一种CD34+干细胞活性蛋白的制作方法与流程

30min；
9.步骤(3)：加入洗脱液，去除消化后的组织块进行离心，分离出未提纯初代脐带间充质干细胞；
10.步骤(4)：将获得的初代脐带间充质干细胞按1.0
×
104/cm2～1.0
×
105/cm2接种于生长面积为55cm2的培养容器，培养体系为含有10w/v％胎牛血清的 lg-dmem培养基；培养基中加入细胞因子组合物和烟酰胺类物质，有效增加 cd34 干细胞数量，提高cd34 /cd38细胞比例。烟酰胺类物质选自于烟酰胺、苯甲酰胺、烟酸之一种或几种，烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为1.0mm～ 10mm。培养体系中还外源性添加多种细胞因子，包括：细胞集落刺激因子 g-csf20ng/ml～80ng/ml，红细胞生成素2ng/ml～20ng/ml，促血小板生成素 2ng/ml～20ng/ml，fms样的酪氨酸激酶3配体flt3配体50ng/ml～300ng/ml，白介素-6il-610ng/ml～100ng/ml，白介素-3il-320ng/ml～200ng/ml；
11.步骤(5)：待底层贴壁细胞融合80％以上后，利用含有胰蛋白酶和edta
·
4na 的trypsin-edta溶液消化分散细胞，用免疫磁珠分选法，细胞经过流式细胞仪分选，选取cd34 干细胞；
12.步骤(6)：cd34 干细胞按1.0
×
104/cm2～3.0
×
104/cm2的种植密度接种于生长面积148cm2培养容器内进行传代，重复所述步骤(4)和步骤(5)的传代步骤，经3-6次传代直至获得第3-6代细胞；收集每次的培养液离心，过滤收集 30-160微米外泌体颗粒，制备cd34 脐带间充质干细胞外泌体冻干粉。质谱分析检测cd34 脐带间充质干细胞外泌体活性蛋白含量。
13.可选地，在步骤(6)中，第六代细胞数量级达到108以上终止培养，制备 cd34 脐带间充质干细胞冻干粉。
14.可选地，还包括以下步骤：
15.步骤(7)：质谱分析检测cd34 脐带间充质干细胞活性蛋白含量，质谱分析检测cd34 脐带间充质干细胞外泌体活性蛋白含量，通过体外皮肤细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞培养，加入不同浓度cd34 脐带间充质干细胞活性蛋白，检测其体外细胞活性；
16.步骤(8)：cd34 干细胞活性蛋白cdna分析，合成人cd34 干细胞活性蛋白cdna，酶切，构建cd34 干细胞活性蛋白质粒载体，利用食用性酵母菌大量表达产生高活性的cd34 干细胞活性蛋白，检测cd34 干细胞活性蛋白的含量和体内外细胞活性；
17.步骤(9)：比较两种来源的cd34 干细胞活性蛋白的含量和体内外细胞活性。
18.本发明的cd34 干细胞活性蛋白的制作方法具有以下优点：
19.采用本技术中方法能够快速、高效的提取出cd34 干细胞活性蛋白，制备工艺、设备及操作简便，按照此方法，原料易得，具有广泛的应用前景；而且采用cd34 干细胞活性蛋白作为原料还能制备再生修复抗衰精华液、化妆品、面膜、喷剂、水光针、微针产品、抗衰产品、营养保健品等物品。
附图说明
20.图1是食用性酵母菌蛋白表达系统的示意图。
21.图2是cd34 干细胞活性蛋白酵母质粒载体的示意图。
具体实施方式
22.下面结合附图对本发明做进一步说明。
23.如图1-图2所示，一种cd34 干细胞活性蛋白的制作方法，包括以下步骤：
24.步骤(1)：体外规模化培养脐带间充质干细胞，使用缓冲液清洗大部分脐带的残留血液，所述的缓冲液含有青霉素10万单位/l和链霉素100mg/l；
25.步骤(2)：将脐带制成1-3mm大小的组织碎块，用0.2w/v％胶原酶ii37℃消化20-30min；
26.步骤(3)：加入洗脱液，去除消化后的组织块进行离心，分离出未提纯初代脐带间充质干细胞；
27.步骤(4)：将获得的初代脐带间充质干细胞按1.0
×
104/cm2～1.0
×
105/cm2接种于生长面积为55cm2的培养容器，培养体系为含有10w/v％胎牛血清的 lg-dmem培养基；培养基中加入细胞因子组合物和烟酰胺类物质，有效增加 cd34 干细胞数量，提高cd34 /cd38细胞比例。烟酰胺类物质选自于烟酰胺、苯甲酰胺、烟酸之一种或几种，烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为1.0mm～ 10mm。培养体系中还外源性添加多种细胞因子，包括：细胞集落刺激因子 g-csf20ng/ml～80ng/ml，红细胞生成素2ng/ml～20ng/ml，促血小板生成素 2ng/ml～20ng/ml，fms样的酪氨酸激酶3配体flt3配体50ng/ml～300ng/ml，白介素-6il-610ng/ml～100ng/ml，白介素-3il-320ng/ml～200ng/ml；
28.步骤(5)：待底层贴壁细胞融合80％以上后，利用含有胰蛋白酶和edta
·
4na 的trypsin-edta溶液消化分散细胞，用免疫磁珠分选法，细胞经过流式细胞仪分选，选取cd34 干细胞；
29.步骤(6)：cd34 干细胞按1.0
×
104/cm2～3.0
×
104/cm2的种植密度接种于生长面积148cm2培养容器内进行传代，重复所述步骤(4)和步骤(5)的传代步骤，经3-6次传代直至获得第3-6代细胞；收集每次的培养液离心，过滤收集 30-160微米外泌体颗粒，制备cd34 脐带间充质干细胞外泌体冻干粉。质谱分析检测cd34 脐带间充质干细胞外泌体活性蛋白含量，第六代细胞数量级达到 108以上终止培养，制备cd34 脐带间充质干细胞冻干粉；
30.步骤(7)：质谱分析检测cd34 脐带间充质干细胞活性蛋白含量，质谱分析检测cd34 脐带间充质干细胞外泌体活性蛋白含量，通过体外皮肤细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞培养，加入不同浓度cd34 脐带间充质干细胞活性蛋白，检测其体外细胞活性；
31.步骤(8)：cd34 干细胞活性蛋白cdna分析，合成人cd34 干细胞活性蛋白cdna，酶切，构建cd34 干细胞活性蛋白质粒载体，利用食用性酵母菌大量表达产生高活性的cd34 干细胞活性蛋白，检测cd34 干细胞活性蛋白的含量和体内外细胞活性；
32.步骤(9)：比较两种来源的cd34 干细胞活性蛋白的含量和体内外细胞活性。
33.cd34 干细胞活性蛋白可激活其他干细胞，修复损伤老化细胞，cd34分子是高度糖基化的i型跨膜糖蛋白，选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干/ 祖细胞表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失。已有愈来愈多的研究结果表明 cd34分子在介导细胞间黏附作用中发挥着重要作用。cd34分子于1984年被美国科学家civin发现，属于钙黏蛋白家族，其结构包括胞外区、跨膜区、胞浆区3 部分。cd34分子是钙黏蛋白家族成员，是相对分子量为115000～120000的单体表面蛋白，碳链的主架相对分子量一般仅40000，与所知的其他蛋白没有序列同源性。cd34分子结构包括胞外区、跨膜区、胞浆区3部分。胞外区是cd34分子与其
他分子间相互作用的主要部位，大约由278个氨基酸残基组成，n末端部分糖基化程度很高，有大量链糖连接位点，末端145个氨基酸残基中丝氨酸和苏氨酸的含量》35％，为唾液酸化位点集中区，丰富的链糖能保护cd34分子免受某些蛋白酶水解，以维持其结构的稳定，并可提供特异性识别位点。跨膜区含有22 个疏水氨基酸残基，是1个跨膜的螺旋结构，具有i型跨膜蛋白的特征。胞浆区由73个疏水氨基酸残基组成。cd34分子结构清晰，各个结构区功能清楚，主架相对分子量不大，利用食用性酵母菌大量表达产生cd34 干细胞活性蛋白比较容易。
34.酵母表达系统(yeastproteinexpresstionsystem)兼有原核和高等真核系统的优点，培养条件简单、生长速度快、表达水平高、操作简便、成本低廉，蛋白翻译后能进行正确加工、修饰，合理的空间折叠，使得蛋白的可溶性得到提高，是理想的重组真核蛋白生产制备工具。酵母表达系统为蛋白的生理活性研究提供了强有力的工具。
35.利用食用性酵母菌大量表达产生cd34 干细胞活性蛋白，首先，cd34 干细胞活性蛋白cdna分析，合成人cd34 干细胞活性蛋白cdna，酶切，构建 cd34 干细胞活性蛋白质粒载体，采用安必奇公司的密码子优化技术进行密码子优化，cd34 干细胞活性蛋白cdna基因合成、载体构建、转录、mrna翻译、翻译后修饰等环节。重组酵母表达质粒构建、目的基因的亚克隆和重组质粒电转化进入表达菌株。鉴定筛选高表达菌株，通过pcr方法确定阳性转化株， sds-page电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况，并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达。蛋白表达分析鉴定。利用定性或者定量分析的方法进行蛋白质鉴定。蛋白表达条件的优化。挑选阳性克隆进行常规表达筛选，并对其中表达最好的菌株优化表达条件。对挑选出来的单克隆菌株，优化培养及诱导条件(培养基，菌体密度，甲醇浓度，诱导时间等)，提高目标蛋白的表达量。利用食用性酵母菌大量表达产生高活性的cd34 干细胞活性蛋白，检测cd34 干细胞活性蛋白的含量和体内外细胞活性。检测cd34 干细胞活性蛋白的功能和观察其对各组织细胞的作用；应用cd34 干细胞活性蛋白，观察自体脂肪干细胞的作用和存活率，观察外在抗衰和面部年轻化的作用。利用食用性酵母菌大量表达产生高活性的cd34 干细胞活性蛋白；cd34 干细胞活性蛋白，直接透皮吸收或皮下注射，避开肝脏首过效应，可对全身机体细胞进行修复，促进再生。
36.采用cd34 干细胞活性蛋白作为原料制备再生修复抗衰精华液、化妆品、面膜、喷剂、水光针、微针产品、抗衰产品、营养保健品、药品等，在保证效果的前提下，制成了方便易用的成品制剂；制备工艺、设备及操作简便，按照此方法，原料易得，具有广泛的应用前景。经过500名自愿者的临床观察，结果显示， cd34 干细胞活性蛋白、cd34 脐带间充质干细胞冻干粉和cd34 脐带间充质干细胞外泌体冻干粉的作用效果明显，对皮肤癍疤斗敏坑衰都有明显的改善。制成缓释胶囊保健品长期使用观察，未出现食欲不振、精神萎靡等不良症状现象，且无毒无副作用。通过调查表统计，口感适宜，安全无副作用。
37.以上所描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。