超高压联合热加工破坏大豆球蛋白A2肽链的抗原区域及定位方法

超高压联合热加工破坏大豆球蛋白a2肽链的抗原区域及定位方法
技术领域
1.本发明涉及超高压联合热加工破坏大豆球蛋白a2肽链的抗原区域及定位方法，涉及食品加工、分子生物学、免疫学及生物信息学领域。


背景技术：

2.过敏性疾病是一种严重影响全球健康的疾病类型，食物过敏是其中的一种类型。反应的程度可以从轻微的局部症状到死亡，避免接触过敏原是唯一有效和安全的方法。患者和他们的家人被迫改变他们的饮食习惯和社会活动，这严重影响了他们的生活质量。大豆富含蛋白质，是优质蛋白质的主要来源之一，大豆中油脂含量是仅次于蛋白质的物质，其中富含优质不饱和脂肪酸，对人体心血管的健康有极大的好处。在食品界应用广泛，已被广泛用于生产面食、烘焙食品、儿童食品、健康食品等。然而，作为联合国粮农组织认可的八大食物过敏原之一，已知86％的大豆过敏是由大豆球蛋白和β-大豆球蛋白引起的。大豆球蛋白是大豆的主要储存蛋白，约占大豆种子中总蛋白的40％，其分子量为300-380kda，由五个不同的亚基组成，每个亚基由一个酸性链a(分子量为35-43kda)和一个碱性链b(分子量为20kda)通过二硫键连接，这5个亚基分别是g1(a1abb，53.6kda)、g2(a2b1a，52.4kda)、g3(a1bb2，52.2kda)、g4(a5a4b3，61.2kda)和g5(3b4，55.4kda)。大豆球蛋白的5个亚基都具有致敏性，其中酸性链的致敏性大于碱性链。分析大豆过敏原的致敏表位，对于正确指导安全食品的生产，预防大豆过敏性疾病的发生具有重要意义。
3.表位是过敏反应的物质基础，其定位技术主要有表位预测和表位定位两种，表位预测主要是依据生物学信息软件对过敏原氨基酸序列及结构进行分析，综合几种不同软件的预测，得出可能成为致敏表位的位点，这种预测方法与实际结果也许不同。b细胞抗原表位由于它独特的识别方式使得它在成为主要的抗原类型，在食品安全领域成为免疫机制和诊断的重点。随着生物技术和信息学的快速发展，对于抗原表位的预测和鉴定方法也越来越完善，避免了复杂繁冗的实验步骤和盲目性。噬菌体展示技术可用于将蛋白质目标基因与噬菌体互补dna连接，并在噬菌体表面表达具有相对独立空间结构和生物活性的蛋白质。噬菌体是微生物群体的重要组成部分，它没有完整的细胞结构，对宿主有严格的特异性。t7噬菌体是一种小型的烈性噬菌体，能够表达不同分子量的蛋白，能够侵染大肠杆菌，其外壳蛋白由10a(344aa)和10b(397aa)组成，分子量分别为37.8kda和43.7kda。因此，此类技术的应用可以进一步提高对过敏机制的认识。
4.随着噬菌体技术的不断发展和完善，该技术在医药、食品、农业领域得到广泛的应用，包括抗生素分析的应用，生物毒素的应用，农兽药小分子的应用。到目前为止，应用噬菌体展示技术对大豆过敏原中的大豆球蛋白a2肽链抗原表位定位的研究还未见报道，特别是定位经超高压联合热加工处理破坏的过敏原表位更未见相关文献。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供超高压联合热加工破坏大豆球蛋白a2肽链的抗原区域及定位方法，不仅能为食品工业加工方法提供依据﹑发展出快速检测食品脱敏有效的应用产品，也可以指导含大豆球蛋白加工类产品的安全生产，从而保障大豆球蛋白过敏人群的安全。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.超高压联合热加工破坏大豆球蛋白a2肽链的抗原区域的氨基酸序列，所述抗原区域的氨基酸序列如seq id no.17所示。
8.所述抗原区域用t7噬菌体展示。
9.超高压联合热加工破坏大豆球蛋白a2肽链的抗原区域的定位方法，包括以下步骤：
10.(1)对大豆球蛋白进行超高压联合热加工处理，并将处理后的大豆球蛋白加入到大豆球蛋白多克隆抗体中，制得超高压联合热加工处理破坏的抗原表位特异性抗体；
11.(2)根据蛋白质三级结构及b细胞构象表位预测位置，将a2肽链的氨基酸序列分为3段，氨基酸序列如seq id no.1-seq id no.3所示，设计a2肽链及其重叠分段的蛋白；
12.(3)以噬菌体展示技术研究超高压联合热加工破坏a2肽链蛋白的抗原区域，在噬菌体表面呈现a2肽链及其重叠分段的蛋白；
13.(4)利用间接竞争酶联免疫法，对超高压联合热加工处理导致a2肽链蛋白抗原性降低的区域进行精确定位，得到超高压联合热加工处理破坏最显著片段的氨基酸序列如seq id no.17所示。
14.所述超高压联合热加工处理的具体方法为：将浓度为10mg/ml的大豆球蛋白，置于无菌均质袋内，封口抽真空，将封闭好的均质袋置于超高压处理装置的处理腔内，处理温度为23℃；开始升压，升压速率为250mpa/min，当压强升至400mpa，保压15min，再卸压，卸压速率为300mpa/min；随后在130℃加热20min。
15.所述大豆球蛋白多克隆抗体的具体制备方法为：用纯化后的大豆球蛋白免疫新西兰大白兔，制备大豆球蛋白多克隆抗体。
16.所述大豆球蛋白的纯化方法为：将4ml大豆球蛋白血清与等量pbs溶液混合，缓慢加入4ml饱和硫酸铵溶液，使混合液饱和度达到50％；将混合液置于4℃冰箱中过夜，使血清中的免疫球蛋白充分沉淀，4℃、10000r/min离心30min后，取出沉淀；将沉淀用4ml pbs溶液重新溶解，加入2ml饱和硫酸铵溶液使饱和度为33％，在4℃离心30min后，取出沉淀；将沉淀重新溶解在2ml pbs溶液中，然后放入预处理过的透析袋中，4℃用pbs透析3天，每6h更换一次透析液，透析后置于-20℃保存。
17.所述间接竞争酶联免疫法的具体方法为：
18.用cbs缓冲液将步骤(3)所得噬菌体蛋白稀释成50μg/ml包被于96孔板，每孔100μl，密封后4℃过夜，次日甩干孔内液体，加入150μl pbst缓冲液洗板，静置5min后拍干，重复清洗3次；用质量浓度为5％的bsa缓冲液于37℃封闭90min，用pbst缓冲液洗3次，每次5min；
19.每孔加入用pbs稀释1600倍步骤(1)所得特异性抗体100μl，37℃孵育1h，洗板；每孔加入用封闭液稀释5000倍的羊抗兔酶标二抗100μl，37℃孵育1h后，洗板；每孔加入100μl tmb单组分显色液，37℃显色15min；每孔加入50μl 2mol/l h2so4终止反应；在450nm下测定
od值。
20.本发明有益效果：
21.本发明利用一系列生物信息学软件并参照pdb数据库已解析的大豆球蛋白三维晶体结构，以噬菌体展示技术研究加工破坏大豆球蛋白a2肽链蛋白的抗原区域，通过在噬菌体表面呈现抗原区域的蛋白，通过对a2亚基进行噬菌体展示的两轮筛选，找到a2肽链中的抗原优势肽段，探明了超高压联合热加工降低大豆球蛋白的致敏性机理，对超高压联合热加工处理方法导致大豆球蛋白a2肽链蛋白抗原性降低的区域进行精确定位。
22.本发明为食品工业提供加工方法筛选的理论依据，也可以进一步开发出快速检测加工食品脱敏效果的应用产品。
附图说明
23.图1大豆球蛋白a2基因及其重叠分段的扩增和鉴定结果图；
24.其中，a为大豆球蛋白a2基因及其重叠分段的pcr扩增结果图；
25.b为大豆球蛋白a2基因及其重叠分段的重组质粒的pcr鉴定结果图；
26.c为大豆球蛋白a2基因及其重叠分段的重组质粒的酶切鉴定结果图；
27.d为大豆球蛋白a2基因及其重叠分段的重组噬菌体的pcr鉴定结果图；
28.m：dna marker；a2为a2基因全长；1～3为a2基因片段1、2、3。
29.图2蓝白斑筛选；
30.其中，深黑色的斑点：载体与基因连接失败；白色斑点：载体与基因连接成功。
31.图3重组噬菌体表面形成的噬菌斑；
32.其中，黑色的斑点为噬菌斑。
33.图4大豆球蛋白片段3及其重叠分段的重组噬菌体的扩增和鉴定结果；
34.其中，a为大豆球蛋白片段3及其重叠分段的pcr扩增结果图；
35.b为大豆球蛋白片段3及其重叠分段的重组质粒的pcr鉴定结果图；
36.c为大豆球蛋白片段3及其重叠分段的重组质粒的酶切鉴定结果图；
37.d为大豆球蛋白片段3及其重叠分段的重组噬菌体的pcr鉴定结果图；
38.m：dna marker；3为片段3全长；a～c为片段3的片段a、b、c。
39.图5a2全长及其重叠分段的重组噬菌体表达蛋白的elisa鉴定结果图。
40.其中，a、b、c、d表示在p《0.05水平上的差异显著性；a2为a2基因全长；1～3为a2基因片段1、2、3。
41.图6片段3及其重叠分段的重组噬菌体表达蛋白elisa鉴定结果图。
42.其中，a、b、c表示在p《0.05水平上的差异显著性；3为片段3全长；a～c为片段3的片段a、b、c。
具体实施方式
43.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
44.实施例1、大豆球蛋白a2肽链基因重叠分段克隆
45.1、a2及其重叠分段基因多克隆载体的构建
46.通过ncbi genbank数据库检索到大豆球蛋白a2肽链(gene id:547900)的氨基酸
序列。登录pdb数据库检索a2肽链的同源蛋白质，作为三级结构的预测模板。登录swiss-model同源建模服务器，对a2肽链的三级结构进行预测。根据a2肽链的三级结构模型，在discotope2.0网络服务器中预测其构象表位。a2肽链overlapping分段设计如下：
47.第1段：1～160aa(1～480bp)；
48.lreqaqqnecqiqklnalkpdnrieseggfietwnpnnkpfqcagvalsrctlnrnalrrpsytngpqeiyiqqgngifgmifpgcpstyqepqesqqrgrsqrpqdrhqkvhrfregdliavptgvawwmynnedtpvvavsiidtnslenqldqmprr(seq id no.1)
49.第2段：115～246aa(343～738bp)；
50.fregdliavptgvawwmynnedtpvvavsiidtnslenqldqmprrfylagnqeqeflkyqqqqqggsqsqkgkqqeeenegsnilsgfapeflkeafgvnmqivrnlqgeneeedsgaivtvkgglrvtap(seq id no.2)
51.第3段：201～278aa(601～834bp)
52.sgfapeflkeafgvnmqivrnlqgeneeedsgaivtvkgglrvtapamrkpqqeeddddeeeqpqcvetdkgcqrqsk(seq id no.3)
53.相邻片段重叠约135个碱基。
54.a2全长共有278个氨基酸，其中第206、207个氨基酸分别为谷氨酸和苯丙氨酸，其序列gaattc与ecorⅰ的酶切位点相同，因此将谷氨酸(gaa)中的最后一个碱基a换成g，不改变氨基酸的序列。
55.使用primer 5软件设计引物，引物结构为5
′‑
保护碱基 酶切位点 引物配对序列-3
′
，上游引物的限制性内切酶为ecorⅰ，下游引物的限制性内切酶为hindⅲ，(字体下加双划线为保护碱基，字体下加单划线为酶切位点)其序列如下表1：
56.表1引物序列信息
[0057][0058]
附：a2全长进行pcr反应时，上游引物为seq id no.4序列，下游引物为seq id no.9序列。
[0059]
以a2肽链及其重叠分段的序列信息所对应的核苷酸序列，作为pcr反应的模板，由上海生工合成并保存于puc57质粒载体中。pcr反应体系如下表2：
[0060]
表2 pcr反应体系
[0061]
pcr体系成分体积模板1μl上游引物(10μmol/l)1μl下游引物(10μmol/l)1μlex-taq dna premix25μl无菌超纯水22μl总体积50μl
[0062]
反应程序：设置94℃预变性5min；94℃变性1min；56℃退火1min，72℃延伸90s，在此条件下循环34次；再72℃延伸10min。将经过pcr扩增的产物用2％的琼脂糖电泳。参照dna回收试剂盒回收dna，将回收的片段与pmd
tm
18-t载体连接，在16℃的培养箱中过夜。
[0063]
将获得的dna回收片段与pmd
tm
18-t载体连接，并在16℃下连接16h。载体连接体系：pmd
tm-t载体：1μl；dna回收片段：4μl；solutionⅰ(连接酶和连接buffer的混合物):5μl。
[0064]
pcr扩增产物用2％琼脂糖凝胶进行分析(图1a)。结果表明，利用pcr技术分别扩增的a2肽链及其重叠分段基因，基因的预期大小分别为834bp，480bp，396bp和234bp，由图谱可知扩增产物与预期大小一致。
[0065]
2、将a2肽链及其重叠分段的基因转化到大肠杆菌
[0066]
取出50μl jm109感受态细胞于冰上融化，预冷枪头吸取10μl连接产物(a2肽链及其重叠分段的基因)加到感受态细胞中，温和摇匀至于冰上30min后42℃热激90s，置于冰上冷却3min，加入900μl在37℃预热的lb液体培养基培养至培养基浑浊。将50μl 20mg/ml的x-gal(β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物)和13μl 50mg/ml的iptg(异丙基硫代半乳糖苷，不被细菌代谢而十分稳定，阻止乳糖的表达)涂布到含有50μg/ml氨苄青霉素(amp

)的lb琼脂板上，37℃预热30min。将培养液在4000rpm离心3min，去除上清，将剩下的培养液平铺于lb琼脂糖平板上，37℃恒温培养16h，直至形成肉眼可见的蓝白斑。用接种环挑取数个白斑编号后置于lb(含50μg/ml amp

)液体培养基中，37℃震荡培养10h。在7000rpm离心10min，取沉淀，分别编号为a2、1、2、3。
[0067]
3、质粒的小量提取
[0068]
采用质粒小提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行实验。
[0069]
向吸附柱ca3(吸附柱放入收集管)中加入500μl平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放进收集管中。分别取1-5ml过夜培养的菌液(编号a2、1、2、3)于离心管，12000rpm离心1min，尽量吸除上清(若菌液较多，则多次离心将沉淀收集到同一个离心管中)向留有沉淀的菌体中加入250μl溶液p1(使用前检查是否加入核糖核酸酶a(rnase a)),使用旋涡振荡器彻底悬浮细菌沉淀。若有菌块则会影响提取量。
[0070]
然后加入250μl溶液p2，温和(防止打断基因。)翻转6-8次使菌体充分裂解，得到清凉粘稠的菌液。若未变澄清，应当减少菌量。向离心管中加入350μl溶液p3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀出现白色沉淀，12000rpm离心10min。将得到的上清液置于吸附柱cp3中，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液。然后向吸附柱中加入500μl去蛋白液pd,12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液。向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉废液，重复操作一次。
[0071]
将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残留的漂洗液去
除。为确保实验受到乙醇的影响，则在室温下将吸附柱开盖，室温放置数分钟，彻底晾干残余漂洗液。将吸附柱置于干净的离心管中，向中间位置滴加50-100μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液(编号a2’、1’、2’、3’)收集到离心管。保存与-20℃。
[0072]
4、重组质粒的酶切和pcr鉴定
[0073]
将提取的质粒(编号a2’、1’、2’、3’)用ecorⅰ和hindⅲ酶切鉴定，引物序列如表1，酶切及pcr鉴定体系如表3、表4：
[0074]
表3酶切鉴定体系
[0075]
体系体积重组质粒4μlecorⅰ1μlhindⅲ1μl缓冲液1μl无菌水13μl总体系20μl
[0076]
表4 pcr鉴定体系
[0077]
体系成分体积重组质粒1μl上游引物(10μmol/l)1μl下游引物(10μmol/l)1μlex-taq dna premix13μl无菌超纯水9μl总体积25μl
[0078]
反应程序：设置94℃预变性5min；94℃变性1min；56℃退火1min，72℃延伸90s，在此条件下循环34次；再72℃延伸10min。将经过pcr扩增的产物和酶切产物用2％的琼脂糖电泳。
[0079]
pcr产物以2％琼脂糖电泳检查(图1b、图1c)。结果发现，三个片段的条带与预期一致，说明a2及其分段基因成功转入大肠杆菌中。
[0080]
实施例2、噬菌体展示技术表达大豆球蛋白a2肽链及其重叠分段基因蛋白
[0081]
1、a2及其基因片段的酶切回收
[0082]
用ecorⅰ、hindⅲ对重组质粒(实施例1所得，编号a2’、1’、2’、3’)进行酶切，酶切产物用2％琼脂糖凝胶进行分离，切取目的dna胶块后，用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
[0083]
2、噬菌体包装
[0084]
表5噬菌体包装体系
[0085]
包装体系体积目的基因0.5μlt7噬菌体0.2μlt4 dna连接酶0.2μl10
×
接合反应缓冲液0.1μl
总体积1μl
[0086]
将连接后的产物在16℃恒温16h后，在连接产物中加入5倍体积的t7选择包装提取物室温孵育2h，加入9倍体积的lb培养基终止反应。
[0087]
3、重组噬菌体滴度测定
[0088]
用含有羧苄青霉素的lb琼脂糖培养基活化大肠杆菌blt5615，挑取完整形态的单菌落接种于5ml的m9tb培养基室温培养2h，加入浓度为1mmol/l的iptg后继续培养至od＝0.8。用lb培养基对重组噬菌体倍比稀释103、104、105，取不同稀释度的噬菌体100μl加入到3ml在50℃预热的0.6％的顶层琼脂糖中，与250μl的blt5615培养物均匀混合后，平铺在37℃预热的lb固体培养基上，在37℃培养4h后观察噬菌斑，用平板划线计数法计算噬菌体滴度，计算公式如下：
[0089]
pfv/ml＝(xpfu/0.1ml)
×
10y，其中，x是平板菌斑数；y为稀释倍数
[0090]
4、重组噬菌体的pcr鉴定
[0091]
随机挑取多个噬菌斑于te缓冲液(100μl)中65℃加热10min，12000r/min离心，取上清作为模板，进行pcr扩增，反应体系如下
[0092]
pcr鉴定体系
[0093]
体系成分体积噬菌体裂解物1μlt7噬菌体上游引物0.5μlt7噬菌体下游引物0.5μlex-taq dna premix12μl无菌超纯水11μl总体积25μl
[0094]
将经过pcr扩增的产物和酶切产物用2％的琼脂糖电泳。结果如图1d所示，重组噬菌体连接成功。经过计算得知a2基因及其片段(1、2、3)的重组噬菌体滴度分别为：8.3
×
106、7.05
×
106、7.94
×
106、7.2
×
106，可用于侵染大肠杆菌。
[0095]
5、重组噬菌体的扩大培养及纯化
[0096]
用平板划线取形态完整的blt5615菌落置于5ml含有羧苄青霉素的lb培养基中扩大培养，将扩大后的菌种接种于含有羧苄青霉素的m9tb培养基上，37℃培养至od＝0.5后加入iptg(100mg/ml,500μl)诱导培养至od＝0.6-1，大约取106pfu的噬菌体接种于培养物中，直至溶液澄清。在4℃下8000g离心10min，去除沉淀，取1ml裂解液加入200μl的无菌甘油保存在-80℃。
[0097]
采用peg(聚乙二醇)法纯化噬菌体颗粒。向裂解液中加dnase酶和rnase酶，使裂解液的浓度为1μg/ml，室温消化30min，加入1mol/l的nacl溶液和固体peg 8000(m:v＝1:10)，搅拌溶解后，用冰浴来沉淀噬菌体颗粒，在11000g下4℃离心10min收集沉淀，取800μl无菌sm重悬噬菌体颗粒，室温1h后加入1ml的氯仿抽提悬浊液中残留的细胞碎片和peg，温和震荡20s后，在3000g下4℃离心10min分离水相，可得纯化富集的噬菌体(如图3)。
[0098]
实施例3、超高压联合热加工处理破坏的抗原表位特异性抗体的制备
[0099]
1、超高压联合热加工处理大豆球蛋白：
[0100]
将质量浓度为10mg/ml的大豆球蛋白，置于无菌均质袋内，封口抽真空，将封闭好
的均质袋置于超高压处理装置的处理腔(23℃)内，开始升压，升压速率为250mpa/min，当压强升至400mpa，保压15min，再卸压，卸压速率为300mpa/min，将经过超高压的样品在130℃加热20min，此时大豆球蛋白抗原抑制率为37％，与未经过处理的大豆球蛋白的抗原抑制率87％相比，下降了50％。
[0101]
2、制备超高压联合热加工处理破坏的抗原表位特异性抗体：
[0102]
将4ml大豆球蛋白血清与等量pbs溶液混合，缓慢加入4ml饱和硫酸铵溶液，使饱和度达到50％。将混合液置于4℃冰箱中过夜，使血清中的免疫球蛋白充分沉淀。4℃、10000r/min离心30min后，取出沉淀。蛋白沉淀用4ml pbs重新溶解，加入2ml饱和硫酸铵溶液使饱和度为33％。在4℃离心30min后，将沉淀溶解在2ml pbs溶液中。然后放入预处理过的透析袋中，4℃用pbs透析3天，每6h更换一次透析液，透析后置于-20℃保存，得到纯化后的大豆球蛋白。
[0103]
用纯化后的大豆球蛋白免疫新西兰大白兔，制备大豆球蛋白多克隆抗体。将过量经过超高压联合热加工处理的大豆球蛋白加入到大豆球蛋白多克隆抗体中，37℃温育1h，离心去沉淀，收集上清液，-20℃保存，得到超高压联合热加工处理破坏的抗原表位特异性抗体。
[0104]
实施例4、被破坏过敏原表位的筛选
[0105]
用cbs缓冲液(nahco
3 2.93g，无水naco
3 1.59g，ddw定容至1l，ph 9.6)分别将噬菌体蛋白(实施例2所得，纯化后重组噬菌体)稀释成50μg/ml包被于96孔板，每孔100μl，密封后4℃过夜。次日甩干孔内液体，加入150μl pbst洗板，静置5min拍干，重复清洗3次。用质量浓度为5％的bsa缓冲液于37℃封闭90min，用pbst缓冲液洗3次，每次5min。每孔加入100μl稀释后抗体(实施例3所得抗原表位特异性抗体，稀释倍数1:1600)，阴性孔加入1：1600倍稀释的阴性血清，空白对照组加pbs缓冲液。37℃孵育1h，洗板。每孔加入100μl羊抗兔(稀释倍数1:5000)，37℃孵育1h后，洗板。每孔加入100μltmb单组分显色液，37℃显色15min。每孔加入50μl 2mol/l h2so4终止反应。在450nm下测其od值。
[0106]
间接竞争elisa鉴定结果表明(图5)，片段3具有明显优势抗原位点且破坏较其它片段显著。
[0107]
实施例5、精确定位被加工破坏的a2肽链抗原区域
[0108]
精确定位被超高压联合热加工破坏的a2肽链抗原区域，对所筛选到的所有阳性噬菌体克隆片段进行进一步的重叠分段，重复以上步骤，精确定位抗原优势区域。
[0109]
a段：201～237aa(601～711bp)
[0110]
sgfapeflkeafgvnmqivrnlqgeneeedsgaivtv(seq id no.16)
[0111]
b段：233～268aa(601～804bp)
[0112]
aivtvkgglrvtapamrkpqqeeddddeeeqpqcve(seq id no.17)
[0113]
c段：264～278aa(790～834bp)
[0114]
pqcvetdkgcqrqsk(seq id no.18)
[0115]
对片段3进行分段表达，片段3重叠分段a、b、c的pcr扩增结果如图4a所示；重组质粒的pcr鉴定结果如图4b所示；重组质粒的酶切鉴定结果如图4c所示；经过噬菌体展示的蛋白质，重组噬菌体的pcr鉴定结果如图4d所示。
[0116]
与加工破坏的抗原表位特异性抗体的反应结果，如图6所示，由间接竞争elisa法
测定可知，超高压联合热加工处理显著破坏的区域均为b片段，可知该片段经过联合处理后抗原位点减少，破坏了抗原优势位点。确定破坏a2肽链主要的抗原区域为片段b，联合处理破坏了更多的抗原表位。
[0117]
最后得到超高压联合热加工处理破坏最显著片段为b片段，该片段的氨基酸序列为：
233
aivtvkgglrvtapamrkpqqeeddddeeeqpqcve
268
。