一种刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法与流程

1.本发明属于软骨组织分化技术领域，具体涉及一种刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法。


背景技术：

2.由于软骨细胞是终末分化细胞，自我修复的能力有限，因此，外伤或骨关节炎等疾病所致的软骨缺损的治疗一直是骨科的难题。近年来，随着细胞移植或软骨组织工程技术的发展，软骨缺损的治疗已取得了一定的进步。自体软骨细胞移植是目前公认的治疗关节软骨缺损的较有效的方法。但自体软骨细胞移植也有很多缺点:
①
自体软骨细胞来源困难。由于自体软骨细胞移植时先要从关节的非负重区取一定大小的软骨块，因此它必然导致供区新的缺损。
②
操作过程较繁琐，病人一定要承受两次手术的创伤。
③
软骨细胞在体外扩增缓慢，容易发生去分化，即向成纤维细胞分化，从而使新生软骨的性能不良。
3.关节液间充质干细胞(sf
‑
mscs)是目前备受关注的一类具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞，可以分化为中胚层起源的多种组织细胞，比如：成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。sf
‑
mscs的多潜能性和旁分泌特性使其成为再生医学理想的候选细胞。近年来研究发现，sf
‑
mscs具有较低的免疫原性，还具有抑制免疫细胞的作用，在诱导移植耐受方面发挥重要作用。sf
‑
mscs具有细胞来源丰富，损伤轻，可避免体内免疫排斥反应及根据不同需要进行调控等优点，因此，sf
‑
mscs是组织工程的重要种子细胞。
4.sf
‑
mscs体外转化很大程度上依赖于培养条件，寻找合适的培养条件是诱导sf
‑
mscs向软骨细胞分化的关键。目前的sf
‑
mscs分化成软骨细胞的方法所需的周期都较长，并且刺激诱导后ii型胶原的表达效率较低，进而导致在治疗关节炎和在促进软骨修复能力效果不佳。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法，解决了现有技术中的间充质干细胞软骨组织分化周期长、表达效率较低以及在治疗关节炎和在促进软骨修复能力方面效果不佳的问题。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法，该方法包括以下步骤：
7.s1、将体外分离培养的树突状细胞加入tgf
‑
β3和ifn1&2中，得到浆细胞样树突状细胞；
8.s2、当所述浆细胞样树突状细胞的数量达到一定数量时，采用吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1诱导浆细胞样树突状细胞耐受性的表达，并确定所述浆细胞样树突状细胞耐受性的表达情况，得到耐受性浆细胞样树突状细胞；
9.s3、将所述耐受性浆细胞样树突状细胞与间充质干细胞共培养，使得间充质干细胞的软骨得到分化。
10.优选地，所述s1中，所述树突状细胞的体外分离培养方法具体为：将造血祖细胞置于包括8～12％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素/链霉素、18～22ng/ml gm
‑
csf和18～22ng/ml il
‑
4的dmem溶液中，培养4～6天，收集培养得到的树突状细胞。
11.优选地，所述s1中，所述tgf
‑
β3的浓度为8～12ng/ml；所述ifn1&2的浓度为18～22ng/ml。
12.优选地，所述s2中，所述一定数量为(0.5～1.5)
×
105个。
13.优选地，所述s2中，所述吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1的浓度为8～12ng/ml。
14.优选地，所述s2中，所述诱导的时间不低于3天。
15.优选地，所述s2中，采用qpcr和流式细胞术确定所述浆细胞样树突状细胞耐受性表达的情况。
16.优选地，所述s3中，所述共培养的时间大于两周。
17.优选地，所述s3中，所述间充质干细胞为关节液间充质干细胞；所述关节液间充质干细胞是通过以下方法获得的：从关节置换手术中获取关节滑液，将所述关节滑液在1500～2500rpm的条件下离心4～6min，去除上清液，得到关节液间充质干细胞。
18.优选地，所述s3中，将所述耐受性浆细胞样树突状细胞与间充质干细胞共培养的具体方法为：将所述耐受性浆细胞样树突状细胞与关节液间充质干细胞于包含8～12％胎牛血清和0.8～1.2％青霉素/链霉素的msc基础培养基中共培养至少2周，且每至少5天更新一次培养基。
19.与现有技术相比，本发明通过采用耐受性浆细胞样树突状细胞刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法，不仅有效的减少间充质干细胞软骨组织分化的周期，而且还提高了蛋白质的表达效率，同时为在治疗关节炎和促进软骨修复能力方面奠定了坚实的基础。
附图说明
20.图1为本发明实施例提供的刺激间充质干细胞软骨组织分化的工艺流程图；
21.图2为本发明实施例中使用ido1产生耐受性pdc细胞的表面标记表达的结果示意图；
22.图3为本发明实施例中在pdc细胞中通过ido1增加抗炎因子表达的结果示意图；
23.图4为本发明实施例中在关节滑液干细胞中tpdc细胞促进蛋白多糖表达的结果示意图；
24.图5为本发明实施例中在关节滑液干细胞中tpdc细胞促进软骨标记表达的结果示意图。
具体实施方式
25.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
26.以下实施例中所使用的细胞和助剂均可通过提取、购买和自制获得。
27.本发明实施例提供的一种刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法，该方法包括以下步骤：
28.s1、将体外分离培养的树突状细胞加入浓度为8～12ng/ml的tgf
‑
β3和浓度为18～22ng/ml的ifn1&2中，得到浆细胞样树突状细胞；其中，所述树突状细胞的体外分离培养方法具体为：将造血祖细胞置于包括8～12％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素/链霉素、18～22ng/ml gm
‑
csf和18～22ng/ml il
‑
4的dmem溶液中，培养4～6天，收集培养得到的树突状细胞；
29.s2、当所述浆细胞样树突状细胞的数量达到(0.5～1.5)
×
105个时，采用浓度为8～12ng/ml的吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1诱导浆细胞样树突状细胞耐受性的表达，诱导的时间不低于3天，并采用qpcr和流式细胞术确定浆细胞样树突状细胞耐受性表达的情况，得到耐受性浆细胞样树突状细胞；
30.s3、将所述耐受性浆细胞样树突状细胞与关节液间充质干细胞于包含8～12％胎牛血清和0.8～1.2％青霉素/链霉素的msc基础培养基中共培养至少2周，且每至少5天更新一次培养基，使得间充质干细胞的软骨得到分化；其中，所述关节液来源的间充质干细胞是通过以下方法获得的：从关节置换手术中获取关节滑液，将关节滑液在1500～2500rpm的条件下离心4～6min，去除上清液，得到关节液间充质干细胞。
31.以下为具体实施例
32.实施例1
33.本发明实施例1提供的一种刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法具体为(如图1所示)：
34.s1、将体外分离培养的树突状细胞加入浓度为10ng/ml的tgf
‑
β3和浓度为20ng/ml的ifn1&2中，得到浆细胞样树突状细胞；其中，所述树突状细胞的体外分离培养方法具体为：将造血祖细胞置于包括10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、20ng/ml gm
‑
csf和20ng/ml il
‑
4的dmem溶液中，培养5天，收集培养得到的树突状细胞；
35.s2、当浆细胞样树突状细胞的数量达到1.0
×
105个时，采用浓度为10ng/ml的吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1诱导浆细胞样树突状细胞耐受性的表达，诱导的时间为3天，得到耐受性浆细胞样树突状细胞；
36.s3、将1x106个耐受性浆细胞样树突状细胞与1x106个关节液间充质干细胞于包含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的msc基础培养基中共培养2周，且每5天更新一次培养基，使得关节液间充质干细胞的软骨得到分化；
37.其中，所述关节液来源的间充质干细胞是通过以下方法获得的：从关节置换手术中获取关节滑液，将关节滑液在2000rpm的条件下离心5min，去除上清液，得到关节液间充质干细胞。
38.实施例2
39.本发明实施例2提供的一种刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法具体为：
40.s1、将体外分离培养的树突状细胞加入浓度为8ng/ml的tgf
‑
β3和浓度为18ng/ml的ifn1&2中，得到浆细胞样树突状细胞；其中，所述树突状细胞的体外分离培养方法具体为：将造血祖细胞置于包括8％胎牛血清、0.8％青霉素/链霉素、18ng/ml gm
‑
csf和18ng/ml il
‑
4的dmem溶液中，培养4天，收集培养得到的树突状细胞；
41.s2、当所述浆细胞样树突状细胞的数量达到1.0
×
105个时，采用浓度为8ng/ml的吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1诱导浆细胞样树突状细胞耐受性的表达，诱导的时间为3天，得到
耐受性浆细胞样树突状细胞；
42.s3、将1x106个耐受性浆细胞样树突状细胞与1x106个关节液间充质干细胞于包含8％胎牛血清和0.8％青霉素/链霉素的msc基础培养基中共培养2周，且每5天更新一次培养基，使得关节液间充质干细胞的软骨得到分化；其中，所述关节液来源的间充质干细胞的获得方法与实施例1中的相同。
43.实施例3
44.本发明实施例3提供的一种刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法具体为：
45.s1、将体外分离培养的树突状细胞加入浓度为12ng/ml的tgf
‑
β3和浓度为22ng/ml的ifn1&2中，得到浆细胞样树突状细胞；其中，所述树突状细胞的体外分离培养方法具体为：将造血祖细胞置于包括12％胎牛血清、1.2％青霉素/链霉素、22ng/ml gm
‑
csf和22ng/ml il
‑
4的dmem溶液中，培养6天，收集培养得到的树突状细胞；
46.s2、当所述浆细胞样树突状细胞的数量达到1.0
×
105个时，采用浓度为12ng/ml的吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1诱导浆细胞样树突状细胞耐受性的表达，诱导的时间为3天，得到耐受性浆细胞样树突状细胞；
47.s3、将1x106个耐受性浆细胞样树突状细胞与1x106个关节液间充质干细胞于包含12％胎牛血清和1.2％青霉素/链霉素的msc基础培养基中共培养2周，且每5天更新一次培养基，使得关节液间充质干细胞的软骨得到分化；其中，所述关节液来源的间充质干细胞的获得方法与实施例1中的相同。
48.实施例4
49.本发明实施例4提供的一种刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法具体为：
50.s1、将体外分离培养的树突状细胞加入浓度为8ng/ml的tgf
‑
β3和浓度为22ng/ml的ifn1&2中，得到浆细胞样树突状细胞；其中，所述树突状细胞的体外分离培养方法具体为：将造血祖细胞置于包括8％胎牛血清、1.2％青霉素/链霉素、18ng/ml gm
‑
csf和22ng/ml il
‑
4的dmem溶液中，培养5天，收集培养得到的树突状细胞；
51.s2、当所述浆细胞样树突状细胞的数量达到1.0
×
105个时，采用浓度为8ng/ml的吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1诱导浆细胞样树突状细胞耐受性的表达，诱导的时间为3天，得到耐受性浆细胞样树突状细胞；
52.s3、将1x106个耐受性浆细胞样树突状细胞与1x106个关节液间充质干细胞于包含8％胎牛血清和1.2％青霉素/链霉素的msc基础培养基中共培养2周，且每5天更新一次培养基，使得关节液间充质干细胞的软骨得到分化；其中，所述关节液来源的间充质干细胞的获得方法与实施例1中的相同。
53.实施例5
54.本发明实施例5提供的一种刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法具体为：
55.s1、将体外分离培养的树突状细胞加入浓度为12ng/ml的tgf
‑
β3和浓度为18ng/ml的ifn1&2中，得到浆细胞样树突状细胞；其中，所述树突状细胞的体外分离培养方法具体为：将造血祖细胞置于包括12％胎牛血清、0.8％青霉素/链霉素、22ng/ml gm
‑
csf和18ng/ml il
‑
4的dmem溶液中，培养5天，收集培养得到的树突状细胞；
56.s2、当所述浆细胞样树突状细胞的数量达到1.0
×
105个时，采用浓度为12ng/ml的吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1诱导浆细胞样树突状细胞耐受性的表达，诱导的时间为3天，得到
耐受性浆细胞样树突状细胞；
57.s3、将1x106个耐受性浆细胞样树突状细胞(tpdcs)与1x106个关节液间充质干细胞(sf
‑
mscs)于包含12％胎牛血清和1.2％青霉素/链霉素的msc基础培养基中共培养2周，且每5天更新一次培养基，使得关节液间充质干细胞的软骨得到分化；其中，所述关节液来源的间充质干细胞的获得方法与实施例1中的相同。
58.为了验证本发明提供的采用耐受性浆细胞样树突细胞刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法的具体效果如下，现对实施例1得到的分化后的关节液间充质干细胞的软骨进行检测，具体检测内容如下：
59.待采用实施例1中所述的方法培养完成后，去除耐受性浆细胞样树突状细胞(tpdcs)，用游离血清dmem培养基洗涤关节液间充质干细胞(sf
‑
mscs)，用新蓝染料和光学显微镜观察关节液间充质干细胞(sf
‑
mscs)蛋白多糖的积累情况。采用qpcr和免疫荧光法检测sox9基因、col2a1基因和aggrecan基因的表达，具体检测结构图2
‑
图5所示。
60.从图2中的数据结果可知，通过使用吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1(ido1)能够有效的增加浆细胞样树突状细胞pdc的耐受性，进而也使cd123蛋白的表达效率高达93.5％；成熟的cd80蛋白的表达效率为3.88％；从而可以确定：通过采用吲哚胺2，3双加氧酶ido1能有效的提高浆细胞样树突状细胞pdc的耐受性，且具有提高cd123蛋白的表达和抑制cd80蛋白的表达的功效，进而确保了产生的细胞是耐受性pdc细胞；
61.从图3中的数据结果可知，当采用吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1(ido1)诱导加强浆细胞样树突状细胞pdc的耐受性，获得耐受性浆细胞样树突状细胞pdcs的过程中，还具有增加抗炎因子的功能。
62.具体地说，通过分析图3a可知，当采用吲哚胺
‑
2，3
‑
双加氧酶
‑
1(ido1)诱导加强浆细胞样树突状细胞pdc的耐受性时，具有提高tgf
‑
β1表达效率和降低ifn
‑
γ和il
‑
6的表达效率的功能；通过分析图3b可知，还能够提高pdcs细胞中lps的炎症因子和增加ifn
‑
γ的表达效率，同时还会降低tgf
‑
β1的表达效率；通过分析图3c
‑
3d可知，还能够增加pdcs细胞中tgf
‑
β1和tgf
‑
β3的表达，降低ifn
‑
γ和il
‑
1β的表达。
63.从图4中的数据结果可知，通过关节滑液msc干细胞和tpdcs细胞一起培养(如图4a)，蛋白多糖的积累明显增加了(如图4c)；而具有炎症的cdc细胞和sf
‑
mscs(如图4b)能够有效的防止蛋白多糖的表达(如图4d)。
64.从图5中的数据结果可知，当将耐受性pdcs细胞和sf
‑
mscs一起培养促进干细胞软骨分化后：从图5a和5b中可知，tpdcs不仅具有促进sox9、col2a1、aggrecan基因表达的功能；而且还具有促进sox9、col2a1、aggrecan蛋白表达的功能。
65.终上所述，本发明通过采用耐受性浆细胞样树突状细胞刺激间充质干细胞软骨组织分化的方法，不仅有效的减少间充质干细胞软骨组织分化的周期，而且还提高了蛋白质的表达效率，同时为在治疗关节炎和促进软骨修复能力方面奠定了坚实的基础。
66.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。