新型冠状病毒多种变异株核酸质谱检测的引物组合、试剂盒及检测方法与流程

1.本发明涉及分子生物学检测技术领域。更具体地，涉及一种新型冠状病毒多种变异株 核酸质谱检测的引物组合、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.对于新冠病毒的核酸检测，目前的主要方法是荧光定量rt-pcr方法。由于荧光通道的 限制，一次只能对新冠病毒进行n，orf1ab的两个靶标进行检测，不能进行有效分型，尤 其在低病毒载量条件下，容易出现单阳性，假阴性的情况。ngs高通量测序也是对新冠病 毒检测的一种重要技术，通过全测序可以实现病毒及亚型的准确鉴定，但是整体流程时间 长，不能快速给出病毒检测结果；而且实验操作复杂，样本检测成本高。而在疫情大面积爆 发时，能够对感染者或携带者快速准确检测诊断对于疫情防控具有至关重要的作用及意义， 因此，迫切需要一种特异性高、灵敏度高、高通量且操作相对简单的低成本的检测方法来对 新冠病毒变异株进行检测鉴定与进一步分型。
3.

技术实现要素：

4.本发明的一个目的在于提供一种用于新型冠状病毒多种变异株核酸质谱检测的引物 组合及包含这些引物组合的检测试剂盒，提高对新型冠状病毒的筛查诊断能力。
5.本发明的另一个目的在于提供一种利用上述试剂盒进行新型冠状病毒多种变异株核 酸质谱检测的方法。该方法使得新型冠状病毒检测特异性强，灵敏度高。
6.为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种用于新型冠状病毒多种变异株核酸质谱检测的引物组合， 包括16条扩增引物和9条质量探针延伸引物，其中，扩增引物的核苷酸序列如seq idno.1-16所示，具体见表1；质量探针延伸引物的核苷酸序列如seq id no.17-25所示，具 体见表2。
8.表1扩增引物序列
9.[0010][0011]
表2质量探针延伸(mpe)引物序列
[0012][0013]
本发明将多重pcr技术与maldi-tof质谱技术相结合，即采用pcr-微测序进行 新型冠状病毒核酸检测以及多个变异株的分型检测。在本发明中，通过对新型冠状病毒多 种变异株进行序列分析，针对选定的检测靶基因和特异性突变位点，设计了一系列检测新 型冠状病毒变异毒株的pcr扩增引物和质量探针延伸(mpe)引物。其中，本发明选择新 型冠状病毒基因n，orf1ab，s-d614g作为通用靶标基因，以至少两个基因检出作为新 型冠状病毒阳性判断标准；同时选择新型冠状病毒多种变异株的特异性突变位点作为分型 检测靶标，实现对新型冠状病毒变异株的分型检测，本发明还设置了内参基因人rnasep， 大大提高检测灵敏度，并可实现短时间内高通量检测，更适合应用于大规模的病毒疑似病 例的检测筛查。
[0014]
本发明还提供了上述引物组合在制备新型冠状病毒多种变异株核酸质谱检测产品中 的应用。
[0015]
根据本发明的具体实施方式，本发明提供一种新型冠状病毒多种变异株核酸质谱检测 试剂盒，该试剂盒包括上述引物组合。
[0016]
进一步的，所述试剂盒还包括rt-pcr反应试剂、去磷酸化反应试剂及质量探针延伸 反应试剂。
[0017]
第二方面，本发明提供一种新型冠状病毒多种变异株核酸质谱检测方法，该方法使用 上述试剂盒，具体包括：
[0018]
(1)利用16条扩增引物对待测样本进行rt-pcr扩增反应；
[0019]
(2)对步骤(1)得到的扩增产物利用碱性磷酸酶进行去磷酸化处理；
[0020]
(3)利用9条质量探针延伸引物对步骤(2)得到去磷酸化产物进行单碱基延伸；
[0021]
(4)对步骤(3)得到的延伸产物进行树脂脱盐纯化；
[0022]
(5)质谱检测，确定变异株分型。
[0023]
进一步的，所述新型冠状病毒多种变异株为alpha变异株、beta变异株、delta变异株 或lambda变异株。
[0024]
进一步的，所述质谱检测采用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱maldi-tofms。
[0025]
进一步的，所述碱性磷酸酶为虾碱性磷酸酶。
[0026]
本发明的有益效果如下：
[0027]
本发明通过多重pcr技术与maldi-tof技术联用，采用pcr-maldi微测序方法， 使用本发明的特异性的引物组合，能够实现在对新型冠状病毒进行检测的同时，还能进一 步对四种变异株进行分型鉴定。其中部分检测位点pcr引物共用，减少了引物合成成本。 检测结果上，准确性好，特异性强，灵敏度高，样本检出限为10copies/μl，可以显著减少 假阳性结果，提高对低载量病毒样本进行检测和鉴定。检测通量高，每次可检测96/384 个样本，更适合于大规模的新冠病毒病例筛查。
附图说明
[0028]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0029]
图1示出多重pcr扩增引物和mpe引物的特异性验证结果。
[0030]
图2示出精密度实验阳性质粒的扩增质谱图。
[0031]
图3示出202101样本的delta位点阳性质谱图。
[0032]
图4示出202102样本的delta位点阴性质谱图。
[0033]
图5示出202102样本的新冠orf1ab位点阳性质谱图。
[0034]
图6示出202103样本的delta位点阳性质谱图。
[0035]
图7示出202104样本的delta位点阴性质谱图。
[0036]
图8示出202105样本的delta位点阳性质谱图。
具体实施方式
[0037]
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附 图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述 的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0038]
实验过程中使用的试剂及仪器：
[0039]
viral rna mini kit(52904)：凯杰企业管理(上海)有限公司；
成500μm的储存液。将引物储存液取出混合，配置成每个位点引物终浓度5μm-15μm范 围的引物混合液。
[0059]
3.rt-pcr反应
[0060]
(1)利用核酸检测试剂盒(病原微生物)(qt-sj12-rts)配置rt-pcr体系，具体见 表4。
[0061]
表4 rt-pcr体系配置表
[0062]
试剂组分体积(μl)rt-pcr酶1rt-pcr预混液12.5pcr引物混合液5模板6.5total25
[0063]
(2)按表5运行rt-pcr程序。
[0064]
表5 rt-pcr温控反应程序
[0065][0066]
(3)反应结束后，取出5μl扩增产物进行后续实验反应。
[0067]
4.虾碱性磷酸酶(sap)去磷酸化处理
[0068]
(1)利用核酸检测试剂盒(病原微生物)(qt-sj12-rts)配置sap反应体系。按表 6配置sap反应液。
[0069]
表6 sap体系配置表
[0070]
试剂组分体积(μl)sap酶0.3sap缓冲液0.17h2o1.53total2
[0071]
表6 sap体系配置表
[0072]
(2)将2μl sap反应液加入到上一步取出的5μl扩增产物中，放置到pcr仪上运行 sap去磷酸化反应。
[0073]
表7 sap温控反应程序
的检测结果。重要的参数设定为：snr：4.0。
[0091]
实施例3特异性实验
[0092]
1.引物组合无模板扩增验证引物特异性。首先使用水代替样本模板，参见实施例2 运行rt-pcr反应到树脂脱盐纯化的实验全流程，这一步是验证多重pcr扩增引物和多重 mpe引物之间没有二聚体，无非特异性扩增延伸产物，保证引物设计的特异性。实验结果 见图1。
[0093]
2.使用其他病原体验证引物特异性。常见的导致呼吸道感染的还有其他病毒(如甲流， 乙流等)，细菌肺炎支原体，衣原体等。本次实验使用了flu a样本，adv样本，肺炎支 原体，验证测试了没有任何新冠靶标检出，因此保证了其他病原微生物不会非特异性地报 出错误的检测结果。
[0094]
实施例4灵敏度和精密度实验
[0095]
(1)灵敏度验证结果：
[0096]
分别使用水对实施例的质粒干粉进行10倍浓度梯度稀释，浓度分别为105copies/μl， 104copies/μl，103copies/μl，102copies/μl，101copies/μl，100copy/μl。六个浓度的质粒 模板分别进行扩增和延伸。最后结果是新型冠状病毒的检测下限为10copies/μl。具体见表 10。
[0097]
表10新冠病毒检测位点及变异株位点的检测下限
[0098][0099][0100]
(2)精密度验证结果：
[0101]
使用质粒浓度100copies/μl，每次实验3个重复，连续2周共完成6次重复实验，9 个产物都能检出，检测结果稳定。见图2。
[0102]
实施例5样本检测
[0103]
参加新冠病毒德尔塔变异株核酸检测室间质评，取得5份质评样本。采用凯杰病毒提 取试剂盒(viral rna mini kit(52904))进行核酸提取，依照实施例2的方法进行了新型冠 状病毒核酸质谱检测。
[0104]
结果见表11和图3-图8，成功检测到4组阳性样本。说明引物组准确性好，特异性 高。
[0105]
表11 5个质评样本的检测结果
[0106][0107]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发 明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做 出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的 技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。