一种SARS-CoV-2的RBD的抗原表位肽及其应用

一种sars-cov-2的rbd的抗原表位肽及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及病毒抗原技术领域，尤其涉及一种 sars-cov-2的rbd的抗原表位肽及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2，简称新冠)感染危害严重，且疫情仍呈全球性持续性发展，给我国的疫情防控带来严峻挑战。
3.由于目前尚无特效的新冠治疗药物，疫苗是控制新冠感染的理想选择。尽管 当前已有数种新冠疫苗上市，但新冠病毒变异新毒株如delta株和omicron株 等不断出现，使现有疫苗接种的有效性和持久性面临挑战。新冠感染主要初始部 位是呼吸道粘膜，而目前已有的新冠疫苗大多数是通过肌肉注射(简称肌注)免 疫，其诱导的呼吸道粘膜免疫应答有限，且肌注免疫可能无法及时阻止宿主粘膜 部位的病毒传播。选择合适的佐剂及免疫途径同时诱导呼吸道粘膜及全身性免 疫应答是新冠疫苗急需解决的关键问题。解析sars-cov-2重要抗原在不同佐剂 及免疫途径下诱发保护性应答的有效成分及其免疫应答机制，是解决该科学问 题的基础和前提。
4.刺突蛋白(spike protein，简称s蛋白或spike蛋白)是sars-cov-2的 重要结构蛋白，是现有新冠疫苗中除灭活疫苗外的其他疫苗的抗原成分。spike 蛋白含有s1和s2两个亚基，其中s1亚基的c端含有受体结合结构域(receptorbinding domain，简称rbd结构域)，spike蛋白通过其rbd结构域识别宿主细 胞表面的受体血管紧张素转化酶e2(ace2)，介导病毒进入宿主细胞，rbd结构 域的氨基酸变异会导致病毒的种属特异性和感染特性的变化。rbd含有整个 sars-cov-2病毒中最具免疫显性的中和表位，covid-19恢复者血清中90％的中 和性抗体都由rbd诱导产生。靶向rbd的中和性抗体具有预防和治疗sars-cov
‑ꢀ
2感染的潜在价值。rbd可规避s1亚基的ntd结构域抗体引起ade效应。此外， rbd性质稳定、易于重组表达和纯化制备，因此是新冠疫苗的理想抗原。
5.研究证实，具有中和能力的抗体在新冠病毒的防护中发挥保护作用。sars
‑ꢀ
cov-2的中和抗体的滴度与临床结局相关。由于蛋白抗原发挥其功能主要通过其 中的表位来体现特异性，其中发挥主要作用的是“免疫优势”表位。因此，rbd 抗原中免疫优势应答的保护性表位的鉴定，是提升和优化基于rbd抗原的sars
‑ꢀ
cov-2疫苗设计的重要前提。筛选rbd的免疫优势表位，是激发更有效的rbd免 疫应答的前提。目前的已知的rbd的b细胞表位，或通过生物信息学软件推测， 或通过单克隆抗体鉴定，或使用人或动物免疫模型中鉴定，尚未有关于在不同免 疫途径中全面筛选参与免疫应答的rbd的“优势表位”的报道。由于新冠病毒的 初始感染部位主要是呼吸道黏膜，因此，亟需建立一种准确有效的筛选及鉴定在
ꢀ“
滴鼻途径”下参与免疫应答的rbd的b细胞“优势表位”的方法。


技术实现要素：

6.本发明针对现有技术存在的上述问题，提供了一种sars-cov-2的rbd的抗 体优势表位肽的鉴定方法，以及该表位肽在制备用于诊断、预防和/或治疗sars
‑ꢀ
cov-2感染的药物中的应用。
7.本发明首先提供了一种sars-cov-2的rbd的抗原表位肽，包含氨基酸序列 为seq id no:11和/或seq id no:17的抗原优势表位。
8.在根据本发明的一个实施方案中，所述抗原表位肽n端或c端偶联有多肽 标记；优选地，所述多肽标记为生物素标记或荧光标记。
9.本发明进一步提供了上述的抗原表位肽在制备sars-cov-2感染的特异抗体 诊断试剂中的应用。
10.本发明还提供了上述的抗原表位肽在制备用于预防或治疗sars-cov-2感染 的疫苗中的应用。
11.本发明进一步提供了上述的抗原表位肽作为抗sars-cov-2感染药物筛选靶 标的应用。
12.在根据本发明的一个实施方案中，还提供了一种用于预防或治疗sars-cov
‑ꢀ
2感染的药物组合物，其包含上述的抗原表位肽和药学上可接受的辅料。
13.在根据本发明的一个实施方案中，还包含佐剂，所述佐剂优选为addavax。
14.在根据本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为经鼻施用的剂型；优选 为喷雾剂、滴鼻剂、粉末剂、凝胶制剂或微球制剂。
15.本发明进一步提供了一种用于sars-cov-2感染的诊断试剂，其包含上述的 抗原表位肽，所述抗原表位肽包被于检测载体上，所述检测载体选自聚苯乙烯微 量反应板、胶体金试剂条、磁珠和微流控芯片中的任一种。
16.在根据本发明的一个实施方案中，还包含特异性识别鼠igg抗体的第二抗 体；
17.优选地，所述第二抗体选自羊抗鼠单克隆抗体、兔抗鼠多克隆抗体中的一种；
18.优选地，所述第二抗体偶联有激活或猝灭所述特异性荧光基团的配合基团。
19.本发明的上述技术方案的有益效果如下：
20.本发明方法所得到的rbd抗体免疫优势表位肽具有抑制rbd和人血管紧张 素转换酶2(ace2)结合的效应，可以用于制备预防sars-cov-2感染的高效、 低毒、高安全性的基于rbd的药物，如预防型疫苗。
21.本发明提供的sars-cov-2的rbd的抗体优势表位肽有抑制rbd和人血管紧 张素转换酶2(ace2)结合的效应，用该优势表位免疫动物，免疫制剂无无关成 分或有害成分，以该抗体优势表位肽制备的特异性单克隆抗体可以较好地的预 防sars-cov-2感染。
22.经序列比对分析，本发明提供的sars-cov-2的rbd的抗体优势表位肽在多 种sars-cov-2毒株中序列保守，因此，其也可用作sars-cov-2的诊断试剂或 用于对其他sars-cov-2感染的预防和治疗。
附图说明
23.图1为使用rbd滴鼻免疫balb/c小鼠作为一抗对本发明筛选到的重叠肽进 行elisa检测的结果图谱；
24.图2为使用rbd滴鼻免疫balb/c小鼠的血清特异性igg抗体效价图谱；
25.图3为使用rbd滴鼻免疫balb/c小鼠的血清特异性igg抗体亚型图谱；
26.图4为本发明筛选到的rbd免疫balb/c小鼠的抗血清抑制rbd和人血管紧 张素转换酶2(ace2)结合的效应能力分析中和抗体滴度结果图谱；
27.图5为本发明筛选到的rbd免疫balb/c小鼠的抗血清抑制rbd和人血管紧 张素转换酶2(ace2)结合的效应能力分析血清稀释倒数图结果图谱；
28.图6为本发明筛选到的抗体免疫优势表位肽rbd
61-78
、rbd
97-114
在rbd三维结 构中的位置分布分析结果图谱；
29.图7为本发明筛选到的抗体免疫优势表位肽rbd
61-78
、rbd
97-114
的氨基酸序列 保守性分析结果图谱。
具体实施方式
30.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图 及具体实施例进行详细描述。
31.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例 中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.实施例1重叠肽的获得
33.以rbd蛋白序列(sequence id:6xdg_e)为基础，相对于预期的重叠肽的长 度，每次向下游移动小于重叠肽的长度的氨基酸个数，再次获得另一条预期的重 叠肽。其中，预期的重叠肽的长度可以为15-30个氨基酸，每次步移的氨基酸个 数可以为4-8个，本实施例中从第1号氨基酸开始，每次步移6个氨基酸，合 成步移重叠的18个氨基酸多肽(上海吉尔生化科技有限公司)，共得到35条 重叠肽。纯度均大于95％。合成的步移重叠肽信息如表1所示。将合成肽段用二 甲亚砜(dmso)溶解至1mg/ml的储存浓度，分装后-70℃冻存，临用时用pbs稀 释成1mm。
34.表1步移重叠肽信息
[0035][0036]
实施例2 rbd免疫血清的收集和保存
[0037]
突变seb三个毒素位点的重组seb全蛋白由基于参考文献所公开的方法构 建获得
(参考文献：jintaozou et al.a-hemolysin-aided oligomerizationof the spike protein rbd resulted in improved immunogenicity andneutralization against sars-cov-2 variants ariants.front immunol.2021 sep 24；12:757691.)，免疫小鼠的rbd蛋白剂量调整至20ug/只,佐剂addavax 剂量为50μl，免疫途径为滴鼻免疫,经0、14、21天免疫三次。测抗血清效价， 选择rbd效价大于1：64000的小鼠免疫血清用于后续检测。
[0038]
实施例3 rbd的b细胞免疫优势表位的筛选
[0039]
调整重叠肽包被浓度5μg/孔(以全蛋白rbd(ssequence id:6xdg_e)为阳 性对照)，对孔板进行包被-洗涤-封闭-再次洗涤后，加入实施例2获得的rbd 免疫抗血清，稀释度为1:50，孵育1.5h-洗涤后，加入hrp-羊抗小鼠igg(购自 恩晶生物，货号e1wp319)，稀释度为1:5000，洗涤后加入tmb底物显色液(购 自beyotime/碧云天，货号p0209-100ml)，终止反应后在450nm处读od值，按 照公式18氨基酸重叠肽od检测值-空白对照检测值)/(阴性肽od检测值-空白 对照检测值)≥2.1为阳性重叠肽。经spss16.0数据检验，获得相对于其他阳 性重叠肽读数具有显著统计学意义的阳性重叠肽，定义为b细胞的免疫优势表 位肽，也即免疫优势表位肽。无关肽ova
192
–
201
(seq id no:36edtqampfrv)为阴 性对照肽。
[0040]
结果：如图1所示，有2个阳性多肽rbd
61-78
(seq id no:11 cygvsptklndlcftnvy)、rbd
97-114
(seq id no:17tgkiadynyklpddftgc)相对于 其他优势肽读数具有显著统计学意义，定义为优势表位，该图中ova
192-201
为阴性 无关肽；通过该方法不仅筛选获得了rbd的所有b细胞表位，而且明确了rbd的 b细胞优势表位。
[0041]
实施例4 rbd免疫小鼠的抗血清抑制rbd和人血管紧张素转换酶2(ace2) 结合的效应能力分析；
[0042]
rbd的蛋白在addavax佐剂(购自invivogen)辅助下于第0，14，21天经 三次肌注免疫6-8周balb/c小鼠，末次免疫后第7天，尾静脉收集抗血清。
[0043]
为评价rbd的免疫原性，将实例2中所述rbd蛋白辅以addavax佐剂后滴 鼻途经免疫小鼠，三免后小鼠尾静脉血样采集，进行rbd特异性抗体水平检测。 免疫小鼠血清的rbd特异性igg抗体效价结果如图2所示，免疫组血清rbd特 异性igg抗体几何平均效价增加至约106。其中，rbd特异性igg抗体效价log10 对数值为5.95
±
0.2375(p《0.05)。上述结果表明：rbd辅以addavax佐剂滴鼻 免疫，可以诱导高水平的rbd特异性抗体。
[0044]
免疫小鼠血清的rbd特异性igg抗体亚型分析结果如图3所示，rbd特异性 igg抗体主要以igg1亚型为主。
[0045]
首先通过竞争elisa方法检测了中和抗体滴度，以评价rbd诱导的功能性 抗体水平。竞争抑制试验使用试剂盒操作(anti-sars-cov-2 neutralizingantibody titer serologic assay kit，购自acrobiosystems,beijing, china)。免疫小鼠的血清样本以1:10稀释，并与0.3μg/ml hrp-sars-cov-2 刺突蛋白的rbd混合，进行重复分析。酶标仪在450nm处检测光密度值(od值)， 根据公式(1-样品平均od值/阴性对照平均od值)
×
100％计算中和抑制率。结 果如图4所示，20μg rbd 3次免疫后诱导的抗体nt50(titers of 50％ neutralization，50％中和滴度)达到1:3412(p《0.05)，血清稀释倒数图如图 5所示。上述结果说明：rbd辅以addavax佐剂滴鼻免疫，所诱导的高水平的rbd 特异性抗体具有竞争抑制rbd结合人血管紧张素转换酶2的中和能力。
[0046]
实施例5免疫优势表位肽在rbd全蛋白三维结构中的位置
[0047]
本实施例用于说明抗体免疫优势表位肽在rbd全蛋白三维结构中的位置分 布分析结果。
[0048]
在pubmed蛋白公开数据库下载已报道rbd蛋白的3d结构图，用pymol 1.1 program软件标注实验中筛选出的免疫优势表位肽的序列位置。
[0049]
结果如图6所示，该优势肽rbd
61-78
、rbd
97-114
分别位于rbd三维晶体结构的 不同loop区，可见，该优势表位肽序列(抗体优势表位)是rbd表位疫苗的可 靠候选分子。
[0050]
实施例6免疫优势表位肽在sars-cov-2各毒株中的氨基酸序列保守性分 析
[0051]
本实施例用于本发明筛选到的抗体免疫优势表位肽rbd
61-78
、rbd
97-114
的氨基 酸序列保守性分析结果。
[0052]
在genbank数据库检索30株sars-cov-2各毒株的rbd蛋白的氨基酸序列， 用ncbi的basic local alignment search tool(blast)软件进行氨基酸序列 比对分析，随机选择30株sars-cov-2毒株进行多序列比对(multiplealignment)，网站地址为https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi。
[0053]
结果如图7所示，该优势肽rbd
61-78
、rbd
97-114
在30种sars-cov-2各毒株中 的氨基酸序列保守，因此具有良好的应用前景。
[0054]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这 些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。