猪非典型瘟病毒的微滴数字PCR试剂盒及其检测方法与流程

猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法
技术领域
1.本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一种猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.猪非典型瘟病毒（atypical porcine pestivirus，appv）属于黄病毒科瘟病毒属成员，是一种无囊膜、单股正链rna病毒，其基因组长约11 kb，包含上游5
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非编码区（utr）、开放阅读框（orf）和下游3
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utr，其中orf编码4种结构蛋白和8种非结构蛋白。与猪非典型瘟病毒同属的病毒还有猪瘟病毒（csfv）、牛病毒性腹泻病毒1型（bvdv-1）和2型（bvdv-2）和边界病病毒（bdv）。我国在2016年于广东省首次报道appv，此后广西、贵州、江西、云南、四川等省也陆续报道。我国作为养猪大国，appv的发生和流行对养猪业造成了严重的经济损失，同时appv与csfv所致的仔猪ct在临床症状和病理变化难以区分，因此，建立特异、敏感的appv检测和诊断方法，对于防控 appv具有重要的现实意义。
3.微滴数字pcr（droplet digital pcr，ddpcr）是一种新的分子技术，可以在不使用标准样品的情况下通过泊松分布校正得到目标基因的绝对拷贝数进而进行定量，对非常低的模板浓度有着极高的灵敏度和精确度。由于可以实现绝对定量和增强检测灵敏度，数字pcr技术可用于检测病毒感染、病毒潜伏库检测、残留病毒载量等。目前我国已有报道针对非洲猪瘟病毒（csfv）、猪圆环病毒（pcv）、猪伪狂犬病毒（prv）等猪源致病病毒的微滴数字pcr检测方法，但是针对appv病毒的微滴数字pcr检测方法却未有报道，目前针对appv病毒的仅有单重、多重rt-pcr检测方法和荧光定量rt-pcr检测方法。


技术实现要素：

4.针对上述不足，本发明公开了一种猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法，其具有特异性好、灵敏度高的优点，为实验室鉴别检测appv病毒提供了有效的技术手段。
5.本发明是采用如下技术方案实现的：一种猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒，其包括引物appv-fq、引物appv-rq和探针appv-p；所述引物appv-fq为gacctgcccaaagaggcat（seq id no.1）；所述引物appv-rq为gccactgtatcaagcagtaacctcta（seq id no.2）；探针appv-p为fam-tcaggtccaccatgccaattt-bhq1（seq id no.3）。
6.一种猪非典型瘟病毒的检测方法，所述检测方法为猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr检测方法，其包括以下步骤：（1）样品处理：取待测样品0.5 g，放入装有无菌钢珠的2 ml灭菌离心管中，加入1 ml生理盐水，利用磨碎仪研磨至糜状，离心后取上清液200
ꢀµ
l，通过ex-dna/rna病毒提取试剂盒自动抽提总rna后，利用primescripttm ii 1st strand cdna synthesis kit反转录
试剂盒将其反转录成cdna备用；所述待测样品为猪的组织样品；（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中反转录得到的cdna作为模板进行ddpcr扩增反应，采用如seq id no.1～no.3所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为25μl，其具体包括：perfecta qpcr toughmix ung (2
×
) 12.5
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l，浓度为10
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m的fluorescein sodium salt 2.5
ꢀµ
l，浓度为25 pmol/
µ
l的引物appv-fq和浓度为25 pmol/
µ
l的引物appv-rq各0.8
ꢀµ
l，浓度为25 pmol/
µ
l的探针appv-p 0.4
ꢀµ
l，模板2.5
ꢀµ
l，无rna酶双蒸水5.5
ꢀµ
l；（3）微滴生成和pcr扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液加入到sapphire芯片的孔井中并封闭孔井，然后将其转移到naica geode微滴生成和扩增系统中进行微滴生成和pcr扩增，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性15s；95℃变性5s，59℃退火34s，共进行45个循环；（4）微滴信号的读取和分析：将经过步骤（3）处理的sapphire芯片移入nacia prism 3仪器中，选择好荧光通道和芯片位置后开始读取芯片中的微滴数和荧光值，然后仪器会自动对每个芯片拍照，并对芯片的中的每个微滴进行三色检测器扫描，确定阴阳性微滴信号，并且根据泊松分布原理计算出绝对检测浓度。
7.进一步的，步骤（1）中所述待测样品包括猪的肝、脾、肺、扁桃体和淋巴结中的任意一种或多种的组织样品。
8.本发明与现有技术相比较具有以下有益效果：1、本发明针对appv 5’utr基因序列设计特异性引物和探针，优化引物浓度、退火温度、扩增循环数等反应条件，并进行敏感性、特异性、重复性试验，得到用于检测猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及检测方法，为appv快速、准确检测、监测和流行病学调查提供了有效的技术手段。
9.2、本发明方法操作简单，不仅具有特异性好、绝对定量、无需有证标准物质、对pcr抑制剂的耐受力好等优点，而且本发明方法的检出下限为0.14 copies/μl，即达到1
×
10-1 copies/μl，而qpcr方法的检出下限为1
×
10
0 copies/μl。可见，在体内病毒含量低的感染早期、持续感染期，以及病毒残留少的猪场环境、运输车辆尤其是清洗过的运输车辆，应用本发明方法对appv病毒检测具有巨大的优势和潜力。
附图说明
10.图1是实验例中所述重组质粒pappv的电泳图，图中m为dl1 500 dna marker；1为pcr产物；2为hind ecor i 酶切产物。
11.图2是实验例中引物和探针浓度优化所获得的检测pappv的微滴散点图，图中1～12分别表示表1中编号1～12所示引物和探针浓度所获得的结果。
12.图3是实验例中退火温度优化所获得的检测pappv的微滴散点图，图中1～6分别表示表2中编号1～6所示退火温度所获得的结果。
13.图4是实验例中特异性实验所获得的微滴散点图，图中1～11依次表示appv、csfv、prrsv、bdv、bvdv-1、bvdv-2、asfv、pcv1、pcv3、pcv2和阴性对照。
14.图5是实验例中敏感性试验所得到的qpcr扩增曲线图，图中1～8分别表示pappv的终浓度为：1
×
106copies/μl，1
×
105copies/μl，1
×
104copies/μl，1
×
103copies/μl，1
×
102copies/μl，1
×
101copies/μl，1
×
100copies/μl，1
×
10-1
copies/μl。
15.图6是实验例中敏感性试验所得到的qpcr的标准曲线。
16.图7是实验例中敏感性试验所得到的ddpcr微滴散点图，图中1～9分别表示pappv的终浓度为：1
×
106copies/μl，1
×
105copies/μl，1
×
104copies/μl，1
×
103copies/μl，1
×
102copies/μl，1
×
101copies/μl，1
×
100copies/μl，1
×
10-1
copies/μl，阴性对照。
17.图8是实验例中敏感性试验所得到的ddpcr的标准曲线。
具体实施方式
18.以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
19.实施例1：一种猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒，其包括引物appv-fq、引物appv-rq和探针appv-p，扩增产物的大小为102bp；所述引物appv-fq为gacctgcccaaagaggcat（seq id no.1）；所述引物appv-rq为gccactgtatcaagcagtaacctcta（seq id no.2）；探针appv-p为fam-tcaggtccaccatgccaattt-bhq1（seq id no.3）。
20.一种猪非典型瘟病毒的检测方法，所述检测方法为猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr检测方法，其包括以下步骤：（1）样品处理：取待测样品0.5 g，放入装有无菌钢珠的2 ml灭菌离心管中，加入1 ml生理盐水，利用磨碎仪研磨至糜状，离心后取上清液200
ꢀµ
l，通过ex-dna/rna病毒提取试剂盒自动抽提总rna后，利用primescripttm ii 1st strand cdna synthesis kit反转录试剂盒将其反转录成cdna备用；所述待测样品为猪的组织样品，所述待测样品包括猪的肝、脾、肺、扁桃体和淋巴结中的任意一种或多种；（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中反转录得到的cdna作为模板进行ddpcr扩增反应，采用如seq id no.1～no.3所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为25μl，其具体包括：perfecta qpcr toughmix ung (2
×
) 12.5
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l，浓度为10
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m的fluorescein sodium salt 2.5
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l，浓度为25 pmol/
µ
l的引物appv-fq和浓度为25 pmol/
µ
l的引物appv-rq各0.8
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l，浓度为25 pmol/
µ
l的探针appv-p 0.4
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l，模板2.5
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l，无rna酶双蒸水5.5
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l；（3）微滴生成和pcr扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液加入到sapphire芯片的孔井中并封闭孔井，然后将其转移到naica geode微滴生成和扩增系统中进行微滴生成和pcr扩增，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性15s；95℃变性5s，59℃退火34s，共进行45个循环；（4）微滴信号的读取和分析：将经过步骤（3）处理的sapphire芯片移入nacia prism 3仪器中，选择好荧光通道和芯片位置后开始读取芯片中的微滴数和荧光值，然后仪器会自动对每个芯片拍照，并对芯片的中的每个微滴进行三色检测器扫描，确定阴阳性微滴信号，并且根据泊松分布原理计算出绝对检测浓度。
21.实验例：
对本发明所述的猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法分别进行特异性、敏感性和重复性的试验分析，具体试验分析过程如下：（1）实验用各种病毒的总核酸提取及反转录：分别取appv、bdv、bvdv-1和bvdv-2的临床阳性样品混悬液上清液以及csfv （c株）、prrsv （tjm-f92株）病毒液各200
ꢀµ
l，采用ex-dna/rna病毒核酸抽提试剂盒提取总rna，并使用primescripttm ii 1st strand cdna synthesis kit反转录试剂盒反转录成cdna；分别取asfv、pcv1、pcv3的临床阳性样品混悬液上清液各200
ꢀµ
l，pcv2（sx07株）病毒液200
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l，采用ex-dna/rna病毒核酸抽提试剂盒提取总dna。将所得到的cdna和总dna置于-20℃下保存备用。
22.（2）appv重组质粒标准品的制备：以步骤（1）中得到的appv的cdna作为模板，采用实施例1所述扩增反应进行扩增。回收扩增产物，连接至pmd18-t 载体，转化到dh5α感受态细胞，涂amp
lb平板，过夜培养后挑选阳性菌落进行增菌，提取质粒后进行酶切（hind ecor i 酶切）、pcr和测序鉴定。正确构建重组质粒后，将其命名为pappv作为阳性标准品，用核酸蛋白分析仪测定质粒od260 nm值，计算质粒浓度并换算成拷贝数（copies/μl），所述重组质粒pappv的电泳图见图1。
23.（3）ddpcr扩增反应条件的优化：取步骤（2）中得到的pappv阳性标准品作为模板，按照实施例1中所述方法进行检测，其中对扩增反应液进行调整，设置11组不同浓度的引物和探针组合，编号12是以无rna酶双蒸水作为模板的阴性对照（具体浓度见表1），pcr扩增的反应程序为：95℃预变性15s；95℃变性5s，55℃退火34s，共进行45个循环，所得到的检测结果见图2。
24.表1扩增反应液中各个引物和探针的浓度取步骤（2）中得到的pappv阳性标准品作为模板，按照实施例1中所述方法进行检测，其中对pcr扩增的反应程序进行调整，设置不同的退火温度（具体温度见表2），其它的反应程序和扩增反应液的配制均不变，所得到的检测结果见图3。
25.表2 pcr扩增的反应程序的退火温度
根据液滴生产数、微滴密集程度和阳性液荧光信号值高度等情况综合考虑分析，退火温度如图3所示，各个退火温度结果差异不大，综合阳性微滴低落情况，选择59℃为最佳退火温度；如图2所示，在引物和探针浓度组合中，编号8的阳性液荧光信号值高度最高，微滴密集程度较好，并且阴阳性液荧光信号值区分明显，中间弥散的微滴数占比较低，所以确定扩增反应液中引物appv-fq和引物appv-rq的浓度为0.8pmol/
µ
l，探针appv-p的浓度为0.4pmol/
µ
l。
26.（4）特异性试验：ddpcr无需重组质粒标准品作为阳性对照，直接取步骤（1）中得到的appv、bdv、bvdv-1、bvdv-2、prrsv和csfv的cdna，以及asfv、pcv1、pcv3和pcv2的总dna，将它们进行1000倍稀释后，各取2.5μl作为模板，并且以无rna酶双蒸水为阴性对照，按照实施例1中所述方法进行检测，结果见图4。结果显示，仅能检测出appv，而其它各种模板均为阴性，表明本发明的检测方法与其它病毒没有交叉反应，具有较强的特异性。
27.（4）敏感性试验：取步骤（2）中得到的pappv阳性标准品配制成浓度为1
×
10
6 copies/μl的溶液，然后10倍倍比稀释至1
×
10-1 copies/μl，接着再分别取2
ꢀµ
l作为模板进行qpcr检测，得到荧光定量pcr的扩增曲线和标准曲线如图5和图6所示；同时分别取2.5
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l作为模板，并且以无rna酶双蒸水为阴性对照，按照实施例1所述方法进行检测，得到对应的微滴模板及标准曲线如图7和图8所示。
28.结果显示，当样品dna模板量高于20000时，阳性微滴数与生成总微滴数接近，不满足泊松分布，无法实现ddpcr的准确定量，因此在ddpcr反应中，当25
ꢀµ
l反应液中的拷贝数为5~6数量级时，pappv结果均为阳性，拷贝数为-1数量级时，检测到3个扩增，故ddpcr的检出下限为0.14copies/μl。所以ddpcr和qpcr的线性关系均较好，ddpcr敏感性高于qpcr。（qpcr的扩增体系总体积为20μl，具体包括premix ex taqtm（perfect real time）10
ꢀµ
l，浓度为20 pmol/
µ
l的appv-fq和浓度为20 pmol/
µ
l的appv-rq各0.4
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l，浓度为20 pmol/
µ
l的appv-p 0.3
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l，模板2
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l，无rna酶双蒸水6.9
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l；扩增程序为：预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s，59℃退火34 s，40个循环。）。
29.（5）重复性试验：取步骤（2）中得到的pappv阳性标准品配制成浓度为1
×
10
3 copies/μl的溶液，然后10倍倍比稀释至1
×
10
0 copies/μl，分别取2.5μl作为模板按照实施例1所述方法进行检测，而且组内及组间重复性试验各进行3次，具体结果见表3。结果显示，组内和组间重复性试验的变异系数（cv）均小于6 %，具有良好的重复性。
30.表3 ddpcr的重复性分析
（6）临床样品检测试验：将2019～2020年采自广西各地60份猪的组织样品，取肝、脾、肺、扁桃体和淋巴结约0.5 g，放入装有无菌钢珠的2 ml灭菌离心管中，加入1 ml生理盐水，利用磨碎仪研磨至糜状，离心后取上清200
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l，通过ex-dna/rna病毒提取试剂盒自动抽提总rna后，利用primescripttm ii 1st strand cdna synthesis kit反转录试剂盒将其反转录成cdna作为模板，以1
×
104copies/μl的pappv重组质粒标准品为阳性对照，以无rna酶双蒸水为阴性对照，按照实施例1所述方法进行检测。同时按照上述敏感性试验中所述qpcr方法进行检测，通过kappa统计分析两种方法检测结果的一致性，具体结果见表4。
31.结果显示，qpcr方法检出appv阳性14份（以ct值＜35为准），1份疑是阳性样品(ct值为36.145)，ddpcr检测结果为15份阳性样品appv阳性，核酸浓度最低达到为1.23拷贝/μl ddpcr，结果判断为阳性；ddpcr与qpcr检测结果的符合率为98.33%，kappa至分析一致性为0.955＞0.75，证明两种检测方法一致性较高。因qpcr无法对可疑样本进行准确判断，而ddpcr敏感性更高，可视化芯片扫描结果可以清晰区分阳性微滴和杂质污染导致的假阳性结果，对低拷贝的样品检测结果更为准确可靠。
32.表4 ddpcr和qpcr检测结果的比较此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式，上述实施例中的实验方法和试验材料，如无特殊说明，均为常规方法和市售材料。