靶向GD2的CAR-T细胞及其制备和应用的制作方法

靶向gd2的car-t细胞及其制备和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种靶向gd2的car-t细胞及其制备和应用。


背景技术：

2.神经母细胞瘤是一种儿童最常见的实体肿瘤。90％的肿瘤发生在10岁以下的儿童中，诊断中位年龄为18个月。神经母细胞瘤是交感神经发育过程中发生的一种神经内分泌性肿瘤，疾病的临床表现差异很大，婴幼儿时期肿瘤会有自发的消退现象，不需要进行治疗；而稍微大点的患者则有很大机率发生肿瘤的转移现象。尽管目前部分中低风险的神经母细胞瘤患者的生存率已经有所改善，但是对于那些高风险患者(年龄大于18岁的患者，根据疾病的转移程度和遗传因素确定)，其治疗效果仍然不是很理想。目前对于这一部分患者，最有效的治疗方案是在治疗中引入抗gd2单克隆抗体。
3.双唾液酸神经节苷脂gd2在多种小儿以及成人的肿瘤中高表达，包括神经母细胞瘤，脑胶质瘤，黑色素瘤等。gd2通常表达于胚胎发育期，在出生后的组织表达水平较低，并且主要局限于骨祖细胞，大脑，周围神经和皮肤黑素细胞等。鉴于上述gd2的特性，已经开发出了多种靶向gd2的治疗策略，包括特异性抗体，药物偶联以及嵌合抗原受体修饰的t细胞疗法等。
4.虽然引入抗gd2单克隆抗体可以提高患者的存活率，但是约有50％的患者最终还是会复发。这些患者则需要更有效和更具有针对性的疗法，比如嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t)疗法。近年来，car-t疗法在血液系统恶性肿瘤的治疗中展现出了广泛的前景，在神经母细胞瘤的研究中也展现出了一定的希望，malvina prapa等利用鼠源gd2抗体的scfv片段与4-1bb相连接，构建二代car结构研究gd2-car-t对神经母细胞瘤的抗肿瘤活性，取得了一定的疗效，证明了gd2作为靶点治疗神经母细胞瘤的可行性。但是利用上述car结构构建的car-t细胞毒性较低，体外低效靶比时细胞毒能力并不理想。sarah a.richman等将鼠源gd2抗体14g2a的scfv片段和4-1bb相连接，对vh进行了突变，提高了scfv片段的亲和力，同时增加v
l
和vh之间linker的长度，以改善scfv片段的稳定性。他们在此基础上分别构建了三种car结构，研究了不同car结构对于car-t细胞抗肿瘤活性的影响。他们的研究证明提高scfv片段亲和力可以有效的增强car-t细胞的抗肿瘤活性，但是却伴随着非常严重的“on-target,off-tumor tissue”副作用。而增加v
l
和vh之间linker的长度可以使car-t细胞有效的归巢至肿瘤部位，但是并不能提高car-t细胞的抗肿瘤活性，猜测可能是由于car-t细胞耗竭速度过快，不能持续的抑制肿瘤细胞的增殖。因而需要设计一种具有较高的细胞毒性，较低的副作用，同时又能持续高效的发挥抗肿瘤活性的car结构。
5.car结构通常包含三个部分：胞外的抗原结合位点，跨膜结构域(tm domain)和胞内的信号传导结构。tm结构域作用主要是将car结构锚定在细胞膜上，常见的为cd8和cd28等调节t细胞功能的分子。胞内的信号传导结构主要由一个或两个共刺激信号与cd3ζ相连接组成，常用的共刺激信号有cd28，4-1bb，ox40，icos等。2018年carl june在文章中首次报
道了在car结构中将icos与4-1bb联合使用，构建包含两个共刺激分子的三代car。他们研究发现，与带有cd28的car结构相比，引入icos的胞内区和跨膜区后，可以促进cd4

t细胞向th1/th17表型分化，进而提高cd8

t细胞的抗肿瘤活性。同时发现，在car结构中引入4-1bb分子可以有效延长cd8

t细胞的存活时间。
6.目前，car-t疗法对于实体肿瘤的治疗还存在诸多挑战，包括：缺乏理想的治疗靶点、归巢障碍、以及免疫抑制微环境导致的car-t细胞持久性表现不良等。因此，本领域还需要开发新的用于实体瘤，尤其是神经母细胞瘤的car-t细胞和治疗方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种靶向gd2的car-t细胞及其制备和应用。
8.在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，
9.所述的重链可变区包括以下互补决定区cdr：
10.seq id no:12所示的cdr1，
11.seq id no:13所示的cdr2，和
12.seq id no:14所示的cdr3；
13.且所述的轻链可变区包括以下互补决定区cdr：
14.seq id no:15所示的cdr1’，
15.seq id no:16所示的cdr2’，和
16.seq id no:17所示的cdr3’。
17.在另一优选例中，所述的抗原结合结构域包括seq id no:1所示的抗体重链可变区，和seq id no:2所示的抗体轻链可变区。
18.在另一优选例中，所述抗体重链可变区和抗体轻链可变区通过连接肽相连。
19.在另一优选例中，所述的抗原结合结构域的结构如下式i或ii所示：
[0020]vl-vhꢀꢀ
(i)；v
h-v
l
ꢀꢀ
(ii)
[0021]
其中，vh为抗体重链可变区；v
l
为抗体轻链可变区；
“‑”
为连接肽或肽键。
[0022]
在另一优选例中，所述的抗原结合结构域的结构如式ii所示。
[0023]
在另一优选例中，所述vh的氨基酸序列如seq id no:1所示，v
l
的氨基酸序列如seq id no:2所示。
[0024]
在另一优选例中，所述连接肽为1-4个连续的seq id no:4(ggggs)所示的序列，较佳地2-4个，更佳地为3个。
[0025]
在另一优选例中，所述抗原结合结构域结合于gd2，较佳地为人gd2。
[0026]
在另一优选例中，所述抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区来源于人源化抗体。
[0027]
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的结构如下式iii所示：
[0028]
l-scfv-h-tm-c-cd3ζ
ꢀꢀ
(iii)
[0029]
其中，
[0030]
l为无或信号肽序列；
[0031]
scfv为靶向gd2的scfv；
[0032]
h为绞链区；
[0033]
tm为跨膜结构域；
[0034]
c为共刺激信号分子；
[0035]
cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列。
[0036]
在另一优选例中，所述的靶向gd2的scfv包括seq id no:1所示的抗体重链可变区，和seq id no:2所示的抗体轻链可变区。
[0037]
在另一优选例中，所述的l为选自下组的蛋白的信号肽：cd8、cd28、gm-csf、cd4、cd137、或其组合。
[0038]
在另一优选例中，所述的l为巨噬细胞集落刺激因子来源的信号肽。
[0039]
在另一优选例中，l的氨基酸序列如seq id no:5所示。
[0040]
在另一优选例中，所述的h为选自下组的蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、或其组合。
[0041]
在另一优选例中，所述的h为fc片段，较佳地为人fc片段。
[0042]
在另一优选例中，h的氨基酸序列如seq id no:6所示。
[0043]
在另一优选例中，所述的tm为选自下组的蛋白的跨膜区：icos、cd28、cd3 epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、gd2、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。
[0044]
在另一优选例中，所述的tm为icos来源的跨膜区。
[0045]
在另一优选例中，tm的序列如seq id no:7所示。
[0046]
在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：icos、ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、或其组合。
[0047]
在另一优选例中，所述的c为icos和4-1bb来源的共刺激信号分子。
[0048]
在另一优选例中，所述的icos来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如seq id no:8所示。
[0049]
在另一优选例中，所述的4-1bb来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如seq id no:9所示。
[0050]
在另一优选例中，cd3ζ的氨基酸序列如seq id no:10所示。
[0051]
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no:3所示。
[0052]
在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(car)。
[0053]
在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。
[0054]
在另一优选例中，所述核酸分子如seq id no:11所示。
[0055]
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。
[0056]
在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
[0057]
在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。
[0058]
在另一优选例中，所述载体为病毒颗粒的形式。
[0059]
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
[0060]
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子或表达本发明第一方面所述的car。
[0061]
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。
[0062]
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括大肠杆菌。
[0063]
在本发明的第五方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述的免疫细胞表达有本发明第一方面所述的car。
[0064]
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
[0065]
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
[0066]
在另一优选例中，所述细胞包括t细胞、nk细胞。
[0067]
在另一优选例中，所述细胞为car-t细胞或car-nk细胞，较佳地为car-t细胞。
[0068]
在另一优选例中，所述的免疫细胞中car与细胞自杀元件共表达。
[0069]
在本发明的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第五方面所述的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。
[0070]
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
[0071]
在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。
[0072]
在另一优选例中，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，较佳地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
[0073]
在另一优选例中，所述的制剂还包含抗肿瘤的第二活性成分，较佳地包括第二抗体、或化疗剂。
[0074]
在另一优选例中，所述的化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。
[0075]
在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第五方面所述的免疫细胞、或本发明第六方面所述的制剂的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
[0076]
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
[0077]
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、或其组合。
[0078]
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。
[0079]
在另一优选例中，所述的肿瘤为gd2阳性肿瘤。
[0080]
在另一优选例中，所述的gd2阳性肿瘤选自下组：神经母细胞瘤、脑胶质瘤，黑色素瘤。
[0081]
在本发明的第八方面，提供了一种用于制备本发明第四方面所述的宿主细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第二方面所述的核酸分子、或本发明
第三方面所述的载体。
[0082]
在本发明的第九方面，提供了一种制备工程化的免疫细胞的方法，所述的免疫细胞表达本发明第一方面所述的car，所述方法包括以下步骤：
[0083]
(a)提供待改造的免疫细胞；和
[0084]
(b)将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入所述免疫细胞内，从而获得所述工程化的免疫细胞。
[0085]
在另一优选例中，所述工程化的免疫细胞为car-t细胞或car-nk细胞。
[0086]
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
[0087]
在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第三方面所述的载体、本发明第五方面所述的免疫细胞、或本发明第六方面所述的制剂。
[0088]
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
[0089]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0090]
图1显示了gd2-car载体的构建以及特异性验证。
[0091]
图1a显示了pg3-gd2-car结构示意图，pg3-gd2-car包括人源化gd2抗体3f8的scfv片段，人fc片段，icos跨膜区，icos和4-1bb胞内区(共刺激信号)，及cd3ζ。
[0092]
图1b显示了神经母细胞瘤细胞系表面gd2的表达水平。
[0093]
图1c显示了流式检测pg3-gd2-car-jurkat细胞表面car的表达水平。
[0094]
图1d显示了效靶比1:1，共孵育24h后，pg3-gd2-cr-jurkat细胞表面cd25和cd69的表达情况。
[0095]
图2显示了pg3-gd2-car-t细胞的构建和验证。
[0096]
图2a显示了流式检测pg3-gd2-car-t细胞表面car分子表达水平。
[0097]
图2b显示了westerrn blot检测pg3-gd2-car-t细胞内car蛋白的表达。其中，pg3-gd2-car-t细胞(泳道1)，t细胞(泳道2)通过sds-page在还原条件下分离的细胞裂解产物。小鼠抗cd3ζ抗体作为一抗，山羊抗鼠辣根过氧化物酶(hrp)抗体作为二抗。t细胞和car-t细胞均在35kd处检测到内源性的cd3ζ表达。而只有car-t细胞在75kd处检测到外源性的cd3ζ表达。
[0098]
图3显示了pg3-gd2-car-t细胞的体外功能验证。
[0099]
图3a显示了通过xeclligence real-time cell analyzer(rtca)检测pg3-gd2-car-t细胞在体外对神经母细胞瘤细胞的生长抑制作用。按照如图所示的效靶比将两种细胞共孵育48小时，每隔15min检测靶细胞的贴壁生长指数。
[0100]
图3b显示了将pg3-gd2-car-t细胞与三种靶细胞按如图所示效靶比共孵育48h后，上清中granzyme-b，ifn-γ，il-2和tnf-α的释放水平。
[0101]
图4显示了pg3-gd2-car-t细胞的体内功能验证。
[0102]
图4a显示了神经母细胞瘤异种移植模型示意图。
[0103]
图4b显示了小鼠肿瘤体积增长图和安乐死时瘤重与体重的比值。与t细胞相比，pg3-gd2-car-t细胞能够基本抑制肿瘤生长(*p＝0.0103,**p＝0.0049by t-test,mean
±
sem)。
[0104]
图4c显示了安乐死时小鼠外周血中血红细胞，白细胞，血红蛋白以及血小板含量。t细胞组小鼠与pg3-gd2-car-t组小鼠无明显差异。(by t-test,mean
±
sem)。
[0105]
图4d显示了car-t组和t细胞组中两组小鼠肿瘤大小比较。
[0106]
图5显示了免疫组化结果。
[0107]
图5a显示了小鼠肿瘤he染色结果显示pg3-gd2-car-t组小鼠肿瘤组织学结构发生的明显的病理改变，而对照t细胞组则无明显的变化。其中，左边表示pg3-gd2-car-t组两个肿瘤，右边为t细胞组随机抽取的两个肿瘤。
[0108]
图5b显示了小鼠肿瘤ihc染色结果。结果显示，pg3-gd2-car-t实验组中有较多的t细胞浸润。其中，左边表示pg3-gd2-car-t组两个肿瘤，右边为t细胞组随机抽取的两个肿瘤。
[0109]
图5c显示了tunel分析结果。结果显示，与t细胞组相比，pg3-gd2-car-t实验组中可以检测到更多的凋亡细胞。
具体实施方式
[0110]
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种靶向gd2的三代car载体。发明人将gd2人源化抗体的scfv片段通过人fc片段与icos的跨膜区和胞内区相连接，icos胞内区为第一个共刺激分子，后面再连接4-1bb胞内区，作为car结构的第二个共刺激分子，然后再与cd3ζ相连接，构建pg3-gd2-car。体外功能实验结果显示，pg3-gd2-car-t细胞与神经母细胞瘤细胞共孵育时，在效靶比分别为1:2，1:1以及4:1时，均能有效抑制肿瘤细胞的生长；同时，同对照t细胞相比，在car-t细胞与肿瘤细胞共孵育后的上清中，检测到了明显的细胞因子(包括ifn-γ，tnf-α，granzyme-b以及il-2)释放升高。动物实验的结果也显示，pg3-gd2-car-t细胞可以显著抑制神经母细胞瘤皮下模型中肿瘤细胞的增殖，具有显著的体内抗肿瘤作用，因此本发明构建的pg3-gd2-car-t细胞可以用于神经母细胞瘤的靶向治疗。
[0111]
术语
[0112]
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本技术中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
[0113]
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
[0114]
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
[0115]
术语“抗体”(ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(h)链和两条轻(l)链，或其抗原结合部分。每条h链包含重链可变区
(本文缩写为vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域cl。vh和vl区可以进一步细分为称为互补决定区(cdr)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl包含三个cdr和四个fr，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
[0116]
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：ala(a)、arg(r)、asn(n)、asp(d)、cys(c)、gln(q)、glu(e)、gly(g)、his(h)、i1e(i)、leu(l)、lys(k)、met(m)、phe(f)、pro(p)、ser(s)、thr(t)、trp(w)、tyr(y)、val(v)。
[0117]
gd2
[0118]
双唾液酸神经节苷脂gd2(disialoganglioside gd2，简称为gd2)属于神经节苷脂鞘脂类，在多种小儿以及成人的肿瘤中高表达，包括神经母细胞瘤，脑胶质瘤，黑色素瘤等。gd2通常表达于胚胎发育期，在出生后的组织表达水平较低，并且主要局限于骨祖细胞，大脑，周围神经和皮肤黑素细胞等。鉴于上述gd2的特性，已经开发出了多种靶向gd2的治疗策略，包括特异性抗体，药物偶联以及嵌合抗原受体修饰的t细胞疗法等。
[0119]
嵌合抗原受体(car)
[0120]
cars的设计经历了以下过程：第一代car只有一个胞内信号组份cd3ζ或者fcγri分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的t细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的t细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代cars在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如cd28、4-1bb、ox40、icos，与一代cars相比功能有很大提高，进一步加强car-t细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代cars基础上串联一些新的免疫共刺激分子如cd27、cd134，发展成为三代和四代cars。
[0121]
本发明的嵌合抗原受体(car)为三代car，包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
[0122]
在car的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在car的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
[0123]
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的car的胞外结构域包括靶向gd2的抗原结合结构域。本发明的car当在t细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。
[0124]
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的fab片
段，fab’片段，f(ab’)2片段，或单一fv片段。fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，fv抗体还包含vh和vl结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scfv(single-chain variable fragment)。scfv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scfv包含特异性识别gd2的抗体，较佳地为人源化的单链抗体。
[0125]
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，car可被设计以包括融合至car的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与car中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
[0126]
具体地，在本发明的优选实施方式中，为了提高car-t细胞在肿瘤微环境中的生存能力，用icos和4-1bb为共刺激结构域，构建了一种新型的靶向gd2的三代car载体，依次包括人源化的gd2抗体的单链抗体序列,人fc片段，人icos跨膜区和胞内区序列，人4-1bb胞内区序列，及人cd3ζ序列。
[0127]
进一步地，通过慢病毒转染的方式构建了特异性靶向gd2的car-t细胞(pg3-gd2-car-t)，然后通过体外杀伤实验验证了pg3-gd2-car-t细胞对gd2阳性神经母细胞瘤细胞株的杀伤活性，通过小鼠实验评估了pg3-gd2-car-t细胞对神经母细胞瘤细胞株的体内抗肿瘤活性。结果显示，本发明构建的pg3-gd2-car-t细胞与神经母细胞瘤细胞共孵育，在效靶比分别为1:2，1:1以及4:1时，对神经母细胞瘤细胞都具有明显的抑制作用，并能产生特异性的细胞因子谱(包括ifn-γ，tnf-α，granzyme-b以及il-2)；动物实验的结果显示，本发明构建的pg3-gd2-car-t细胞可以显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的增殖，具有显著的体内抗肿瘤作用。总之，本发明构建的pg3-gd2-car-t细胞为靶向治疗神经母细胞瘤提供了一种新的方法或策略。
[0128]
载体
[0129]
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
[0130]
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
[0131]
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
[0132]
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
[0133]
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
[0134]
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如sambrook等(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0135]
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
[0136]
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
[0137]
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0138]
为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
[0139]
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光
素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，ui-tei等，2000febs letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
[0140]
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
[0141]
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如sambrook等(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
[0142]
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
[0143]
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
[0144]
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/dna或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
[0145]
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
[0146]
制剂
[0147]
本发明提供了一种含有本发明的car-t细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，更优地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
[0148]
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明
的制剂优选配制用于静脉内施用。
[0149]
治疗性应用
[0150]
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(lv)转导的细胞(例如，t细胞)进行的治疗性应用。转导的t细胞可靶向肿瘤细胞的标志物gd2，协同激活t细胞，引起t细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。
[0151]
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的t细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的car-t细胞。
[0152]
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体t细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生car-t细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被t细胞以无mhc限制方式识别。此外，一种car-t就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0153]
在一个实施方式中，本发明的car-t细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-修饰t细胞诱导对car中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗gd2的car-t细胞引起抗gd2阳性的细胞的特异性免疫应答。
[0154]
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-gd2 scfv、fc铰链和icos跨膜区和胞内区、4-1bb胞内区和cd3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
[0155]
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的car治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
[0156]
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
[0157]
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
[0158]
在优选的实施方式中，可治疗的癌症为gd2阳性肿瘤，如神经母细胞瘤，脑胶质瘤，黑色素瘤等。
[0159]
本发明的car-修饰t细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
[0160]
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码car的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
[0161]
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的car的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。car-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和car-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
[0162]
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
[0163]
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的car-修饰的t细胞。
[0164]
本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如il-2、il-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
[0165]
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
[0166]
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，neweng.j.of med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
[0167]
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的t细胞组合物优选通过i.v.注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
[0168]
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将t细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ara-c)或对ms患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对pml患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的t细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和fk506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发
明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
[0169]
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1
×
106个至1
×
10
10
个本发明经修饰的t细胞(如，car-t细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
[0170]
本发明的主要优点包括：
[0171]
(a)本发明构建的car-t细胞在均能够持续高效的抑制gd2

神经母细胞瘤细胞的生长，并且对gd2
high
的sh-sy5y细胞的抑制效果尤为明显。
[0172]
(b)本发明构建的car-t细胞具有较高的细胞毒性和较好的持久性，可以持续高效的抑制神经母细胞瘤肿瘤细胞构建的异种移植小鼠模型中的肿瘤进展。
[0173]
(c)本发明构建的car-t细胞对小鼠外周血中的血相不会产生明显的改变，安全性较好。
[0174]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0175]
通用材料和方法：
[0176]
1.细胞系和细胞培养
[0177]
人神经母细胞瘤细胞系sk-n-sh，sk-n-as和sh-sy5y细胞购买自南京科佰生物技术有限公司。sk-n-sh培养于mem培养基中(inviitrogen)，添加10％胎牛血清(fbs；gibco)，1％非必需氨基酸(neaa；gibco)，1mm sodium pyruvate(nap；gibco)。sk-n-as细胞培养于dmem培养基中(inviitrogen)，添加10％fbs，1％neaa。sh-sy5y细胞培养于mem/f-12(1:1)培养基中(inviitrogen)，添加10％fbs，1％neaa,1mm nap。jurkat细胞(atcc)培养于rpmi-1640培养基中(inviitrogen)，添加10％fbs。从健康人体外周血中提取的t细胞培养于texmacs
tm
gmp培养基中，添加il-7和il-15。hek293细胞培养于dmem培养基中，添加10％fbs。所有细胞均放置于37℃，5％co2的培养箱中培养。
[0178]
2.pg3-gd2-car构建
[0179]
本发明构建的是新型的第三代靶向gd2的car载体，依次包括人源化的gd2抗体的单链抗体序列,人fc片段，人icos跨膜区和胞内区序列，人4-1bb胞内区序列，及人cd3ζ序列。
[0180]
3.慢病毒的制备和转导
[0181]
慢病毒制备参照现有技术中的常规方法。
[0182]
car-t细胞按照如下方法制备：将健康人体的外周血与pbs进行等量混匀稀释，再按ficoll：稀释后的外周血＝1:2的比例，沿管壁缓慢将稀释后的外周血加入ficoll中，进
行密度梯度离心，800
×
g离心30min。吸取中间雾状层单核细胞，用pbs洗两遍后计数，按5
×
106/孔，放入24孔板中，每孔加入20ul cd3/cd28磁珠激活。激活48h后计数，取5
×
105个细胞转移至48孔板中，加入病毒浓缩液进行转染(moi＝10)，总体系为200ul，转染16h后每孔补加1ml培养基进行培养。整个t细胞培养过程均在texmacs
tm
gmp培养基中进行，添加il-7和il-15。
[0183]
4.pg3-gd2-car-jurkat细胞的构建
[0184]
为了证明本发明构建的pg3-gd2-car的特异性，构建了pg3-gd2-car-jurkat细胞(在jurkat细胞上过表达pg3-gd2-car)。取培养的jurkat细胞计数，取1
×
106个细胞转移至48孔板中，加入pg3-gd2-car病毒浓缩液进行转染，转染14h后离心去上清，加入新鲜的培养基进行培养。待细胞数足够后，用带apc标记的fc抗体进行染色，在流式细胞仪上进行分选，直到细胞阳性率达百分之百，将分选所得的细胞扩大培养。
[0185]
5.流式细胞术和蛋白免疫印记
[0186]
为了检测细胞表面gd2-car的表达，用带apc荧光标记的人igg fc抗体对t细胞和jurkat细胞进行染色。为了检测靶细胞表面gd2抗原表达水平，用pe标记的gd2抗体对三株靶细胞进行染色。具体而言，是将细胞与抗体在37℃下共孵育20min，随后用pbs清洗两遍，加入300ulpbs重悬，在流式细胞仪上进行检测分析。
[0187]
提取pg3-gd2-car-t细胞的总蛋白，然后用小鼠衍生的抗cd3ζ抗体(bd biosciences)作为一抗，山羊抗鼠辣根过氧化物酶(hrp)抗体(solarbio,beijing,china)作为二抗。按照现有技术的常规方法，进行western blotting检测。
[0188]
6.体外细胞毒性和细胞因子检测
[0189]
采用艾森生物的xeclligence real-time cell analyzer(rtca)检测pg3-gd2-car-t细胞对神经母细胞瘤的体外抗肿瘤活性。收集sk-n-sh，sk-n-as和sh-sy5y细胞，将细胞浓度调整至1
×
104/100ul。100ul/孔放入板中，将板放入仪器。培养24h待细胞贴壁后加入car-t细胞。取pg3-gd2-car-t细胞用靶细胞的培养基重悬后计数，按效靶比为1:2,1:1,4:1加入对应的靶细胞中。空白孔补加培养基，终体积200ul，细胞生长指数每隔15min监测一次。
[0190]
共孵育48h后吸取上清。用cytometric bead array(cba；bd)试剂盒检测上清中细胞因子的含量。
[0191]
7.异种移植模型
[0192]
为了验证pg3-gd2-car-t细胞在体内的抗肿瘤作用，用神经母细胞瘤细胞株sk-n-as构建了小鼠的皮下肿瘤模型。首先选用6-8周龄的雌性b-nsg小鼠，每组5只小鼠。在第0天给小鼠皮下注射1:1混合有基质胶(bd biosciences)的sk-n-as细胞(1.5
×
107/只)，第7天尾静脉注射t细胞和pg3-gd2-car-t细胞(car阳性率35％)。随后检测小鼠肿瘤体积，在肿瘤长至1000mm3时对小鼠进行安乐死。记录肿瘤长和宽，并根据以下公式计算肿瘤体积(体积＝长*宽2/2)。所有小鼠实验均在当地负责动物实验的机构和委员会的批准下进行。
[0193]
8.组织学检测和tunel
[0194]
随机选取了2只t细胞组小鼠的肿瘤组织和2只pg3-gd2-car-t组小鼠的肿瘤组织，用石蜡包埋好后切片(厚度3μm)进行免疫组化分析。将石蜡切片脱蜡复水后用苏木精-伊红(hematoxylin-and-eosin)染色，观察肿瘤组织的病理变化。将石蜡切片脱蜡复水后用浸于
cell analyzer(rtca)检测pg3-gd2-car-t细胞对神经母细胞瘤的体外杀伤。sk-n-sh为gd2阴性细胞，sk-n-as和sh-sy5y为gd2阳性肿瘤细胞。t细胞与pg3-gd2-car-t细胞作为效应细胞，效靶比分别为1:2,1:1,4:1，共孵育48h。同时，检测了上清中细胞因子的释放情况，
[0212]
rtca检测结果如图3a所示，与对照t细胞相比，pg3-gd2-car-t细胞可以显著抑制gd2

神经母细胞瘤细胞的生长，而且对高表达gd2的sh-sy5y细胞的抑制效果尤为明显，而对于gd2-的神经母细胞瘤细胞，t细胞组和pg3-gd2-car-t组的抑制效果则没有明显的区别。
[0213]
细胞因子释放情况如图3b所示，与t细胞组相比，在pg3-gd2-car-t组的上清中有明显的细胞因子释放升高，包括granzyme-b，tnf-α，ifn-γ，il-2。
[0214]
实施例4 pg3-gd2-car-t细胞体内功能验证
[0215]
为了进一步评估pg3-gd2-car-t的体内抗肿瘤效果，用sk-n-as细胞构建了小鼠皮下移植肿瘤模型。图4a为动物实验的简单图解。第0天给nsg小鼠皮下注射sk-n-as细胞(1.5
×
107/只)，第7天尾静脉注射t细胞和pg3-gd2-car-t细胞(car阳性率35％)。随后检测小鼠肿瘤的生长情况。在肿瘤长至1000mm3时对小鼠进行安乐死。
[0216]
肿瘤生长实验结果如图4b和4d所示，t细胞组的小鼠在一个月左右肿瘤体积迅速增长至1000mm3以上，而pg3-gd2-car-t组小鼠的肿瘤生长得到了明显的抑制，有3只小鼠肿瘤完全消失。结果表明，pg3-gd2-car-t细胞能够较好的归巢到肿瘤组织部位，并发挥持续的抗肿瘤功效。
[0217]
取小鼠外周血检测其红细胞，白细胞，血红蛋白以及血小板。结果如图4c所示，pg3-gd2-car-t组小鼠与对照t细胞组均无明显差异，说明pg3-gd2-car-t细胞对小鼠外周血中的血相不会产生明显的改变，安全性较好。
[0218]
最后，随机选取了2只t细胞组小鼠的肿瘤组织和2只pg3-gd2-car-t组小鼠的肿瘤组织进行免疫组化分析。
[0219]
he染色结果如图5a所示，pg3-gd2-car-t组的小鼠肿瘤组织学结构发生的明显的病理改变，而对照t细胞组则无明显的变化。
[0220]
对肿瘤组织中cd3分子进行ihc染色。结果如图5b所示，pg3-gd2-car-t实验组中有较多的t细胞浸润。
[0221]
最后，用tunel分析法，检测了肿瘤组织中细胞凋亡情况。结果如图5c所示，与t细胞组相比，pg3-gd2-car-t实验组中可以检测到更多的凋亡细胞。
[0222]
讨论
[0223]
对于car-t细胞疗法，靶点的选择对于治疗的安全性和可行性很重要。鉴于gd2在包括神经母细胞瘤在内的多种小儿以及成人的肿瘤中高表达，而在出生后的正常组织表达较低的特性，已经有多个研究小组开发出了包括car-t疗法在内的多种靶向gd2的治疗策略。gd2-car-t的研究经验已经确立了gd2作为靶点治疗神经母细胞瘤的可行性，具有较好的疗效。但是car-t疗效在实体瘤中不如血液系统恶性肿瘤那么强，设计针对实体瘤的car-t细胞存在许多挑战。包括t细胞的持久性和效力，缺乏肿瘤特异性靶标以及免疫抑制性肿瘤微环境等。
[0224]
本发明构建了一种新型的靶向gd2的三代car结构，将人源化gd2抗体的scfv片段与icos的跨膜区和胞内区相连接，同时再连接4-1bb胞内区作为其car结构胞内区的第二个
共刺激分子，再与cd3ζ相连接。在car结构中以icos和4-1bb作为其两个共刺激分子构建三代car结构，可以有效延长car-t细胞在体内的生存期和提高其抗肿瘤功效。
[0225]
实验结果显示，pg3-gd2-car-t细胞对于gd2

的神经母细胞瘤细胞，在体内外均表现出较强的抗肿瘤活性。首先，将car结构构建到jurkat细胞上，验证其特异性。pg3-gd2-car-jurkat细胞与神经母细胞瘤细胞株共孵育后，其表面活化指标cd25和cd69随着gd2表达水平的提高，均有所提高。说明本发明构建的pg3-gd2-car-jurkat可以被gd2阳性的肿瘤细胞特异性激活，而不会被gd2阴性的肿瘤细胞特异性激活，具有较好的特异性。随后，成功构建了pg3-gd2-car-t细胞(阳性率40％
±
10％)，并通过xeclligence real-time cell analyzer(rtca)检测其在体外对神经母细胞瘤细胞株的生长抑制功效。结果显示，pg3-gd2-car-t细胞在较低的效靶比下均能够持续高效的抑制gd2

神经母细胞瘤细胞的生长，并且对gd2
high
的sh-sy5y细胞的抑制效果尤为明显。而对于gd2-的神经母细胞瘤细胞，t细胞组和pg3-gd2-car-t组则没有观察到明显的区别。对上清中细胞因子的检测得到了同样的结果，说明本发明构建的pg3-gd2-car-t细胞具有较高的特异性和细胞毒性。在小鼠实验中，发现pg3-gd2-car-t细胞同样能够高效持续的抑制小鼠体内神经母细胞瘤的生长。与对照t细胞组相比，car-t组的肿瘤生长得到明显的抑制，肿瘤组织中有更多的t细胞浸润，肿瘤组织结构破坏更为严重，肿瘤细胞凋亡更多。说明本发明构建的pg3-gd2-car-t细胞能够准确的到达肿瘤部位，具有较高的细胞毒性。有三只小鼠肿瘤完全消失并且没有复发，说明本发明构建的pg3-gd2-car-t细胞具有较高的持久性，能够持续高效的起到抗肿瘤的功效。pg3-gd2-car-t组与对照t细胞组小鼠外周血中红细胞，白细胞，血红蛋白以及血小板均无明显差异，说明本发明的pg3-gd2-car-t细胞对小鼠外周血中的血相不会产生明显的改变，安全性较好。
[0226]
综上，本发明构建了一种基于gd2人源化抗体序列构建的新型三代car-t细胞(含有icos和41bb共刺激信号)，并通过一系列的实验证明了对神经母细胞瘤肿瘤细胞的抗肿瘤效果。不仅通过体外实验证实了pg3-gd2-car-t细胞在较低的效靶比下对gd2阳性的神经母细胞瘤的特异性细胞毒性，而且还通过动物实验证明了pg3-gd2-car-t细胞具有较高的细胞毒性和较好的持久性，可以持续高效的抑制神经母细胞瘤肿瘤细胞构建的异种移植小鼠模型中的肿瘤进展。总之，本发明构建的pg3-gd2-car-t细胞为神经母细胞瘤等实体肿瘤的的治疗提供了一种新的方法或策略。
[0227]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
[0228]
本技术序列表中涉及的各序列如下：
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[0230]