抗人B淋巴细胞表面抗原CD20的单域抗体及其应用

抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，尤其涉及抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体及其应用。


背景技术：

2.b细胞淋巴瘤是一种来源于淋巴组织有不同临床表现的异质性淋巴增生性疾病。它包括从缓慢增长的霍奇金淋巴瘤(hd)，到更具侵略性的非霍奇金淋巴瘤(nhl)，如弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。最近这些年，患非霍奇金淋巴瘤的人数不断增多，发病率也在不断攀升。在这些非霍奇金淋巴瘤(nhl)病例中，有85％以上为b细胞疾病。同时据研究表明，95％以上b细胞淋巴瘤均异常高度表达cd20。
3.cd20分子又称为b淋巴细胞表面抗原b1、跨膜4结构域亚家族a成员1和ms4a1，它是一种b淋巴细胞表面的特异性膜蛋白，以非糖基化形式存在。该抗原表位表达于前b淋巴细胞和成熟b淋巴细胞中而不表达于造血干细胞、浆细胞和其他组织中。人cd20共由297个氨基酸组成，其相对分子量为33-35kda。cd20分子有四个跨膜结构域，包括两个胞外环和胞内区域。经研究证明，第三、四跨膜区的47个氨基酸外环为cd20的抗原表位，被大多数抗cd20抗体所识别。cd20蛋白没有已知的天然配体干扰其与抗体的结合，并且cd20与抗体结合后无显著内化和脱落也不因与抗体结合而发生抗原调变,从而成为治疗b细胞淋巴瘤的理想靶点。
4.目前，经过批准上市的cd20靶点抗体类药物，利妥昔单抗—美罗华(rituximab)获得较大的市场占有率，奥法木单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞珠单抗也分别在2009、2013、2017年上市，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。靶向cd20抗体的抗肿瘤活性主要包括诱导凋亡作用、补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity，cdc)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，adcc)。单克隆抗体将继续用于多种癌症的治疗。然而，由于其分子量较大，携带四个多肽链，限制了它们接近肿瘤靶标。
5.抗体药物，特别是基因工程抗体药物作为被动免疫制剂在疾病的诊断、预防和被动免疫治疗中显示出了非常好的应用前景。特别是近年发现的骆驼科动物体内天然缺失抗体轻链和ch1区的“单域重链抗体”(vhh)是目前研究的热点之一。由于此种单域重链抗体vhh的分子量只有普通单克隆抗体的1/10，大小仅为2-5nm，也被称为单域抗体(single domain antibody，sdab)，或纳米抗体(nanobody，nb)。重链可变区的长cdr3区可以形成一个稳定的凸起环结构，该结构中的稳定的二硫键可以穿透抗原的内部，与普通抗体与抗原形成的凹形拓扑结构相比，vhh抗体与抗原的亲和力更高。sdab可用于显示传统免疫球蛋白的隐藏表位，使其在免疫研究、诊断检测、医学和生物成像以及治疗性抗体开发等领域取得了广泛的应用。
6.但目前尚未有针对b细胞淋巴瘤的cd20分子的单域抗体的报道。


技术实现要素：

7.鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体及其应用。
8.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
9.本发明提供抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体，单域抗体vhh链包括框架区fr和互补决定区cdr；
10.所述框架区fr包括fr1、fr2、fr3、fr4，fr1的氨基酸序列包括seq id no.1所示的氨基酸序列，fr2的氨基酸序列包括seq id no.2所示的氨基酸序列，fr3的氨基酸序列包括seq id no.3所示的氨基酸序列，fr4的氨基酸序列包括seq id no.4所示的氨基酸序列；
11.所述互补决定区cdr包括cdr1、cdr2、cdr3，cdr1的氨基酸序列包括seq id no.5所示的氨基酸序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.6所示的氨基酸序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.7所示的氨基酸序列。
12.采取上述技术方案的有益效果包括：
13.本发明采用人cd20胞外区多肽免疫双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对cd20单域重链抗体噬菌体抗体库，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的单域重链抗体，意外的获得了针对cd20蛋白的单域重链抗体基因，将此基因转入大肠杆菌中，建立了能在大肠杆菌中高效表达的单域重链抗体株，根据序列比对软件分析各个克隆株的基因序列，获得针对cd20蛋白的单域重链抗体vhh链的氨基酸序列，并证明了该单域重链抗体可以同cd20蛋白特异性结合。
14.本发明获得的抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体具有高亲和力、高特异性的优点。
15.进一步，单域抗体的氨基酸序列包括seq id no.8所示的氨基酸序列。进一步的，单域抗体的可变区的氨基酸序列包括seq id no.8所示的氨基酸序列。
16.进一步，单域抗体的的核苷酸序列包括seq id no.9所示的核苷酸序列。
17.本发明提供的单域抗体分子量小，具有更好的溶解度和稳定性。与传统抗体相比，本发明提供的单域抗体免疫原性更小，易于进行人源化改造和临床应用。且表面亲水性更强，不存在传统抗体重链与轻链之间产生错配。
18.本发明提供一种多肽、蛋白质或双特异性抗体，多肽、蛋白质或双特异性抗体的氨基酸序列包括上述单域抗体的vhh链氨基酸序列。
19.进一步，所述多肽、所述蛋白质、所述双特异性抗体均包括上述的抗cd20特异性单域抗体。
20.在本发明实施例中，提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括上述针对cd20单域抗体的可变区以及抗cd3单域抗体的可变区。
21.进一步，双特异性抗体包括cd20单域抗体和cd3单域抗体，cd20单域抗体和cd3单域抗体之间通过连接肽(linker)连接。
22.采取上述技术方案的有益效果包括：
23.本发明将抗cd20蛋白的单域重链抗体基因与抗cd3单域抗体基因通过连接肽进行连接，避免传统双特异性抗体轻链与重链之间的错配。提供的双特异性抗体能够特异性结合t细胞表面抗原分化簇3即cd3分子和肿瘤表面抗原分化簇20即cd20分子，完整的保留了
抗cd20抗体和抗cd3抗体的生物学活性，从而使该双特异性单域抗体更好的识别肿瘤抗原和效应细胞，并将效应细胞靶向到肿瘤细胞，促使效应细胞显著发挥杀伤作用，达到特异性杀伤作用，杀伤能力更强，为临床治疗b细胞淋巴瘤疾病奠定基础。
24.进一步，双特异性抗体的氨基酸序列可以包括seq id no.10所示的氨基酸序列。所述双特异性抗体的核苷酸序列可以包括seq id no.11所示的核苷酸序列。
25.利用基因工程技术将两种针对肿瘤不同靶标的纳米抗体构建出双特异性抗体用于提升抗肿瘤抗体的活性。单域抗体在构建双特异性抗体时无需考虑抗体重链和轻链之间的错配问题，在构建双特异性抗体时具有优势。通过基因工程技术对sdab进行双特异性抗体的合理设计，构建的双特异性单域抗体具备更强的靶标结合力、更长的血清半衰期、更低的耐药性和更低的严重不良反应，使其在感染、肿瘤及免疫领域的诊断与治疗中具有广阔的应用前景。
26.本发明提供一种核酸，核酸编码上述的单域抗体、多肽、蛋白质、双特异性抗体中的一种或几种的组合。
27.所述核酸可以为脱氧核糖核酸(dna)，也可以为核糖核酸(rna)。
28.例如：本发明提供了一种dna分子，它编码上述的针对cd20胞外区多肽单域抗体的vhh链。所述dna分子的核苷酸序列包括seq id no.9所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种编码上述双特异性抗体的核酸，所述核酸的核苷酸序列包括seq id no.11所示的核苷酸序列。
29.本发明还提供一种核苷酸序列或其组合，所述核苷酸序列或其组合编码包括上述的抗人cd20特异性单域抗体。
30.本发明提供一种载体，包括上述核酸。
31.所述载体可以为表达载体，也可以为克隆载体。载体中可以包括上述dna分子的核苷酸序列。克隆载体上携带有编码的核酸可以实现复制扩增的目的。通过表达载体上表达元件可以实现表达的目的。
32.例如：本发明提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述载体为pet-22b( )。
33.本发明提供一种宿主细胞，包括上述载体。可以表达上述针对cd20的单域重链抗体。例如：本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为含有上述表达载体的大肠杆菌bl21(de3)。
34.本发明提供一种药物或药物组合物，包括上述单域抗体、多肽、蛋白质、双特异性抗体中的一种或几种的组合。
35.本发明提供一种试剂或试剂盒，包括上述单域抗体、多肽、蛋白质、双特异性抗体中的一种或几种的组合。
36.本发明提供上述单域抗体、多肽、蛋白质、双特异性抗体，核酸，载体，宿主细胞，药物、药物组合物、试剂、试剂盒中的一种或几种的组合在(1)、(2)或(3)中的应用；
37.(1)制备检测b细胞淋巴瘤试剂或试剂盒；
38.(2)制备治疗b淋巴细胞系统恶性肿瘤疾病药物或药物组合物；
39.(3)与b淋巴细胞相关疾病药物或药物组合物。
40.例如：本发明提供上述针对cd20胞外区多肽的单域抗体用于制备检测b细胞淋巴瘤试剂中的用途。提供一种抗人cd20和抗cd3双特异性单域抗体，在制备治疗b淋巴细胞系
统恶性肿瘤疾病药物中的更进一步的应用。
41.例如：本发明的双特异性抗体可用于制备非正常表达cd20的b淋巴细胞相关疾病和肿瘤相关疾病的治疗药物，肿瘤相关疾病为cd20抗原阳性的b细胞恶性肿瘤。
附图说明
42.图1为实施例1中pcr扩增得到的vhh基因片段电泳图；
43.图2为实施例3中phage elisa检测cd20特异性重组噬菌体；
44.图3为实施例4中针对cd20的单域重链抗体经过表达，并经镍柱亲和层析纯化后的sds-page电泳图，m：蛋白分子量marker，单位为kda；lane1-3、4-6、7-9：纯化产物；
45.图4为实施例5中vhh-pet-25b-sbp表达、纯化产物western-blot检测结果图，m：蛋白分子量marker，单位为kda；lane 1：cd20蛋白(即为抗cd20单域重链抗体)；
46.图5为实施例6中细胞免疫荧光检测单域抗体与细胞表面cd20蛋白结合结果，a：sdab组细胞在紫外光激发下的荧光图像，b：阴性对照细胞在紫外光激发下的荧光图像；
47.图6为实施例7中重组质粒pet-22b/bsnb的酶切鉴定结果；其中，m.dna marker；1-2.重组质粒pet-22b/bsnb；
48.图7为实施例7中anti-cd20/cd3 bsnb重组抗体经镍亲和层析柱纯化sds-page鉴定结果；其中m：蛋白分子量marker，单位为kda；1：未诱导前细菌破碎粗提液；2：诱导后细菌破碎粗提物；3：破碎后上清；4：破碎后沉淀；5-7：共3步洗脱液洗脱的样品；
49.图8为实施例8中elisa检测anti-cd20/cd3 bsnb与cd20多肽的结合活性结果图；
50.图9为实施例9中流式细胞仪检测anti-cd20/cd3 bsnb与靶细胞的结合情况；
51.图10为实施例10中anti-cd20/cd3 bsnb介导的pbmcs对raji细胞的毒性作用；
52.图11为实施例11中elisa检测anti-cd20/cd3bsnb介导的pbmcs分泌细胞因子hifn-γ的水平。
具体实施方式
53.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
54.术语和缩略语：
55.单域抗体(single-domain antibodies，sdab)；
56.cdr:是英文complementarity determining regions(cdrs)的缩写，是指抗体的抗原互补决定区；
57.双特异性纳米抗体(bispecific nanobody，bsnb)。
58.pet-22b( )、pet-25b-sbp质粒由内蒙古农业大学兽医学院公共卫生教研室保存。pmecs载体由比利时布鲁塞尔自由大学serge muyldermans教授惠赠。上述材料仅可由公众非商业目的重复本发明实施例所记载的实验以证明本实施例记载的效果。
59.e.coli bl21(de3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；raji细胞购自无锡欣润生物科技有限公司；弗氏佐剂、中和缓冲液、fitc标记试剂盒(fitc-antibody conjugation kit)、ni-nta纯化填料购自生工生物工程(上海)股份有限公司；hrp标记的anti-his tag单抗购自武汉三鹰抗体公司；pvdf膜、显色液a液和b液、红细胞裂解液购自北
京索莱宝科技有限公司、t4 dna连接酶购自takara生物试剂公司；1640细胞培养基购自bi、台盼蓝购自天津灏洋华科生物科技有限公司；胎牛血清fbs购自thermofisher scientific；ldh试剂盒(ldh工作液)、裂解液购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；ifn-γ检测elisa试剂盒、生物素化抗体工作液、abc工作液、tmb终止液购自武汉新启迪生物科技有限公司；not i和nco i限制性内切酶购自neb；大肠杆菌e.coli tg1感受态细胞、辅助噬菌体购自ge公司。氨苄西林、卡那霉素、iptg、pbst、多聚赖氨酸、bsa、peg 8000、pbs、三乙胺洗脱缓冲液、tris-hcl、多聚甲醛均购自索莱宝公司；tmb显色液购自promega。
60.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。
61.下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
62.如本文所用，术语“本发明单域抗体”、“本发明的抗cd20单域抗体”、“本发明cd20单域抗体”、“本发明抗cd20特异性重链单域抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于人cd20蛋白的单域抗体。
63.本发明公开了一种抗cd20抗原的单域抗体，公开了其vhh链的框架区fr和互补决定区cdr的氨基酸序列，同时还公布了编码该单域抗体的核苷酸序列以及能够表达该单域抗体的宿主细胞。本发明还公开了一种含有抗cd20的vhh结构域和抗cd3的vhh结构域的双特异性抗体，所述双特异性抗体由两条不同的单域抗体序列融合而成，提供了一种编码所述双特性抗体的核苷酸序列，包括表达核苷酸序列的载体和用所述核苷酸或载体转化的宿主细胞。本发明完整保留了抗cd20抗体和抗cd3抗体的生物学活性，能够识别肿瘤细胞和效应细胞，并将效应细胞靶向到肿瘤细胞，促使效应细胞显著发挥杀伤作用。本发明用于治疗b细胞淋巴瘤药物的研发，同时也提供了一种双特异性抗体的构建方法。
64.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
65.实施例1：针对cd20的单域抗体噬菌体文库的构建
66.(1)5mg固体人cd20胞外区多肽(简称cd20多肽)，序列为kishflkmeslnfirahtpyiniyncepanpseknspstqycysiqs(seq id no.12所示的氨基酸序列)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，将1mg cd20多肽(pbs稀释)与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只健康双峰驼，每两周一次，共免疫4次，刺激b细胞表达抗原特异性的单域抗体；
67.(2)4次免疫结束后，抽取骆驼外周血，分离淋巴细胞并提取总rna；
68.(3)反转录成cdna，并利用巢式pcr扩增vhh，结果如图1所示，从图1中可以看出已成功扩增vhh；
69.(4)经限制性内切酶ncoⅰ和notⅰ进行双酶切，并与相同酶消化的pmecs载体连接，得到连接产物；
70.(5)将连接产物转化至大肠杆菌e.coli tg1感受态细胞构建针对人cd20胞外区多肽的噬菌体抗体库；
71.(6)将抗体库菌液以10倍梯度进行倍比稀释，计算噬菌体抗体库的库容为1.2
×
108，并随机挑取24个菌落作为模板进行pcr检测，鉴定噬菌体抗体库的重组率，结果显示出构建文库的插入率达到了91.7％。
72.实施例2：筛选cd20单域抗体
73.(1)包被人cd20胞外区多肽10μg/ml，100μl/孔至96孔酶标板。
74.4℃过夜；
75.(2)室温静置30min后，弃掉孔内液体，每孔中加入300μl的pbst，每次洗3min，重复以上过程(即用pbst清洗5遍，每次洗后弃掉孔内液体，第5次同样弃掉孔内液体)；
76.(3)在步骤(2)经过处理后的96孔酶标板中，加入待筛选的噬菌体抗体库(即实施例1构建的噬菌体抗体库)，37℃，1h；
77.(4)每孔中加入300μl的pbst，每次洗3min，重复此过程5遍；
78.(5)在上一步基础上继续向每孔加入三乙胺洗脱缓冲液(100mm)100μl，室温孵育10min；然后再向每孔中加入1m tris-hcl 50μl，利用ph为9.7的中和缓冲液进行中和；
79.(6)将洗脱的后重组噬菌体再一次感染e.coli tg1，继续加入辅助噬菌体m13k07，此步骤反复进行3-4轮，逐步得到富集。
80.实施例3：phage elisa筛选cd20特异性噬菌体
81.(1)将人cd20胞外区多肽稀释至2.5μg/ml，每孔100μl至96孔酶标板，4℃过夜；
82.(2)室温静置30min后，弃掉孔内液体，每孔中加入300μl的pbst，每次洗3min，重复以上过程(即用pbst清洗5遍，每次洗后弃掉孔内液体，第5次同样弃掉孔内液体)。加入300μl/孔的3％bsa，37℃，2h；
83.(3)每孔中加入300μl的pbst，每次洗3min，重复此过程5遍；
84.(4)取经过三次筛选洗脱的噬菌体感染的e.coli tg1，分别在2
×
yt-ag固体培养基(在2
×
yt固体培养基的配方上添加氨苄西林和葡萄糖，氨苄西林的浓度为100μg/ml，葡萄糖浓度为20％)上用涂布器涂均匀，37℃培养过夜。随机挑取92个克隆接种于400μl的2
×
yt-ag液体培养基，220rpm，37℃培养过夜；
85.(5)取50μl加入含有400μl 2
×
yt-ag m13k07(在2
×
yt-ag液体培养基中加入噬菌体m13k07，噬菌体m13k07的数目一般为大肠杆菌数量的20倍)的液体中，37℃，250rpm，2h；
86.(6)14000rpm，25℃，离心5min。将沉淀用400μl的2
×
yt-ak液体(在2
×
yt液体培养基的配方上添加氨苄西林和卡那霉素，氨苄西林的浓度为100μg/ml，卡那霉素浓度为100μg/ml)重悬，37℃，250rpm培养过夜；
87.(7)14000rpm，4℃，离心5min，取上清，与20％peg8000充分混匀，4℃静置30min。4℃，10000rpm，离心20min，离心后弃上清液，然后取100μl pbs重悬沉淀；
88.(8)50μl/孔重悬液加入到96孔酶标板中，本步骤设置阴性对照和空白对照，分别为辅助噬菌体m13k07和pbs，室温孵育2h；
89.(9)弃孔中液体，每孔加入100μl tmb，室温避光反应15-30min，每孔加入50μl 2m h2so4终止反应，酶标仪测od450nm；
90.(10)当样品孔od450nm值大于阴性对照孔od值2.1倍以上时，判为阳性；否则，判为阴性；phage elisa检测cd20特异性重组噬菌体的实验结果如图2所示；
91.(11)将阳性克隆接种至5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体中以便提取质粒并进行测序；
92.(12)根据序列比对软件vector nti分析各个克隆株的基因序列，把cdr1，cdr2，cdr3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，随机挑选的克隆中有54株克隆远高于阳性判定值0.220，并从中选取1株阳性克隆，命名为sdab11。该克隆产
生的抗体可以称作cd20单域抗体或抗cd20单域重链抗体，其核苷酸序列为seq id no.9所示的核苷酸序列，其氨基酸序列为seq id no.8所示的氨基酸序列，包括vhh，fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。其中，fr1的氨基酸序列为seq id no.1所示的氨基酸序列，cdr1的氨基酸序列为seq id no.5所示的氨基酸序列，fr2的氨基酸序列为seq id no.2所示的氨基酸序列，cdr2的氨基酸序列为seq id no.6所示的氨基酸序列，fr3的氨基酸序列为seq id no.3所示的氨基酸序列，cdr3的氨基酸序列为seq id no.7所示的氨基酸序列，fr4的氨基酸序列为seq id no.4所示的氨基酸序列。
93.实施例4：抗cd20单域重链抗体在宿主大肠杆菌中表达、纯化
94.(1)取phage elisa阳性克隆(即实施例3获得的克隆sdab11)菌液50μl加入到5ml在2
×
yt液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜，对培养后菌液进行质粒提取并基因测序；
95.(2)经序列分析后，对正确的克隆质粒经not i和nco i限制性内切酶酶切，并与经过相同酶切的pet-25b-sbp质粒进行连接，获得vhh-pet-25b-sbp质粒，将vhh-pet-25b-sbp质粒转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，37℃培养过夜；
96.(3)接种1ml的过夜菌种至100ml lb培养基中，37℃培养到od600nm值达到0.4-0.6时，加入终浓度1mm iptg，30℃培养过夜；
97.(4)次日，离心收集菌体，菌液经超声波破碎，收集上清和沉淀；
98.(5)利用sds-page凝胶电泳进行分析，使用ni-nta纯化填料对破碎上清进行纯化，收集纯化后的重组单域抗体(即为抗cd20单域重链抗体)，如图3结果所示。
99.实施例5：western-blot鉴定重组单域抗体
100.(1)将人cd20胞外区多肽进行sds-page凝胶电泳分离；
101.(2)电泳结束后将蛋白转移至pvdf膜，将pvdf膜放入3％bsa中，4℃过夜封闭；
102.(3)次日将膜取出，用5ml的pbst洗涤4次，每次10min；
103.(4)加入用pbs稀释至终浓度为1μg/ml的重组单域抗体(采用实施例3的方法制备)作为一抗，37℃，孵育1h。将膜取出，用5ml的pbst洗涤4次，每次10min；
104.(5)加入用pbs 1:10000稀释后的hrp标记的anti-his tag单抗，作为二抗，37℃，孵育1h。将膜取出，用5ml的pbst洗涤4次，每次10min；
105.(6)将显色液a液和b液各取500μl混匀(避光操作)，滴至pvdf膜上，将膜放入western-blot成像仪中，查看结果，进行拍照记录，结果如图4所示，从图4中可以发现本发明制备的抗cd20单域重链抗体可以与cd20胞外区多肽特异性结合。
106.实施例6：细胞免疫荧光检测单域抗体与细胞表面cd20蛋白结合
107.(1)提前准备无水乙醇，将盖玻片浸泡5min，然后夹出，待其自然晾干后，放入6孔细胞培养板中。
108.(2)在6孔板中添加多聚赖氨酸(0.01mg/ml)，10min后将6孔板中的液体吸出弃掉，将其在超净台中晾干。
109.(3)将传代好的raji细胞加入6孔细胞培养板中，再将细胞培养板放入37℃，5％二氧化碳恒温箱中进行培养。细胞生长至覆盖盖玻片，用pbs冲洗3min/次，重复3次。
110.(4)将4％的多聚甲醛加入细胞培养板中，孵育20min，用pbs冲洗3min/次，重复3次。
111.(5)将5％bsa加入细胞培养板中，封闭1h。设置实验组和阴性对照组，实验组加入
sdab作为一抗(100μl/孔，浓度为10μg/ml)，阴性对照组加入pbs(100μl/孔),4℃过夜孵育。
112.(6)用pbst冲洗5次，每次3min。向每孔中加入100μl的二抗(488-conjugated 6*his,his-tag mouse monoclonal antibody，避光操作)，室温1h。
113.(7)用pbst冲洗5次，每次3min。将样品置于荧光倒置显微镜下查看结果并拍照保存，结果如图5所示，图5中，阴性对照细胞在紫外光激发下的无荧光图像显示，而实验组sdab组细胞在紫外光激发下可以显示荧光图像，说明本发明制备的抗cd20单域重链抗体可以与细胞表面cd20蛋白结合。
114.实施例7：制备抗cd20和cd3双特异性单域抗体
115.本组实验所需的anti-cd20 sdab通过实施例1-3噬菌体抗体库技术制备，并通过实施例3测序获得相应的基因序列及氨基酸序列；anti-cd3 sdab的核酸序列可以为seq id no.13所示的核苷酸序列。
116.(1)利用snapgene viewer软件将抗cd20和cd3单域抗体基因片段以连接肽(linker)连接，构建成cd20 sdab-linker-cd3 sdab序列,将其命名为bsnb，核苷酸序列如seq id no.11所示，该基因的抗体氨基酸序列如seq id no.10所示；
117.(2)将构建好的bsnb基因序列(cd20 sdab-linker-cd3 sdab序列)送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因合成。合成后的基因两端保留not i和nco i两个限制性内切酶位点，将合成的基因与pet-22b( )经限制性内切酶not i和nco i进行双酶切；
118.(3)t4 dna连接酶过夜连接，获得重组质粒pet-22b/bsnb，经过双酶切鉴定，结果如图6所示，从酶切结果初步可以看出已成功制备重组质粒pet-22b/bsnb；
119.(4)将重组质粒pet-22b/bsnb转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞，利用终浓度1mm iptg诱导表达6h，超声破碎后，sds-page分析表达情况，结果如图7所示(m：蛋白分子量marker，单位为kda；1：未诱导前细菌破碎粗提液；2：诱导后细菌破碎粗提物；3：破碎后上清；4：破碎后沉淀；5-7：共3步洗脱液洗脱的样品)；
120.(5)在变性条件下经ni-nta琼脂糖纯化树脂纯化包涵体中的目的蛋白、透析复性获得具有生物功能的双抗蛋白，将其命名为anti-cd20/cd3 bsnb。
121.实施例8：检测纯化后的anti-cd20/cd3 bsnb与cd20抗原的结合活性
122.(1)将cd20胞外区多肽稀释至终浓度为2.5μg/ml，100μl/孔进行包被至96孔酶标板，4℃过夜；
123.(2)在室温保持静置30min，弃孔里液体，加300μl pbst，3min/次，重复此过程5遍；
124.(3)然后再加入3％bsa封闭液300μl，37℃，孵育2h，pbst清洗5遍；
125.(4)将纯化后的anti-cd20/cd3 bsnb(采用实施例7方法制备)从30μg/ml梯度稀释至5μg/ml作为一抗，每孔100μl。设置阴性对照(negative control)和空白对照(pbs)，阴性对照(negative control)为pet-22b( )空载体转化后的大肠杆菌破碎液(1:1000),空白对照为pbs。37℃，孵育1h，pbst清洗5遍；
126.(5)加入hrp标记的anti-his tag(1:10000)，100μl/孔，37℃，1h，pbst清洗5遍；
127.(6)再加入tmb 100μl/孔，避光显色10min，加入终止液50μl/孔终止反应。酶标仪od450nm读数，进行结果判定(实验组od450nm值为阴性对照平均值的2.1倍时即判定为阳性，否则判定为阴性)。结果如8所示，从图8中可以看出，阴性对照(negative control)和空白对照(pbs)检测结果均为阴性，实验组anti-cd20/cd3 bsnb可以与cd20抗原的结合，且随
着anti-cd20/cd3 bsnb浓度升高，anti-cd20/cd3 bsnb与cd20抗原的结合能力越高。
128.实施例9：双特异抗体分子与表达cd20和cd3细胞的结合情况
129.本发明采用淋巴瘤细胞系raji作为cd20阳性的细胞；采用新鲜分离的健康人淋巴细胞作为cd3阳性细胞。
130.依据fitc-antibody conjugation kit说明书将fitc溶于dmso，并加入到anti-cd20/cd3 bsnb(1.2mg/ml)(采用实施例7方法制备)中，放在水平摇床上，冰浴避光孵育1h，吸取抗体fitc结合物，并将其放置在纯化柱中填料的表面上，以3000rpm离心2min，收集标记好的抗体，4℃下备用。
131.在超净台中，将健康志愿者的外周血，用生理盐水稀释，然后缓慢加入到等量的人淋巴细胞分离液的上方；离心条件：800g，室温，加速度3，减速度0，离心30min；离心完成后，吸取中间层(白色)单个核细胞到新的15ml离心管中，并加入pbs，混匀；1500rpm，离心10min；去上清，如有红细胞，则加入两倍起始血液体积的红细胞裂解液(例如：如果起始分离的新鲜血液为1ml，则加入2ml的红细胞裂解液。红细胞裂解液购自索莱宝生物试剂公司)，作用3-5min，再加满pbs混匀，1200rpm，离心10min；去上清，加入10ml pbs，混匀，1000rpm，离心10min；用含有10％胎牛血清fbs的1640细胞培养基重悬细胞，接种于25cm2培养瓶中，台盼蓝染色计数并记录人外周血单核细胞(pbmcs)总量，备用。
132.利用流式细胞仪检测双特异性抗体与raji细胞和pbmcs细胞的结合活性。
133.(1)将raji细胞和pbmcs细胞用含1％bsa的1
×
pbs清洗2次，分至各组ep管中备用，保证每管细胞总数为1
×
106个；
134.(2)向raji细胞、pbmcs细胞、raji细胞与pbmcs细胞混合组加入fitc-anti-cd20/cd3 bsnb至终浓度为100μg/ml，设置阴性对照组,只在阴性对照组中加入100μl pbs，4℃旋转冰浴孵育60min；
135.(3)用含1％bsa的pbs清洗细胞3次；然后用200μl pbs重悬细胞；
136.(4)将细胞上样至bd流式细胞分析仪进行检测，结果如图9所示，从图9中可以看出纯化的anti-cd20/cd3 bsnb与raji细胞表面cd20分子和pbmcs细胞表面cd3分子可以特异性结合。
137.实施例10：anti-cd20/cd3 bsnb介导pbmcs杀伤肿瘤细胞
138.采用ldh试剂盒测定anti-cd20/cd3 bsnb的细胞毒作用，靶细胞为raji，效应细胞为pbmcs，anti-cd20/cd3 bsnb浓度为0μg/ml至40μg/ml；
139.(1)将raji细胞用1640培养基稀释至每孔1
×
104个细胞铺至perkinelmer cell carrier中，每组三个复孔，培养12h；
140.(2)按效：靶＝5：1和效：靶＝10：1加入pbmcs，再分别加入anti-cd20/cd3bsnb至终浓度为(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0μg/ml)，分别设立空白孔(即100μl 1640培养基)、样本对照孔(即：50μl raji细胞 50μl pbmcs细胞)、最大酶活性对照孔(即：50μl raji细胞 50μl pbmcs细胞 10μl裂解液)，37℃培养24h；
141.(3)孵育结束前1h在靶细胞最大释放孔中加入裂解液10μl充分混匀，1200r/min离心5min，取上清液，加到标记好的新96孔板中；
142.(4)每孔加ldh工作液50μl，混匀置于室温避光孵育30min；
143.(5)用酶标仪测定od490 nm值，并计算raji细胞的死亡率(killing rate)[死亡率
(％)＝(样本测定孔od值－空白孔od值－样本对照孔od值－空白孔od值)/(最大酶活对照孔od值－空白孔od值)
×
100％]。结果如图10所示，从图10中可以看出，anti-cd20/cd3 bsnb可以介导pbmcs杀伤肿瘤细胞，随着anti-cd20/cd3 bsnb浓度增加，anti-cd20/cd3 bsnb介导pbmcs杀伤肿瘤细胞能力增加。
[0144]
实施例11：elisa检测anti-cd20/cd3 bsnb对pbmcs细胞分泌细胞因子的影响
[0145]
(1)将raji细胞铺于perkinelmer cell carrier 96孔板，每孔5000个，37℃孵育12h；
[0146]
(2)按5:1和10:1的效靶比加入pbmcs细胞及分别加入终浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml的anti-cd20/cd3 bsnb，不加抗体的孔作为对照组control。每组设置三个复孔，培养24h；
[0147]
(3)吸取共孵育后细胞上清用elisa试剂盒检测细胞因子ifn-γ的分泌情况；
[0148]
(4)加入准备好的样品和标准品，样品是指步骤(3)中吸取的各孔中的细胞上清液，标准品是elisa试剂盒带的人ifn-γ，是用于建立标准曲线，以便于试验后计算样品中ifn-γ中含量。37℃反应90min；
[0149]
(5)洗板2次，加入生物素化抗体工作液，37℃反应60min；
[0150]
(6)洗板3次，加入abc工作液，37℃反应30min；
[0151]
(7)洗板5次，加入tmb显色液，37℃反应；
[0152]
(8)加入tmb终止液；
[0153]
(9)10min内酶标仪测定od450nm值；
[0154]
(10)绘制标准曲线，并计算标本待测因子ifn-γ含量。实验结果如图11所示，在不同效靶比下，本发明的anti-cd20/cd3 bsnb介导的t细胞分泌的ifn-γ含量与对照组有显著差异。
[0155]
经上述实施例证明，本发明的双特异性抗体在保持原有抗cd20抗体和抗cd3抗体生物学活性的同时，通过靶向免疫效应细胞到肿瘤细胞，增强了免疫效应细胞特异性杀伤肿瘤细胞的效果。本发明的双特异性抗体可用于制备非正常表达cd20的b淋巴细胞相关疾病和肿瘤相关疾病的治疗药物，肿瘤相关疾病为cd20抗原阳性的b细胞恶性肿瘤。
[0156]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明不局限于上述最佳实施方式，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。