能瓦解细菌生物被膜和杀灭细菌的蛋白酶LasA及应用的制作方法

能瓦解细菌生物被膜和杀灭细菌的蛋白酶lasa及应用
技术领域
1.本发明涉及微生物的生物技术领域，特别涉及一种能瓦解细菌生物被膜和杀灭细菌的蛋白酶lasa及其制备和应用。


背景技术：

2.生物被膜是指微生物在载体表面通过黏附生长并用自身分泌的胞外多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物包裹所形成的高度组织化、系统化的多细胞群体结构。生物被膜与人类密切相关，在临床上往往引起很难治愈的慢性感染。而细菌产生耐药性的原因，除去原菌在抗菌素的胁迫压力下产生的适应性变异之外，另一方面是因为在正常情况下，致病菌会形成细菌生物被膜，为其提供了保护屏障，对抗菌药物的抗药性与游离状态相比会增加成百上千倍，并能够更容易地逃避宿主的免疫反应，因而大大增加了治疗的难度。细菌吸附于惰性物体后，分泌出的多糖蛋白复合物，使细菌相互粘连并将自身菌落聚集缠绕其中形成的膜样物，使细菌可以停留在一个适宜的微环境中而不会被冲散；胞外基质还可吸附药物或影响药物渗透到细菌群落中，因而大多数药物只能杀灭生物被膜表面的微生物，而生物被膜内部的微生物则是产生变异的主要原因。因而生物被膜的这种特殊结构可以作为一种屏障保护细菌抵御抗菌药物的杀伤和逃逸宿主免疫系统的清除，而成为潜在的感染源，导致难治性临床生物被膜的相关感染。细菌生物被膜引起的感染主要有两种：一种是生物医学材料相关感染，如导管、插管、生物材料移植物相关感染；另一种是细菌生物被膜疾病，如细菌性阴道病、慢性骨髓炎等。
3.细菌性阴道病(bacterial vaginitis,bv)是育龄妇女最常见的生殖道炎症性疾病，由于阴道内微生物菌群与宿主、环境之间所构成的动态平衡遭到破坏，导致菌群失调而引起的一组症候群，发病率分别高达23％-29％。阴道加德纳菌(gardnerella vaginalis,gv)是引起细菌性阴道病的主要致病菌，近年观察到阴道加德纳菌可形成致密的生物被膜结构，紧密黏附在阴道上皮细胞表面，产生顽固的耐药性。超过50％的女性在初次治疗细菌性阴道病成功后可出现复发，复发性细菌性阴道病为12个月内出现3次或以上的发作。复发性细菌性阴道病是患者阴道中残留的生物被膜内的加德纳菌再激活，并不是再感染。复发性细菌性阴道病的治疗难度较大，现有治疗措施包括延长抗生素疗程，采取巩固治疗，但都收效不大。除了阴道加德纳菌生物被膜，紧密黏附在阴道上皮细胞表面，产生顽固的耐药性外，金黄色葡萄球菌也是常见的致病菌，由于金黄色葡萄球菌生物被膜的产生而产生顽固的耐药性和超强的感染能力。总之目前临床上还缺乏能够有效、稳定地抑制和瓦解阴道加德纳菌以及金黄色葡萄球菌的生物被膜的制剂和方法。因此，寻找有效抑制和瓦解细菌生物被膜的途径成为亟待解决的科学问题。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的上述缺陷，提供一种能瓦解细菌生物被膜和杀灭细菌的蛋白酶lasa及其制备和应用。
5.本发明是通过以下技术方案实现的：
6.一种能瓦解细菌生物被膜和杀灭细菌的蛋白酶lasa，所述蛋白酶lasa具有如seq idno.1所示的氨基酸序列。
7.作为优化，所述蛋白酶lasa的编码序列选自：
8.(a)编码如seq id no.1所示的氨基酸序列；
9.(b)序列如seq id no.2所示的核苷酸序列。
10.一种制备上述能瓦解细菌生物被膜和杀灭细菌的蛋白酶lasa的方法，包括以下步骤：
11.(1)通过聚合酶链式反应从铜绿假单胞菌p.aeruginosa pao1菌株的基因组dna中扩增得到切掉信号肽的编码prolasa的基因序列，并将其连接入pet21b表达载体中，得到野生型pet21b-lasa质粒；
12.(2)将野生型pet21b-lasa质粒转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)后扩大培养，得到菌体；
13.(3)收集菌体，加入lysis buffer重悬菌液，并进行超声破碎，将破碎后所得菌液离心，上清液上样到ni-nta亲和层析柱上，用重悬buffer冲洗10个柱体积，除去非特异性吸附的杂蛋白，得到纯化的无活性的lasa前体蛋白，然后再用trypsin酶切掉前肽得到成熟的有活性的蛋白酶lasa。
14.作为优化，所述步骤(3)中用重悬buffer冲洗10个柱体积，除去非特异性吸附的杂蛋白，得到纯化的无活性的lasa前体蛋白，然后再用trypsin酶切掉前肽得到成熟的有活性的蛋白酶lasa的具体步骤如下：
15.用重悬buffer冲洗10个柱体积，待重悬buffer完全流穿后，堵住镍柱，除去非特异性吸附的杂蛋白，得到纯化的无活性的lasa前体蛋白，然后再加入16μl的trypsin酶和2ml的高盐重悬buffer，吹吸悬浮基质，4℃层析柜中反应30min，反应完成后，再加入8ml高盐重悬buffer，流穿至一烧杯中，再加入10ml高盐elutionbuffer将成熟的蛋白酶lasa蛋白洗脱下来，得到成熟的有活性的蛋白酶lasa，再用sds-page检测trypsin酶切结果。
16.作为优化，所述步骤(3)中收集细菌的条件为4200rpm，4℃，20min。
17.作为优化，所述步骤(3)中lysis buffer重悬菌液的条件为25mm tris ph 8.0,500mmnacl。
18.作为优化，所述步骤(3)中菌液离心条件为14000rpm，4℃，45min。
19.一种蛋白酶lasa的用途，所述蛋白酶lasa用于选自下组的一种或多种用途：
20.(1)瓦解细菌已经形成的生物被膜；
21.(2)杀灭细菌；
22.(3)不能杀灭乳酸杆菌。
23.作为优化，所述细菌是阴道加德纳菌和金黄色葡萄球菌。
24.本发明的有益效果是：
25.本发明蛋白酶lasa能够更有效、稳定地瓦解阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌等病原微生物的生物被膜和杀灭细菌，而且对人体本身和益生菌—乳酸杆菌没有副作用，可以更好地应用于复杂的临床环境。具有较好的实际应用价值和推广价值。
附图说明
26.下面结合附图对一种能瓦解细菌生物被膜和杀灭细菌的蛋白酶lasa及其制备和应用作进一步说明：
27.图1为蛋白酶lasa在大肠杆菌中表达纯化结果，其中“ce”为细胞破碎液，“s”为细胞破碎液上清，“f”为镍柱流穿液,“w1”为低浓度咪唑的洗脱液，“w2为柱内酶切后流穿的重悬buffer”“e”为柱内酶切后高浓度咪唑冲洗获得的 elution液；
28.图2(a)为蛋白酶lasa的ph5.0～8.0作用范围；
29.图2(b)为蛋白酶lasa的ph 8.0～9.0作用范围；
30.图3为蛋白酶lasa的变性温度曲线；
31.图4为蛋白酶lasa对阴道加德纳菌生物被膜的降解能力；
32.图5为蛋白酶lasa对金黄色葡萄球菌生物被膜的降解能力；
33.图6(a)为蛋白酶lasa对阴道加德纳菌的杀灭能力；
34.图6(b)为蛋白酶lasa对金黄色葡萄球菌的杀灭能力；
35.图6(c)为蛋白酶lasa对卷曲乳杆菌的杀灭能力；
36.图6(d)为蛋白酶lasa与抗生素mtz、va的协同作用；
37.图6(e)为蛋白酶lasa与抗生素va的协同作用。
具体实施方式
38.下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
39.下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(sambrook和russell，2001)。
40.下述实施例中，所使用的材料、试剂、菌株、载体等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
41.实施例1切断甘氨酸肽桥的蛋白酶lasa的制备
42.(1)通过聚合酶链式反应从铜绿假单胞菌p.aeruginosa pao1菌株的基因组dna中扩增得到切掉信号肽的编码prolasa的基因序列，并将其连接入pet21b表达载体中，得到野生型pet21b-lasa质粒。
43.(2)将野生型pet21b-lasa质粒转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，并将转化后所得细胞接种于含有终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中；将细胞置于37℃、200rpm培养直至od
600
约为0.8，降温至18℃过1h后向培养基中添加终浓度为100mm的isopropyl β-d-thiogalactopyranoside，150rpm培养过夜，得到菌体。
44.(3)收集菌体(4200rpm，4℃，20min)，加入lysis buffer(25mm tris ph 8.0,500mmnacl)重悬菌液，并进行超声破碎，将破碎后所得菌液离心(14000rpm，4℃，45min)，上清液上样到ni-nta亲和层析柱上，用重悬buffer冲洗约10个柱体积，除去非特异性吸附的杂蛋白，这样纯化到的蛋白是无活性的蛋白酶lasa前体蛋白，然后需要再用trypsin酶切掉前肽才能得到成熟的有活性的蛋白蛋白酶lasa。因此，采用柱上酶切的方法，可以一次性
得到纯化的成熟蛋白酶lasa。
45.具体做法是：用重悬buffer冲洗10个柱体积，待重悬buffer完全流穿后，堵住镍柱，除去非特异性吸附的杂蛋白，得到纯化的无活性的lasa前体蛋白，然后再加入16μl的trypsin 酶和2ml的高盐重悬buffer，吹吸悬浮基质，4℃层析柜中反应30min，反应完成后，再加入 8ml高盐重悬buffer，流穿至一烧杯中，再加入10ml高盐elution buffer将成熟的蛋白酶lasa 蛋白洗脱下来，得到成熟的有活性的蛋白酶lasa(蛋白酶lasa是来源于铜绿假单胞菌的 m23家族锌指蛋白酶，大小为19.95kd-20kd，其作用位点为g-g氨基酸序列，如果生物被膜内含有肽链，会被蛋白酶lasa水解)，再用sds-page检测trypsin酶切结果。
46.图1为蛋白酶lasa在大肠杆菌中表达纯化及酶切结果。从图1可以看出经过胰蛋白酶酶切后的成熟的蛋白酶lasa大小在20kd左右，蛋白在经过镍柱纯化后纯度较高，没有明显的杂带。
47.实施例2切断甘氨酸肽桥的蛋白酶lasa的最适反应条件
48.使用实施例1制得的切断甘氨酸肽桥的蛋白酶lasa，用ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0、 8.5和9.0的0.5m tris-hcl溶液将母液稀释至0.1mg/ml和0.05mg/ml，然后将相应ph的酶液缓冲液分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液中，立即用酶标仪测定其od
595nm
变化曲线。
49.蛋白酶lasa的变性温度由差示扫描微量热仪vp-dsc测得。
50.从图2(a)可以看出，ph5.0时酶几乎无活性，随着ph的升高，酶活逐渐增强；从图 2(b)可以看出，ph9.0时酶活最强。
51.从图3可以看出，蛋白酶lasa变性温度为58℃。
52.综上所述，蛋白酶lasa对碱性环境的耐受性强，在ph9.0下仍有极高的酶活。对酸性环境的耐受性不强，ph5.0时酶活很低，最适ph为8.5～9.0；lasa蛋白酶的变性温度为58℃，在室温下稳定性较好，且反复冻融多次仍有较高的酶活，性质稳定。
53.实施例3蛋白酶lasa对已形成的阴道加德纳菌生物被膜的瓦解
54.在96孔板中加5％羊血37℃下培养阴道加德纳菌48h后倒掉培养基，并用蒸馏水冲洗。然后加入不同浓度的蛋白酶lasa，室温处理6h，结果如图4所示，处理后无需结晶紫染色就可看出结果：蛋白酶lasa对阴道加德纳菌的生物被膜具有较强的降解作用。
55.表1不同浓度的蛋白酶lasa和甲硝唑对已形成的阴道加德纳菌生物被膜的降解率
[0056][0057]
从表1可以看出，甲硝唑无法降解阴道加德纳菌生物被膜，0.2mg/ml的蛋白酶lasa能降解62％的阴道加德纳菌生物被膜，0.02mg/ml的蛋白酶lasa仍能降解28.5％的阴道加德纳菌生物被膜。因此，与甲硝唑相比，该蛋白酶lasa可以更有效、稳定地瓦解已形成的阴
道加德纳菌生物被膜。
[0058]
实施例4蛋白酶lasa对已形成的金黄色葡萄球菌生物被膜的瓦解
[0059]
在96孔板中37℃下培养金黄色葡萄球菌48h后倒掉培养基，并用蒸馏水冲洗。然后加入不同浓度的lasa，室温处理1h，结果如图5所示，蛋白酶lasa对金黄色葡萄球菌生物被膜有明显的降解作用，最低作用浓度为0.04mg/ml。室温下处理1h后，0.1mg/ml酶液能降解约90％的生物被膜，酶的最低作用浓度为0.04mg/ml。
[0060]
表2不同浓度的蛋白酶lasa和万古霉素对已形成的金黄色葡萄球菌生物被膜的降解率
[0061][0062]
从表2可以看出，0.2mg/ml的蛋白酶lasa能降解83.2％的金黄色葡萄球菌生物被膜，而 0.2mg/ml的万古霉素仅能降解19.4％的金黄色葡萄球菌生物被膜；0.02mg/ml的蛋白酶lasa 仍能降解45.8％的金黄色葡萄球菌生物被膜，而0.02mg/ml的万古霉素仅仅能降解5.2％的金黄色葡萄球菌生物被膜。因此，与万古霉素相比，该蛋白酶lasa可以更有效、稳定地瓦解已形成的金黄色葡萄球菌生物被膜。
[0063]
实施例5蛋白酶lasa对阴道加德纳菌的杀灭能力
[0064]
分别用0.02，0.05，0.1和0.2mg/ml的酶液处理od600nm＝1.0的阴道加德纳菌悬浮液，4 h后杀菌率为8.1-70.3％。lasa对阴道加德纳菌的杀菌效果见图6(a)。
[0065]
表3不同浓度的蛋白酶lasa和甲硝唑对阴道加德纳菌的杀菌率
[0066][0067]
从表3可以看出，0.2mg/ml的蛋白酶lasa能杀灭70.3％的阴道加德纳菌，0.2mg/ml的甲硝唑仅能杀灭3.4％的阴道加德纳菌；0.05mg/ml的蛋白酶lasa仍能杀灭14％的阴道加德纳菌，而0.1mg/ml的甲硝唑对阴道加德纳菌的杀菌率为0％。因此，与甲硝唑相比，该蛋白酶lasa可以更有效、稳定地杀灭阴道加德纳菌。
[0068]
实施例6蛋白酶lasa对金黄色葡萄球菌的杀灭能力
[0069]
分别用0.01，0.02，0.05和0.1mg/ml的酶液处理od600nm＝1.0的金黄色葡萄球菌悬浮液，4h后杀菌率为30-60％。lasa对金黄色葡萄球菌的杀菌效果见图6(b)。
[0070]
表4不同浓度的蛋白酶lasa和万古霉素对金黄色葡萄球菌的杀菌率
[0071][0072]
从表4可以看出，0.2mg/ml的蛋白酶lasa能杀灭40.3％的金黄色葡萄球菌，0.2mg/ml 的万古霉素仅能杀灭6.1％的金黄色葡萄球菌；0.02mg/ml的蛋白酶lasa仍能杀灭15％的金黄色葡萄球菌，而0.02mg/ml的万古霉素对阴道加德纳菌的杀菌率仅为2.4％。因此，与万古霉素相比，该蛋白酶lasa可以更有效、稳定地杀灭金黄色葡萄球菌。
[0073]
实施例7蛋白酶lasa对人体益生菌卷曲乳酸杆菌的影响
[0074]
分别用0.01，0.02，0.05和0.1mg/ml的蛋白酶lasa处理od600nm＝1.5的卷曲乳酸杆菌悬浮液，4h后将反应过的曲乳酸杆菌悬浮液摇匀稀释104倍后取50μl凃板，37℃厌氧培养过夜后计算菌落数，分别为518,476,591,531。通过图6(c)结果可判定蛋白酶lasa对卷曲乳杆菌没有杀伤作用。
[0075]
实施例8蛋白酶lasa与抗生素mtz对杀灭阴道加德纳菌的协同作用
[0076]
实验组一分别用0.02，0.05，0.1和0.2mg/ml的蛋白酶lasa处理od600nm＝1.0的阴道加德纳菌悬浮液，实验组二在上述酶浓度下分别添加1mg/ml的甲硝唑，6h后测量菌悬液的 od值。
[0077]
结果如图6(d)所示，同一浓度下lasa和lasa mtz相比，lasa mtz的阴道加德纳菌的细胞生物量更低，可见蛋白酶lasa与mtz能够协同作用杀灭阴道加德纳菌。
[0078]
实施例9蛋白酶lasa与抗生素va对金黄色葡萄球菌的协同作用
[0079]
实验组一分别用0.02，0.05，0.1和0.2mg/ml的蛋白酶lasa处理od600nm＝1.0的金黄色葡萄球菌悬浮液，实验组二在上述酶浓度反应4h后再分别添加1mg/ml的万古霉素反应2h，总反应时间6h后测量菌悬液的od值。
[0080]
结果如图6(e)所示，0.2mg/ml的蛋白酶lasa和lasa va相比，lasa va的金黄色葡萄球菌的细胞生物量更低，可见0.2mg/ml的蛋白酶lasa与mtz能够协同作用杀灭阴道加德纳菌；而0.05，0.1和0.2mg/ml的蛋白酶lasa和lasa va相比，单独使用蛋白酶lasa 的金黄色葡萄球菌的细胞生物量更低，可见，0.05，0.1和0.2mg/ml浓度下的蛋白酶lasa与万古霉素不具有协同作用，此浓度下单独使用蛋白酶lasa的杀菌效果更明显。
[0081]
综上所述，蛋白酶lasa能够更有效、稳定地瓦解阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌等
病原微生物的生物被膜和杀灭阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌等病原微生物，而且对人体本身和益生菌—乳酸杆菌没有副作用，可以更好地应用于复杂的临床环境。
[0082]
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施方式。但是凡是未脱离本发明技术原理的前提下，依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何简单修改、等同变化与改型，皆应落入本发明的专利保护范围。