一种多酶级联催化L-氨基酸生成N-甲基-L-氨基酸的方法及其应用

一种多酶级联催化l-氨基酸生成n-甲基-l-氨基酸的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于酶工程技术领域，特别涉及一种多酶级联催化l-氨基酸生成n-甲基-l-氨基酸的方法及其应用。


背景技术：

2.n-α-烷基化是调节手性α-氨基酸活性的一种机制。n-甲基-α-氨基酸在制药和精细化工等领域应用广泛，是制备多种生物活性分子的重要组成部分，如抗生素万古霉素、免疫抑制剂环孢素、细胞抑制放线菌素和铁载体需氧蛋白等。因此，对n-甲基-l-氨基酸的合成方法进行研究具有重要价值。
3.与其他手性化合物相似，n-甲基-l-氨基酸的制备方法主要分为化学合成法和生物合成法。化学合成法依赖于n-烷基化过程或还原胺化过程。这些合成路线通常需要使用有毒试剂和危险溶剂，如自燃金属氢化物或有基因毒性的烷基化剂，反应过程中会产生大量污染环境的废物，有些反应还需要特殊的温度和压力环境，并且部分方法获得的产物纯度较低，需要复杂的后处理程序。
4.随着生物技术的发展，生物法制备n-甲基-l-氨基酸越来越受到人们的关注。生物法合成n-甲基-l-氨基酸具有绿色清洁、反应条件温和以及转化率高的优势。目前的合成方法包括利用n-甲基转移酶或几种脱氢酶。n-甲基转移酶(ec2.1.1)在自然界中负责许多氨基酸、肽和蛋白质的n-α-甲基化，产生单甲基化、二甲基化或三甲基化产物，缺点在于这种酶通常对底物具有高度选择性，底物范围较窄。一些脱氢酶能催化α-酮酸或亚胺与胺供体进行还原胺化反应产生n-甲基-l-氨基酸，包括opines脱氢酶、n-甲基氨基酸脱氢酶、酮亚胺还原酶和亚胺还原酶等。该类反应需要特定的底物，有些底物溶解度较差、价格昂贵，不适用于工业化的生产。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种多酶级联催化l-氨基酸生成n-甲基-l-氨基酸的方法，该方法联合利用l-氨基酸氧化酶和n-甲基氨基酸脱氢酶，以天然l-氨基酸为底物生成相应n-甲基-l-氨基酸。
6.本发明的另一目的在于提供所述多酶级联催化l-氨基酸生成n-甲基-l-氨基酸的方法的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种多酶级联催化l-氨基酸生成n-甲基-l-氨基酸的方法，是以l-氨基酸为底物，利用l-氨基酸氧化酶、n-甲基氨基酸脱氢酶和nadph再生酶同步级联催化l-氨基酸反应生成n-甲基-l-氨基酸。
9.所述的l-氨基酸包括l-苯丙氨酸、l-谷氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-缬氨酸和l-异亮氨酸中的至少一种；优选为l-苯丙氨酸、l-谷氨酸和l-亮氨酸中的至少一种。
10.所述的n-甲基-l-氨基酸为n-甲基-l-苯丙氨酸、n-甲基-l-谷氨酸、n-甲基-l-亮氨酸、高脯氨酸、n-甲基-l-缬氨酸和n-甲基-l-异亮氨酸中的至少一种；优选为n-甲基-l-苯丙氨酸、n-甲基-l-谷氨酸和n-甲基-l-亮氨酸中的至少一种。
11.所述的l-氨基酸氧化酶优选为祖先l-氨基酸氧化酶，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
12.所述的n-甲基氨基酸脱氢酶优选为来源于恶臭假单胞菌的n-甲基氨基酸脱氢酶，其氨基酸序列在ncbi的登陆号为ab190215.1。
13.所述的nadph再生酶优选为来源于伯克霍尔德菌的甲酸脱氢酶，其氨基酸序列在ncbi的登陆号为acf35003.1。
14.所述的l-氨基酸氧化酶、n-甲基氨基酸脱氢酶和nadph再生酶均可以通过常规方法获得，如通过原核表达，经蛋白纯化获得。
15.所述的原核表达的宿主菌优选为大肠杆菌；更优选为大肠杆菌bl21(de3)。
16.所述的蛋白纯化可采用ni柱亲和层析法进行纯化。
17.所述的反应的体系为ph 7.5～9.0的tris-hcl缓冲液体系或ph 9.5～10.0的na2co
3-nahco3缓冲液体系；优选为ph 9.5～10.0的na2co
3-nahco3缓冲液体系；更优选为ph 9.5的na2co
3-nahco3缓冲液体系。
18.所述的反应的体系为：0.01～1mg/ml l-氨基酸脱氨酶，1～5mg/ml n-甲基氨基酸脱氢酶，0.2～1mg/ml nadph再生酶，10～100mm l-氨基酸，10～200mm胺供体，10～300mm甲酸盐，1～10mm nadp

，20～200u/ml过氧化氢酶，ph 7.5～10。
19.所述的甲酸盐优选为甲酸钠。
20.所述的甲酸盐与l-氨基酸的摩尔比为1～5:1；优选为3:1。
21.所述的胺供体为甲胺。
22.所述的胺供体与l-氨基酸的摩尔比为1～5:1；优选为2:1。
23.所述的nadp

与l-氨基酸的摩尔比可为1:1～10；优选为1:5～10；更优选为1:10。
24.所述的nadp

为氧化型辅酶ii。
25.所述的反应的体系优选为：0.01mg/ml l-氨基酸脱氨酶，1mg/ml n-甲基氨基酸脱氢酶，0.4mg/ml nadph再生酶，10～100mm l-氨基酸，20～200mm胺供体，30～300mm甲酸盐，5～10mm nadp

，50u/ml过氧化氢酶，ph 9.5。
26.所述的反应的温度为20～50℃；优选为37℃。
27.所述的反应的转速为100～200rpm；优选为160rpm。
28.所述的反应的时间为6～24h；优选为12～24h；更优选为12h。
29.所述的多酶级联催化l-氨基酸生成n-甲基-l-氨基酸的方法在制备n-甲基-l-氨基酸中的应用。
30.所述的n-甲基-l-氨基酸为n-甲基-l-苯丙氨酸、n-甲基-l-谷氨酸、n-甲基-l-亮氨酸、l-高脯氨酸、n-甲基-l-缬氨酸和n-甲基-l-异亮氨酸中的至少一种；优选为n-甲基-l-苯丙氨酸、n-甲基-l-谷氨酸和n-甲基-l-亮氨酸中的至少一种。
31.本发明所提供的催化l-氨基酸生成n-甲基-l-氨基酸方法中，存在辅因子再生系统，其中因子再生系统为：l-氨基酸氧化酶催化l-氨基酸氧化生成α-酮酸，n-甲基氨基酸脱氢酶催化α-酮酸还原为n-甲基-l-氨基酸同时nadph被氧化成nadp

，nadph再生酶将nadp

还
原为nadph，生成的nadph重新参与到α-酮酸的还原胺化(图1)。
32.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
33.(1)本发明开发了一种能高效、低成本、体外制备n-甲基-l-氨基酸的新方法，该方法以廉价易得的天然l-氨基酸为底物，利用l-氨基酸氧化酶、n-甲基氨基酸脱氢酶和nadph再生酶催化合成n-甲基-l-氨基酸；其中，底物范围较广(将底物l-氨基酸转化为相应n-甲基-l-氨基酸)，可以适应l-苯丙氨酸、l-谷氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-缬氨酸和l-异亮氨酸等，产率在47％～100％之间，具有较好的工业应用前景。
34.(2)本发明中多酶级联催化合成n-甲基-l-氨基酸的方法，是以l-氨基酸为底物，并对反应的各影响因素，包括反应温度、ph值、甲酸钠与甲胺浓度等进行了优化，提高了底物转化率高和产物(n-甲基-l-氨基酸)转化率。
附图说明
35.图1是l-氨基酸生成相应n-甲基-l-氨基酸的级联反应途径与nadph再生途径偶联示意图(图中，r基团为：-ch
2-c6h5、-(ch2)
2-cooh、-c4h8、-ch
2-ch(ch3)2或-ch-(ch3)2)。
36.图2是sds-page验证l-氨基酸氧化酶、n-甲基氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的表达结果图(m：dnamarker；泳道1：anclaao；泳道2：nmaadh；泳道3：bsfdh)。
37.图3是反应温度和ph对级联反应催化l-苯丙氨酸生成n-甲基-l-苯丙氨酸的影响图；其中，a为反应温度对级联反应催化l-苯丙氨酸生成n-甲基-l-苯丙氨酸的影响；b为ph对级联反应催化l-苯丙氨酸生成n-甲基-l-苯丙氨酸的影响。
38.图4是甲酸钠以及甲胺与底物的初始摩尔比对级联反应催化l-苯丙氨酸生成n-甲基-l-苯丙氨酸的影响图；其中，a为甲酸钠与底物的初始摩尔比对级联反应催化l-苯丙氨酸生成n-甲基-l-苯丙氨酸的影响；b为甲胺与底物的初始摩尔比对级联反应催化l-苯丙氨酸生成n-甲基-l-苯丙氨酸的影响。
39.图5是级联反应催化l-氨基酸生成n-甲基-l-氨基酸的hplc检测结果图；其中，(a)～(f)为标准品液相检测图谱和样品检测图谱(图中，a：n-甲基-l-苯丙氨酸和l-苯丙氨酸标准品液相检测图谱，b：样品l-苯丙氨酸检测图谱；c：n-甲基-l-谷氨酸和l-谷氨酸标准品液相检测图谱，d：样品l-谷氨酸检测图谱；e：n-甲基-l-亮氨酸和l-亮氨酸标准品液相检测图谱，f：样品l-亮氨酸检测图谱；g：l-高脯氨酸和l-赖氨酸标准品液相检测图谱，h：样品l-高脯氨酸检测图谱；i：n-甲基-l-缬氨酸和l-缬氨酸标准品液相检测图谱，j：样品l-缬氨酸检测图谱；k：n-甲基-l-异亮氨酸和l-异亮氨酸标准品液相检测图谱，l：样品l-异亮氨酸检测图谱)。
具体实施方式
40.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
41.实施例1：l-氨基酸生成n-甲基-l-氨基酸的相关酶的重组表达
42.(1)将祖先l-氨基酸氧化酶(anclaao，seq id no.1)(序列来自于文献doi:
10.1038/s42004-020-00432-8)编码基因、恶臭假单胞菌n-甲基氨基酸脱氢酶(nmaadh)(ncbi的登陆号：ab190215.1)编码基因和伯克霍尔德菌甲酸脱氢酶(bsfdh)(ncbi的登陆号：acf35003.1)编码基因交由金斯瑞公司进行密码子优化与合成，分别插入到常规市售pet-28a载体的xho i位点和nde i位点之间，酶切分析鉴定，获得相应的重组质粒。
43.祖先l-氨基酸氧化酶(seq id no.1)：
44.mgthytfgkeitdkplptqvkvaivgagmsglysawrlqqeancqdlaifersnrtggrldsdliefknlrsetpktitvkeeqggmrflfdgmddlmalflklnlqddivpfpmnsggnnrlffrgesfsvedaqqddyaiwshlynldqseqgvnpkdivnvvfnrileanpqfqqrpevrgpefwqafrlecqwqgqtlnewtlwdlytdmgysqecinmlyrvlgfngtflsqmnagvayqlledfpagvqfktfkdgfstlpnklveevgtdnihlqtsieeidfaeesglyslhyshtdehgrvhkgqvkaekvilglprlaleklfvrsnafnrldkdrseqlwntlqsasnqpllkinlyydsawwgrgttgrpavefgpnfadlptgsvypfyavndelaaalmyqerstnpskavqakldrignekyerpaaltiycdylninfwsnlqnigetyhhphqddyvedvpadiypastavveqatrffkdifnthyvpepiltsariwegsvrfdipasrqfgfgvhqwavgandkevmatlaeplpnlftcgeafsdyqgwvegalrstdlalekgfglkplsqvyfentnisssdaikavyeenssklinqyietnfsantapiektadvdsvigvnlsyfdtk。
45.(2)利用化学法将各重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布于含有50ug/ml卡那霉素的lb固体培养基，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆菌株接种到5～20ml lb液体培养基中，在37℃、180rpm振荡培养，以1％(v/v)的接种量分别转接到含有50μg/ml卡那霉素的100ml lb液体培养基中，37℃、180rpm培养2～3h至od 600为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，在16℃继续诱导20h，离心收集菌体(8000rpm，5min)，用ph 6.5～9.5的pb缓冲液或tris-hcl缓冲液重悬菌体，进行超声破碎(350w，工作2s、间歇3s，20min)，破碎结束后离心(12000rpm，10min)收集可溶的上清表达组分(粗酶液)。
46.实施例2：多酶级联催化l-氨基酸生成n-甲基-l-氨基酸相关酶的蛋白纯化
47.利用ni柱亲和层析法将上述破碎后的可溶上清表达组分进行分离纯化，得到l-氨基酸氧化酶、n-甲基氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶。具体操作为：用5～10倍柱体积的平衡缓冲液(ph 7.5 50mm tris-hcl，50mm咪唑，500mm nacl)平衡介质；将实施例1中破碎后得到的粗酶液用0.45μm滤头过滤；以1ml/min流速上样；上样结束后用10～20倍柱体积缓冲液(ph 7.5 50mm tris-hcl，50mm咪唑，500mm nacl)清洗杂蛋白；接着用5～10倍柱体积洗脱缓冲液(ph 7.5 50mm tris-hcl，200mm咪唑，500mm nacl)进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液用50mm ph 9.5的na2co
3-nahco3缓冲液稀释、超滤浓缩(10kda)，重复5～10次，除去咪唑；将超滤后得到的各目的蛋白采用bradford法测定浓度，并分装保存于-80℃。各目的蛋白利用sds-page进行验证，结果如图2所示。
48.实施例3：反应温度和缓冲液ph值对催化合成n-甲基-l-苯丙氨酸的影响
49.探究反应温度和ph对多酶级联催化l-苯丙氨酸合成n-甲基-l-苯丙氨酸的影响，具体步骤如下：
50.(1)反应体系包含50mm l-苯丙氨酸(l-phe)、100mm甲胺、100mm甲酸钠、5mm nadp

(氧化型辅酶ii，购自上海麦克林生化科技有限公司)以及50u/ml过氧化氢酶(购自生工生物工程上海(股份)有限公司)，加入终浓度为0.1mg/ml的l-氨基酸脱氨酶、1mg/ml的n-甲基氨基酸脱氢酶、0.4mg/ml的甲酸脱氢酶进行反应，温度范围选择20～45℃(具体为：20℃、30
℃、37℃、45℃)，缓冲液选择ph 7.5～9.0的tris-hcl缓冲液(ph值为7.5、8.0、8.5、9.0)以及ph 9.5～10.0的na2co
3-nahco3缓冲液(ph值为9.5、10.0)。
51.(2)
①
l-氨基酸氧化酶催化l-苯丙氨酸氧化生成苯丙酮酸(ppa)，ppa采用铁离子显色法进行检测。10ml铁离子显色剂的配制：fecl3溶解于6ml二甲基亚砜(dmso)，加入3.8ml去离子水进行稀释，再加入200μl冰醋酸使溶液呈酸性，fecl3终浓度为100mm。取适量样品加入铁离子显色液中，混合均匀后于室温放置，颜色稳定后利用紫外分光光度计检测其在640nm波长处的吸光值。苯丙酮酸浓度的校准曲线：y＝0.1619x 0.0003361，x为苯丙酮酸浓度，mm。
52.②
利用高效液相色谱法(hplc)检测n-甲基-l-苯丙氨酸(n-me-l-phe)，检测条件：色谱柱为大赛璐cr( )；流动相为ph 1.1～1.25高氯酸水溶液；检测波长210nm；柱温30℃；流量0.5ml/min；进样量20μl。利用该液相检测方法，测定多酶级联催化l-苯丙氨酸生成的n-甲基-l-苯丙氨酸的浓度。
53.结果如图3所示，反应温度在37～45℃时催化速率较高，考虑到温度对酶稳定性的影响，优选37℃为级联反应温度；当ph在9.5～10.0时产率达到最高，优选ph为9.5的na2co
3-nahco3缓冲液作为反应溶液。
54.实施例4：甲酸钠和甲胺与底物的初始摩尔比对催化合成n-甲基-l-苯丙氨酸的影响
55.甲酸铵是辅酶循环的底物，甲胺作为还原胺化反应的胺供体，两者浓度均会对反应速率产生影响。以实施例3的反应体系，探究反应组分与底物的初始摩尔比对多酶级联催化l-苯丙氨酸合成n-甲基-l-苯丙氨酸的影响。甲胺或甲酸钠与底物(l-phe)的摩尔浓度之比选择1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，即体系中l-phe浓度为50mm，分别加入50mm，100mm，150mm，200mm，250mm的甲酸钠或甲胺。再利用铁离子显色法检测苯丙酮酸(ppa)，高效液相色谱法检测n-甲基-l-苯丙氨酸(n-me-l-phe)，具体步骤同实施例3。
56.结果如图4所示，当甲酸钠与底物的摩尔浓度比在3:1时，产物得率得到显著提升，因此甲酸钠与底物的摩尔浓度比优选为3:1；随着甲胺浓度的增加，n-甲基-l-苯丙氨酸的产率随之增加，考虑经济性，选择甲胺与底物的摩尔浓度比为2:1。
57.实施例5：三酶偶合催化l-苯丙氨酸生成n-甲基-l-苯丙氨酸
58.将终浓度为0.1mg/ml l-氨基酸脱氨酶、1mg/ml n-甲基氨基酸脱氢酶、0.4mg/ml甲酸脱氢酶、100mm l-苯丙氨酸、200mm甲胺、300mm甲酸钠、10mm nadp

以及50u/ml过氧化氢酶在ph 9.5的na2co
3-nahco3缓冲液中进行多酶级联催化反应，37℃、160rpm反应12h。
59.实施例6：三酶偶合催化l-谷氨酸生成n-甲基-l-谷氨酸
60.将终浓度为0.1mg/ml l-氨基酸脱氨酶、1mg/ml n-甲基氨基酸脱氢酶、0.4mg/ml甲酸脱氢酶、10mm l-谷氨酸、20mm甲胺、30mm甲酸钠、1mm nadp

以及50u/ml过氧化氢酶在ph 9.5的na2co
3-nahco3缓冲液中进行多酶级联催化反应，37℃、160rpm反应12h。
61.实施例7：三酶偶合催化l-亮氨酸生成n-甲基-l-亮氨酸
62.将终浓度为0.1mg/ml l-氨基酸脱氨酶、1mg/ml n-甲基氨基酸脱氢酶、0.4mg/ml甲酸脱氢酶、10mm l-亮氨酸、20mm甲胺、30mm甲酸钠、1mm nadp

以及50u/ml过氧化氢酶在ph 9.5的na2co
3-nahco3缓冲液中进行多酶级联催化反应，37℃、160rpm反应12h。
63.实施例8：三酶偶合催化l-赖氨酸生成l-高脯氨酸
64.将终浓度为0.1mg/ml l-氨基酸脱氨酶、1mg/ml n-甲基氨基酸脱氢酶、0.4mg/ml甲酸脱氢酶、10mm l-赖氨酸、20mm甲胺、30mm甲酸钠、1mm nadp

以及50u/ml过氧化氢酶在ph 9.5的na2co
3-nahco3缓冲液中进行多酶级联催化反应，37℃、160rpm反应12h。
65.实施例9：三酶偶合催化l-缬氨酸生成n-甲基-l-缬氨酸
66.将终浓度为0.1mg/ml l-氨基酸脱氨酶、1mg/ml n-甲基氨基酸脱氢酶、0.4mg/ml甲酸脱氢酶、10mm l-缬氨酸、20mm甲胺、30mm甲酸钠、1mm nadp

以及50u/ml过氧化氢酶在ph 9.5的na2co
3-nahco3缓冲液中进行多酶级联催化反应，37℃、160rpm反应12h。
67.实施例10：三酶偶合催化l-异亮氨酸生成n-甲基-l-异亮氨酸
68.将终浓度为10μg/ml l-氨基酸脱氨酶、1mg/ml n-甲基氨基酸脱氢酶、0.4mg/ml甲酸脱氢酶、10mm l-异亮氨酸、20mm甲胺、30mm甲酸钠、1mm nadp

以及50u/ml过氧化氢酶在ph 9.5的na2co
3-nahco3缓冲液中进行多酶级联催化反应，37℃、160rpm反应12h。
69.实施例11：产物的检测方法
70.利用高效液相色谱法(hplc)检测实施例5～10中的l-氨基酸以及n-甲基-l-氨基酸，检测条件：色谱柱为大赛璐cr( )；流动相为ph 1.1～1.25高氯酸水溶液；检测波长210nm；柱温30℃；流量0.5ml/min；进样量20μl。利用该液相检测方法，测定多酶级联催化l-氨基酸生成相应n-甲基-l-氨基酸的转化率，检测结果如图5和表1所示。
71.表1 多酶级联催化多种l-氨基酸生成相应n-甲基-l-氨基酸的转化率结果
[0072][0073][0074]
注：
[0075]“*”：底物转化率＝(c
0-c
底物
)/c0×
100％；
[0076]
式中，c0表示反应起始底物的摩尔浓度，mm；c
底物
表示反应t时间后底物的摩尔浓度，mm；
[0077]“**”：产物转化率＝c
产物
/c
理论
×
100％；
[0078]
式中，c
产物
表示反应t时间后目标产物的摩尔浓度，mm；c
理论
表示目标产物的理论摩尔浓度，mm。
[0079]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。