fluorescens 的水解酶表现出优异的(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸产物选择性。之后表达该水解酶的菌种进行基因工程化改造，最终获得氨基酸序列如seq id no.1所示的重组大肠杆菌菌株。
26.将重组大肠杆菌菌株进行扩大培养，获得重组大肠杆菌湿菌体。
27.实施例2重组大肠杆菌水解酶酶制剂的制备将实施例1中表达水解酶的重组大肠杆菌湿菌体与0.1m pb（ph7.6）按照1：6（g：ml）进行混合，接着用ats品牌的均质机在800bar的压力下进行均质破碎，得到酶液粗品；然后，以8000rpm的转速离心，取上清液，即得所述重组大肠杆菌水解酶酶液。
28.将上述重组大肠杆菌水解酶酶液置于冷冻冰箱中冷冻，冷冻后在冻干机中冻干得重组大肠杆菌水解酶酶粉；将重组大肠杆菌水解酶酶液与固定化载体处理一定时间，得重组大肠杆菌固定化水解酶。
29.实施例3 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺10g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v）（所述酶液体积占反应体系总体积的体积比），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.5-7.6，反应温度为40℃，反应1h后，转化率达到99.9%。
30.具体转化率的分析方法如下：转化率检测方法（液相分析）：流动相:0.4%高氯酸:乙腈=7：3（体积比）色谱柱: gemini 250*4.6mm 5um流速: 1ml/min柱温: 40℃检测波长: 210nm分析时间:13.5min溶剂：50%乙腈进样量：10uls2：反应完成之后实施的后处理包括：将反应液在75℃温度条件下处理2h，后冷却至25℃，加入硅藻土搅拌1h后进行抽滤得滤饼一和滤液，并用少量水冲洗滤饼一，将冲洗滤饼一的液体与滤液合并后，在60℃下减压浓缩到反应体积到90ml，然后加入盐酸调ph至2.9-3.0，搅拌1h后进行抽滤得滤饼二，滤饼二用少量水冲洗并抽干，将滤饼二在65℃烘箱
中烘干，产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
31.实施例4 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.5-7.6，反应温度为40℃，反应30h后，转化率达到99.5%。
32.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
33.实施例5 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应24h，转化率达到99.3%。
34.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
35.实施例6 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液20%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应6h，转化率达到99.2%。
36.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
37.实施例7 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为25℃，反应35h，转化率达到99.0%。
38.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
39.实施例8 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为50℃，反应20h，转化率达到99.8%。
40.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为99.7%。
41.实施例9 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.0-7.1，反应温度为40℃，反应40h，转化率达到99.4%。
42.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
43.实施例10 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆
菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在8.9-9.0，反应温度为40℃，反应21h，转化率达到99.1%。
44.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为99.6%。
45.实施例11 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌全细胞10g/l，0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应24h，转化率达到99.2%。
46.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
47.实施例12 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌酶粉1.67g/l，0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应24h，转化率达到99.4%。
48.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
49.实施例13 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺200g/l，重组大肠杆菌固定化酶20g/l，0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应24h，转化率达到99.7%。
50.s2：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
51.实施例14 (r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的不对称合成s1：反应体系总体积为100ml，具体包括：3-异丁基戊二酰亚胺300g/l，重组大肠杆菌酶液5%（v/v），0.05m pb(ph7.6)作为缓冲液，反应过程中用稀释2倍的氨水将反应体系的ph控制在7.9-8.0，反应温度为40℃，反应36h，转化率达到99.3%。
52.s1：反应完成之后实施的后处理同实施例3；产物(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的纯度大于99%，ee值为100%。
53.以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
再多了解一些
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