降血糖功能性水稻材料的创制方法及应用

1.本发明属于植物基因工程领域，尤其涉及降血糖功能性水稻材料的创制方法及应用。


背景技术：

2.糖尿病可造成多系统代谢紊乱，病程较长，并伴随多种并发症，会对全身尤其是眼睛、肾脏、心脏和血管等器官造成不同程度的伤害。在糖尿病患者中90％以上属于ii型糖尿病。ii型糖尿病是指由于胰岛β细胞部分损伤或凋亡导致胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗(机体组织对胰岛素不敏感)引起的高血糖。目前已研究出多种用于治疗糖尿病的药物，包括临床应用时间较长的常规传统药物和新型抗糖尿病药物。这些药物虽有明显的治疗效果，但费用高，副作用大，且不能从根本上阻止胰岛β细胞衰退的趋势。
3.胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide 1,glp-1)，能够促进胰岛素的分泌，降低血糖。正常人进餐后glp-1快速释放，而ii型糖尿病患者的餐后释放是缺陷的，从而导致glp-1浓度下降，胰岛素分泌减少。glp-1不仅具有促进胰岛素分泌作用，还可调节胰岛素的合成，抑制胰高血糖素的分泌；促进β细胞的再生，减少β细胞的凋亡；促进干细胞分化为胰腺内分泌细胞，对于糖尿病的治疗具有标本兼治的作用。因此，开发glp-1新资源具有广阔的应用前景。
4.天然的glp-1半衰期极短，仅为2分钟左右。其原因是二肽酰基肽酶iv(dpp-iv)可特异性识别glp-1肽链n端第二位的pro或者ala残基，从肽链的n端切除这两个残基。为了消除dpp-iv对glp-1的水解作用，延长其半衰期，前人对天然glp-1序列进行改造，将第八位的ala改造成ser，将胰蛋白酶作用位点第26位和第34位的lys分别替换成gln和asp，得到抗dpp-iv和胰蛋白酶的mglp-1(modified glp-1)序列。
5.水稻是重要的粮食作物，同时也是理想的植物生物反应器，在生产重组蛋白和外源蛋白方面应用广泛。水稻胚乳细胞合成重组蛋白技术具有产量高，成本低，易规模化，安全性高，绿色环保等优点。迄今，虽然已有通过水稻做生物反应器生产mglp-1，但是其表达量较低(每g水稻中最多含150ug的mglp1蛋白。参考文献yasuda h,hayashi y,jomori t,takaiwa f(2006)the correlation between expression and location of a foreign gene product in rice endosperm.plant cell physiol.47,756-763.)，不能达到应用的要求，且转基因植株中仍含有选择标记基因，限制了大规模生产mglp-1的商业化进程。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是提供如下方法。
7.本发明提供的一种制备表达mglp-1基因或高表达mglp-1基因转基因水稻的方法，包括如下步骤：将10个串联mglp-1基因或含有10个串联mglp-1基因的表达盒导入目的水稻中，得到表达mglp-1基因或高表达mglp-1基因转基因水稻。
8.本发明提供的一种在水稻中表达mglp-1基因或高表达mglp-1基因的方法，包括如
下步骤：将10个串联mglp-1基因或含有10个串联mglp-1基因的表达盒导入水稻中，实现mglp-1基因在水稻中表达或高表达。
9.上述方法中，所述10
×
mglp-1基因为将10个mglp-1基因串联得到的序列；
10.所述10
×
mglp-1基因为如下1)或2)或3):
11.1)序列表中序列2所示的dna分子；
12.2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码相同蛋白质的dna分子；
13.3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码相同蛋白质的dna分子。
14.上述方法中，所述含有10个串联mglp-1基因的表达盒包括驱动10个串联mglp-1基因表达的植物胚乳特异性启动子。
15.将10个串联mglp-1基因或含有10个串联mglp-1基因的表达盒导入目的水稻通过重组载体导入目的植物；
16.上述重组载体包括水稻胚乳特异性表达谷蛋白gluc基因启动子、10
×
mglp-1基因序列和水稻glub-5基因终止子；本实验选用了含有两个t-dna区的双t植物表达载体，便于后续从转基因植株自交分离后代中筛选无选择标记的富含mglp-1多肽的转基因植株。
17.上述方法中，所述胚乳特异性启动子为水稻谷蛋白基因启动子、小麦种子贮藏蛋白基因启动子、大麦种子贮藏蛋白基因启动子或玉米醇溶蛋白基因启动子。
18.在本发明中，所述水稻谷蛋白基因启动子的序列为序列表中序列1(自genbank accession number为eu264107的5
′
端起第1～2331位核苷酸序列)；序列表中序列2包含一段谷蛋白信号肽序列，以及上述根据水稻密码子偏好性人工设计的10
×
mglp-1核苷酸序列。所述水稻谷蛋白基因终止子的序列为序列表中序列3(自genbank accession number为nc008395的5
′
端起第8088533～8089029位核苷酸序列)。
19.上述方法还包括如下步骤：在将10个串联mglp-1基因或含有10个串联mglp-1基因的表达盒导入水稻后得到转基因植物；自交所述转基因植物，得到自交后代，从所述自交后代中筛选种子中的10
×
mglp-1含量高且无标记基因的植株。
20.上述方法中，所述植物为单子叶植物或胚乳型双子叶植物；
21.或，所述植物为单子叶植物或胚乳型双子叶植物，具体为禾本科植物；
22.或，所述植物为单子叶植物或胚乳型双子叶植物，具体为禾本科植物；所述禾本科植物具体为水稻、玉米、小麦、高粱、燕麦、大麦或黑麦。
23.上述方法获得的转基因植物可用于制备具有降血糖功能产品。
24.上述方法在制备具有降血糖功能产品中的应用也是本发明保护的范围；
25.或，上述方法在制备mglp-1蛋白中的应用也是本发明保护的范围。
26.上述方法在创制降血糖转基因水稻中的应用也是本发明保护的范围。
27.本发明另一个目的是提供另一种方法。
28.本发明提供一种制备mglp-1蛋白的方法，包括如下步骤：
29.1)用上述第一个目的方法的步骤，得到高表达mglp-1蛋白且无标记基因的植株；
30.2)提取所述高表达mglp-1蛋白且无标记基因的植株的籽粒，得到mglp-1蛋白。
31.高表达mglp-1的水稻能够直接用sds-page和考马斯染色检测出来，在获得的转基因植物中，表达量高的植物，其含量可以达到3.594mg/g。
32.本发明选用含有两个t-dna区的双t载体，从转基因植株自交分离后代中筛选出无选择标记基因的富含mglp-1多肽转基因植株，获得具有医食同源功能的水稻新品系。利用水稻做生物反应器生产mglp-1蛋白具有良好的应用价值。因为表达的mglp-1蛋白是在水稻的可食用部分种子中积累，省去了纯化等加工过程。需求者可直接通过食用达到治疗效果。
附图说明
33.图1为植物表达载体pcdmar-mglp-1结构示意图。
34.图2为t0代转基因植株pcr检测。
35.图3为转基因植株半定量rt-pcr检测。
36.图4为转基因植株中mglp-1蛋白表达水平检测。
37.图5为t0代转基因植株western杂交检测。
38.图6为筛选过量表达mglp-1的转基因植株。
39.图7为t1代无选择标记转基因植株筛选。
40.图8为t2代转基因植株pcr检测。
41.图9为无选择标记转基因纯系的筛选，m：marker；wt：野生型植株；m2-4-1：mglp-1转基因植株。
42.图10为原核表达mglp-1蛋白胶灰度分析。
43.图11为水稻种子中mglp-1蛋白胶灰度分析。
具体实施方式
44.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
45.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
46.下述实施例中pcdm-gfb/hpt表达载体，记载在如下授权专利中，授权公告号为cn106032539b，发明名称为培育种子中α-亚麻酸含量提高的安全转基因植物的方法。
47.下述实施例中龙稻5号：粳型常规水稻，黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所选育，编号是黑审稻2006003。具体数据可参看国家水稻数据中心。
48.实施例1、降血糖转基因水稻新材料的创制
49.一、双元植物表达载体pcdmar-mglp-1的构建
50.10
×
mglp-1基因：其核苷酸序列为序列表中序列2，序列2的第1-72位为gluc信号肽序列，第73-975位均为10个mglp-1基因串联序列。
51.人工合成序列表中序列2所示的dna分子。
52.重组载体pcdmar-mglp-1为将序列2所示的dna片段替换pcdm-gfb/hpt表达载体的smai和saci酶切位点间的dna片段，得到重组载体，该重组载体表达含有10个mglp-1基因的表达盒，该表达盒由gluc启动子、10个mglp-1基因和glub5终止子组成，其中gluc启动子(序列为序列表中序列1)和glub5终止子(序列为序列表中序列3)控制，该重组载体还含有一个由35s启动子和nos终止子控制的潮霉素抗性基因的表达盒。
53.pcdmar-mglp-1载体的结构示意图如图1所示。
54.其中，序列2的第1-72位为gluc信号肽，第73-975位为10
×
mglp-1基因。
55.二、转pcdmar-mglp-1水稻的构建
56.用冻融法将步骤一的重组载体pcdmar-mglp-1导入农杆菌eha105中，然后通过农杆菌介导法转化龙稻5号(以下称为野生型水稻)胚性愈伤组织(具体操作方法参考文献qu lq,xing yp,liu wx,xu xp,song yr(2008)expression pattern and activity of six glutelin gene promoters in transgenic rice.j exp bot59:2417
–
2424)，利用潮霉素筛选培养、分化培养和生根培养，最终获得221个独立的再生植株。
57.三、转pcdmar-mglp-1水稻的分子检测
58.1、转pcdmar-mglp-1水稻的pcr筛选与鉴定
59.分别提取上述二获得的独立的再生植株叶片的总dna，分别以跨gluc启动子和mglp-1的嵌合引物(glucf和glp1r)和潮霉素基因引物(hptf和hptr)分别进行pcr扩增分析。
60.hptf 5'-gcaaggaatcggtcaataca-3'
61.hptr 5'-ttctacacagccatcggtc-3'
62.glucf 5'-gagattaggtaagtttgtta-3'
63.glp1r 5'-agcagcctgtccctccaaat-3'
64.结果如图2所示，m：marker； ：质粒pcdmar-mglp-1阳性对照；wt：野生型植株；1～16：再生植株，在大多数再生植株中都能扩增出特异的目的条带(880bp)，扩增出的目的基因片段大小与预期的一致，扩增出的潮霉素基因片段大小与预期的一致。
65.在221株再生植株共检测到108个植株既含有目的基因又含有潮霉素基因，命名为t0代转pcdmar-mglp-1水稻。
66.2、转基因水稻中mglp-1的rna表达水平检测
67.分别取野生型水稻及t0代转pcdmar-mglp-1水稻开花17天后的种子，提取灌浆期种子的rna，反转录得到cdna，以cdna为模板，以actin为内参，进行半定量rt-pcr扩增10
×
mglp-1。
68.actin-f:cctcgtctcgaccttgctggg
69.actin-r:gagaacaagcaggaggacggc
70.mglp-1f:atggcttccatgtctaccattc
71.mglp-1r:ttaacgtcca tctacaagcca
72.结果如图3所示，wt：野生型植株；1-7：t0代转pcdmar-mglp-1水稻；与野生型水稻龙稻5号相比，t0代转pcdmar-mglp-1水稻中，mglp-1在rna水平均成功转录。
73.3、转基因水稻mglp-1蛋白水平检测
74.分别取野生型水稻及t0代转pcdmar-mglp-1水稻的成熟种子，去颖壳，粉碎，加入600μl种子蛋白提取buffer(0.125m tris-hcl,ph 6.8,4％sds,4m尿素,2％
[0075]-巯基乙醇)，提取种子总蛋白。
[0076]
取8μl上样，进行sds-page电泳(浓度10％)，考马斯亮蓝染色后检测到与目的蛋白大小一致的单一条带(35.4kd)。
[0077]
随后，利用glp-1的抗体(glp-1单克隆抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司；品牌：bioss/博奥森；货号：bsm-0933m)进行western杂交，同样检测到了与目的蛋白大小一致的特异条带(图4，m：marker；wt：野生型植株；89、103和112均为：t0代转pcdmar-mglp-1水稻；箭头指示目的条带。)。
[0078]
4、高表达mglp-1转基因水稻的筛选
[0079]
为筛选高表达mglp-1转基因水稻，对获得的所有转基因阳性植株进行western杂交筛选。由于转基因t0代植株为杂合体，其自交后代中存在分离现象，因此每株pcr检测阳性的t0代转pcdmar-mglp-1水稻取三粒种子，去颖壳，粉碎，加入600μl种子蛋白提取buffer，提取种子总蛋白。
[0080]
取8μl上样，进行western杂交检测，结果如图5所示，wt：野生型植株；m2～m65：t0代转pcdmar-mglp-1水稻。
[0081]
图6为部分再生水稻植株的western杂交检测分析结果，m：marker；nt：野生型植株；m1～m64：t0代转pcdmar-mglp-1；与野生型植株相比，在编号为m2、m8、m10等转基因水稻植株中，mglp-1有很高的表达水平，而在m1、m4、m5等转基因水稻植株的种子中mglp-1的表达量水平较低。
[0082]
在不同的转基因植株中mglp-1的表达水平有强有弱，这可能是由于目的基因在转基因水稻基因组中的整合位点及插入的拷贝数不同造成的。
[0083]
通过western杂交检测筛选，在mglp-1转基因植株共检测到22个高表达(对获得的所有转基因阳性植株进行比较，挑选出相对表对量较高的植株)目的基因的植株。
[0084]
四、无选择标记转基因植株筛选
[0085]
t0代转基因阳性植株是由目的基因和标记基因共转化而来，自交后代中分离出无选择标记基因即无hpt的转基因植株。
[0086]
编号为m2的t0代转pcdmar-mglp-1水稻进行播种传代，得到编号为m2的t1代转pcdmar-mglp-1水稻。
[0087]
分别以跨gluc启动子与mglp-1嵌合引物和潮霉素基因引物进行pcr扩增检测编号为m2的t1代转pcdmar-mglp-1水稻不同单株。
[0088]
结果如图7所示，m：marker；wt：野生型植株； ：质粒阳性对照；2-1至2-11：编号为m2的t1代转pcdmar-mglp-1水稻不同单株，可以看出，在编号为m2的t1代转pcdmar-mglp-1水稻株系中的两个单株2-4和2-6只能扩增出目的基因880bp而不能扩增出潮霉素基因，即转基因植株后代中hpt被剔除。
[0089]
将编号为m2-4和m2-6的t1代转pcdmar-mglp-1水稻进行播种自交传代，得到编号为m2-4的t2代转pcdmar-mglp-1水稻的7个单株和编号为m2-6的t2代转pcdmar-mglp-1水稻的7个单株。
[0090]
分别以跨gluc启动子与mglp-1的嵌合引物和潮霉素基因引物进行pcr扩增检测m2-4的t2代转pcdmar-mglp-1水稻的7个单株和编号为m2-6的t2代转pcdmar-mglp-1水稻的7个单株。
[0091]
结果如图8所示，m：marker；wt：野生型植株； ：阳性对照；2-4-1～2-6-7分别为m2-4的t2代转pcdmar-mglp-1水稻的7个单株和编号为m2-6的t2代转pcdmar-mglp-1水稻的7个单株；可以看出，其中m2-4的7个单株均只能扩增出目的基因880bp而不能扩增出潮霉素基因，m2-6的7个单株中的5个单株只能扩增出目的基因而不能扩增出潮霉素基因，剩余的2个单株既不能扩增出目的基因也不能扩增出潮霉素基因。
[0092]
收获m2-4的t2代转pcdmar-mglp-1水稻的2-4-1的10粒种子，提取种子的蛋白质，用glp-1的抗体进行western杂交。
[0093]
结果如图9所示，可以看出，与野生型水稻相比，在m2-4-1的t2代转pcdmar-mglp-1水稻的10粒种子中均可检测到目的蛋白，且表达水平趋于一致。
[0094]
推测m2-4-1为转基因植株纯系。将m2-4-1扩繁。
[0095]
五、转基因水稻种子中mglp-1含量检测
[0096]
1、mglp-1蛋白标准品的制备
[0097]
1)重组菌制备
[0098]
在大肠杆菌中原核表达10
×
mglp-1蛋白，所用原核表达载体pet32a，具体如下：先将序列2所示的dna片段插入原核表达载体pet32a中，得到重组质粒pet32a-10
×
mglp-1，该质粒表达mglp-1蛋白；再将重组质粒导入大肠杆菌中，得到重组菌。
[0099]
2)目的蛋白的原核表达及纯化
[0100]
①
将阳性单克隆(重组菌)接种于5ml的lb液体培养基(kna抗性)，放置于摇床，37℃培养12hr。取0.5ml菌液加入到50ml的lb液体培养基(kna抗性)中，放置于摇床，37℃培养2hr左右。当菌液od600＝0.8时，加入终浓度为0.5mm的iptg，37℃诱导蛋白5hr。
[0101]
②
收集菌液，10,000rpm离心3min后，去除上清，加入5ml pbs重悬菌体，超声波破碎细胞至菌体清凉后，10,000rpm离心5min后，去除上清，沉淀重悬于200μl pbs(6m尿素)溶液中混匀。
[0102]
③
取500μl的柱基，放置于柱子中，用清洗缓冲液(20mm imidazole pbs)清洗5次，加入需纯化的蛋白溶液，4℃静置孵育1hr(可适当延长孵育时间)。
[0103]
④
去除上清后用清洗缓冲液清洗5次，加入1ml洗脱缓冲液(300mm imidazole pbs)振摇30min。取出上清。100℃5min蛋白变性后，进行sds-page电泳检测。纯化后的目的蛋白可用于后续实验或者－20℃保存。
[0104]
用sds-page分析，得到融合蛋白(pet32a载体上面带有109个氨基酸的trx标签，融合蛋白包括10
×
mglp-1蛋白和trx标签蛋白)的分子量为55.45kda。
[0105]
利用bradford法测定融合蛋白浓度为4.0μg/μl。
[0106]
按下表1所示进行sds-page分析(图10上图)，融合蛋白上样量分别为0.75μg、1.0μg、1.5μg、2.0μg、3.0μg和4.0μg，得到的蛋白胶进行灰度分析，利用image j软件，测得绝对灰度值，进而制作出标准曲线(图10下图)。
[0107]
表1
[0108][0109][0110]
标准曲线公式：y＝0.001x 0.0008,r2＝0.9901.
[0111]
其中y为物质的量，x为绝对灰度值。
[0112]
2、m2-4-1转基因植株纯系中mglp-1表达量
[0113]
将上述四获得的m2-4-1的t2代转pcdmar-mglp-1水稻种子，以1粒为三个平行组(表2中的1-3)和以2粒为三个平行组(表2中的4-6)进行蛋白提取，具体如下：
[0114]
分别取水稻的每粒成熟种子，去颖壳，粉碎，加入600μl种子蛋白提取buffer(0.125m tris-hcl,ph 6.8,4％sds,4m尿素,2％-巯基乙醇)，提取种子总蛋白。
[0115]
取10μl上样，利用glp-1的抗体(glp-1单克隆抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司；品牌：bioss/博奥森；货号：bsm-0933m)进行western杂交(图11，其中1-3为m2-4-1的t2代转pcdmar-mglp-1水稻种子各1粒的三个平行组实验，4-6为m2-4-1的t2代转pcdmar-mglp-1水稻种子各2粒的三个平行组实验。
[0116]
以野生型水稻龙稻5号为对照。
[0117]
利用标准曲线公式y＝0.001x 0.0008，测到不同平行组m2-4-1种子中物质的量；再将不同平行组m2-4-1种子中物质的量乘以mglp-1蛋白的分子量35.4kd，得到不同平行组mglp-1的质量(10ul上样量中含有mglp-1的质量)。不同平行组mglp-1的质量再乘以60(这是由于提取水稻种子时加的提取buffer的体积是600ul)，得到不同平行组种子中mglp-1质量(ug)；再将不同平行组种子中mglp-1质量(ug)比该平行组种子质量，得到该平行组种子中mglp-1质量比(mg/g)；
[0118]
结果如表2所示，可以看出，6种平行组试验结果最终获得转基因m2-4-1水稻种子中的mglp-1质量平均值为3.594mg/g。
[0119]
表2为6种平行组实验结果
[0120]