一株分离自海马齿根际的植物促生真菌BF-F的分离及鉴定方法

一株分离自海马齿根际的植物促生真菌bf-f的分离及鉴定方法
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株分离自海马齿根际的植物促生真菌bf-f的分离及鉴定方法。


背景技术：

2.大量施用化肥对粮食安全、生态环境和资源利用产生的危害已受到全世界的广泛关注，减少化肥施用和提高化肥的利用率是当前农业生产中急需解决的重要问题。目前，利用自然界中植物共生微生物促进农作物生长的有效措施及相关研究，正在成为农业环境保护、可持续性发展的一个重要方向。自然环境中，植物与多种微生物相互接触且以多种形式的相互作用。许多微生物及微生物组对它们的宿主有很多实质性的益处；这些益处包括促进营养吸收、增强抗逆性和提高植物对生物胁迫（病虫害）和非生物胁迫（热、干旱、盐）的抵抗力等。因此，筛选获得高效的植物促生菌，有利于开发高效的生物菌肥，生物肥料的推广应用可以提高作物产量和品质，减少化肥的施用，实现我国提出的化肥、农药的双减目标，保护农业生态环境。
3.海马齿(sesuvium portulacastrum l.)又名滨水菜，番杏科海马齿属的多年生匍匐性肉质草本植物，生长在海边沙地或者盐碱地。海马齿在淡水和海水浇灌或者水培条件下均能完成生活史，对高盐环境具有很强的适应能力。除耐高盐外，海马齿还耐干旱及多种重金属离子胁迫等，可作为一种生态修复的先锋植物用于滨海湿地及海水等环境的生态修复。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一株分离自海马齿根际的植物促生真菌bf-f的分离及鉴定方法。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一株分离自海马齿根际的植物促生真菌bf-f，其分类命名为枝孢菌属 cladosporium sp. (bf-f)，已于2021年07月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no. 23053。
6.植物促生真菌bf-f菌株的菌落特征及菌落形态：bf-f菌株在pda培养基上，25℃培养7天，菌落直径34-36 mm，灰绿色；具放射状皱纹；质地丝绒状；反面靛色；无渗出液产生，无可溶性色素产生。微观形态表现为菌丝分隔，分枝，宽2.0-5.5 μm，老后颜色变深；分生孢子梗发生于气生菌丝，孢梗茎有分隔，直立或略弯曲；分生孢子椭圆形，大小（2.5-5.5）
×
（2-4）μm；分枝分生孢子偶有形成，长柱状或椭圆形，大小（6-12）
×
（2.5-4.5）μm。
7.上述一株植物促生促生真菌bf-f在促进植物生长中的应用。所述植物包括但不限于海马齿、拟南芥和水稻。
8.本发明的优点在于：本发明提供了一株分离自海马齿根际的植物促生真菌bf-f的分离及其鉴定。所述植物促生真菌bf-f为枝孢菌cladosporium sp. 属真菌；研究发现该菌株能高效促进盐生植物海马齿、单子叶模式植物水稻和双子叶模式植物拟南芥生长，有潜力提取植物生长促生剂，从而推进绿色、环保和可持续农业的发展。
附图说明
9.图1 bf-f 菌株在pda培养基培养7天后的菌落形态图。
10.图2 植物促生真菌bf-f真菌菌丝扫描电镜形态图。
11.图3 基于its rdna和ef1-α序列构建的bf-f 菌株系统发育树。图中发育树节点只显示bootstrap值大于70％数值，上标“t”代表模式菌株，a：its rdna序列；b：ef1-α序列。
12.图4 海马齿组培苗接种bf-f菌株5周后的植株状态。a为未接种对照组，b为接种bf-f菌株组。
13.图5 bf-f菌株室外接种海马齿组培苗。
14.图6双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻的接种效果图。a为接种bd-28菌株15天后野生型拟南芥对照组（ck）与处理组（bf-f）植株状态；b为接种bd-28菌株4周后野生型水稻tp309对照组（ck）与处理组（bf-f）的植株状态。
具体实施方式
15.下面结合实施例和试验对本发明作进一步说明。
16.实施例1：一株植物促生真菌bf-f的分离及鉴定（1）植物促生真菌bf-f的分离纯化：将海马齿成熟种子进行表面消毒后播种于含有ms培养基的平板中，25℃恒温培养箱内培养15天左右，将长出子叶的海马齿实生苗移栽至含有ms培养基的组培瓶中放在温度为25℃、湿度为75%、光照培养16h和黑暗培养8小时的人工气候室进行正常培养，2个月后一瓶海马齿实生苗根际发现真菌污染，且被真菌侵染的植株长势显著优于未污染植株。对被污染的海马齿根际的真菌进行分离和纯化。分离培养基为mea固体培养基。用无菌镊子夹取海马齿根际菌落不同部位的少许菌块，放置于mea固体培养基制成的平板中培养2～7天，期间对新长出的菌落进行反复分离和纯化，最终筛选获得包括bf-f在内的7株纯培养菌株。进行海马齿植株回接验证的实验结果显示bf-f能有效的促进植株生长。为了进一步阐释bf-f促进植物生长的机理，首先对该菌株进行形态学和分子生物学的鉴定。
17.mea（麦芽提取物培养基）配方为：胰蛋白胨1 g、麦芽提取物 20g、葡萄糖和琼脂各 20g，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20分钟，冷却至60℃以下摇晃均匀后倒平板待用。
18.ms培养基的配制：4.43 g/l ms基础培养基 30 g/l蔗糖 8 g/l 琼脂，经高压灭菌后在超净工作台中倒入无菌培养皿中备用。
19.（2）菌落特征及菌落形态：菌株在pda培养基上，25℃暗培养7天，菌落直径34-36 mm，灰绿色；具放射状皱纹；质地丝绒状；反面靛色；无渗出液产生，无可溶性色素产生（图1）。微观形态表现为菌丝分隔，分枝，宽2.0-5.5 μm，老后颜色变深；分生孢子梗发生于气生菌丝，孢梗茎有分隔，直立
或略弯曲；分生孢子椭圆形，大小（2.5-5.5）
×
（2-4） μm；分枝分生孢子偶有形成，长柱状或椭圆形，大小（6-12）
×
（2.5-4.5）μm（图2）。
20.（3）鉴定将菌株bf-f 培养于马铃薯葡萄糖液体培养基（pdb），在25℃、转速120 r/min摇床中震荡培养14天后，过滤收集菌丝。菌丝体总dna采用柱式真菌dna提取试剂盒提取。rdna的its部分区段pcr扩增采用通用引物its1（5
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tccgtaggtgaacctgcgg-3’） 和 its4（5
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tcctccgcttattgatatgc-3’）；ef1-α序列扩增上游引物（5
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cacactaacathgtngtcatt
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），下游引物（5
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acnaccatgggcttggtngg
ꢀ‑3’
）。反应体系为：2
×
easytaq pcr supermix 12 μl，20 μmol/l的正反引物各0 .5 μl，模板dna 0 .5 μl，用ddh2o定容至20 μl。pcr反应条件：98℃ 2 min，94℃ 40 s，50℃ 1min，68℃ 4 min，30个循环；72℃ 10 min。pcr产物纯化后直接用于测序，测序工作委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。通过clustalx 1 .81和bioedit v7 .0软件进行分析，实验获得的rdna的its部分区段序列（如seq id no.1所示）及ef1-α序列（如seq id no.2所示），在genbank中下载的最相似序列，使用m e g a 6 .0 6软件基于 k i m u r a双参数模型构建 n e i g h b o r
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j o i n i n g系统发育树 ，经bootstrap1000次循环检验系统树的可靠性。建立得到的系统发育树见图3。
21.用测序得到的its和ef1-α序列在genbank数据库中进行dna序列blast，结果显示与菌株bf-f菌株亲缘关系最近的是煤炱目 （ capnodiales）目下的枝孢霉（ cladosporiaceae ）科。把枝孢霉（cladosporiaceae）科下的已知种的代表菌株的its序列与菌株bf-f的its序列一起构建系统发育树，结果显示，菌株bf-f与枝孢霉（cladosporiaceae）科下枝孢菌（ cladosporium） 属的2个已知种以100％的支持率聚在一起，而且菌株bf-f与枝孢菌（cladosporium）属下的10个已知种聚在一个分枝上，由此可见菌株bf-f可能不是一个有别于cladosporium属的新属，但是由于该菌株分枝分生孢子偶有形成，长柱状或椭圆形，且鉴于目前所掌握的分类鉴定信息，将其鉴定为枝孢菌（cladosporium）属的一个未知种。
22.实施例2：一株植物促生真菌bf-f对海马齿的促生作用（1）植物材料的准备：在超净工作台内，用75%（v/v）乙醇消毒海马齿种子表面1 min，上下反复摇晃，然后用无菌水清洗上下摇晃10s；再用有效氯浓度为3% （v/v） naclo消毒，上下摇晃10 s吸出消毒水；加入3% （v/v）naclo消毒，上下反复摇晃6 min吸出消毒水，重复6次；用无菌水冲洗种子，上下摇晃1 min后吸出废液，重复3次；表面消毒好的海马齿种子播种于含有ms培养基的培养皿中，封口膜封好后放置在温度25 ℃，湿度70 %，光周期16 h光照 / 8 h黑暗的人工培养室中培养14-16天，将子叶完全展开的海马齿实生苗移栽至ms培养瓶中，每瓶4棵苗，在人工气候箱中培养2个月后用于接种。
23.（2）真菌接种至海马齿：在超净工作台内，将菌株bf-f接种于pda培养基上（pda组成成分为：6 g/l的马铃薯粉 20 g/l的葡萄糖 20 g/l的琼脂，ph为5.6-5.8之间）。每个培养皿接3个菌块，培养7天待菌落长大至35 mm；将活化好的bf-f真菌的菌块接种于步骤（1）中培养好的长势一致的海马齿组培苗海马齿根旁，每两株苗之间接种一个菌块，于25 ℃、光照强度180 μmol/(m2
·
s2)、光照时间为16 h/d的培养箱中共培养5周。每周测定海马齿的株高、叶数、根数、根长，结果见表1。接种菌株bf-f 5周后接种（bf-f组）与未接种（ck组）海马齿长势见图4。
24.表1接种菌株bf-f对盐生植物海马齿生长的影响表1的结果表明，相比于对照组(ck)，接种菌株bf-f5周后，海马齿植株株高显著提高了2.46cm，是未接种植株的两倍以上；接种第5周后与对照相比，叶片数、根数分别为对照组的1.7倍和3.7倍。说明接种菌株bf-f显著促进盐生植物海马齿生生根和生长。由图4也可知，接种菌株bf-f后的海马齿相比于未接种组的海马齿长势好，说明菌株bf-f对盐生植物海马齿具有显著的促生效果。
25.同时，测定了接种菌株bf-f30天后海马齿的总鲜重、地上鲜重及地下鲜重的变化情况，结果见表2。
26.表2接种菌株bf-f对盐生植物海马齿鲜重的影响表2的结果表明，相比于对照组(ck)，接种菌株bf-f30天后，海马齿总鲜重、地上鲜重及地下鲜重均显著增加，其中加菌株bf-f处理比对照ck总鲜重增加了5.3倍，地上鲜重增加4.5倍，地下鲜重增加7.2倍。说明本发明分离的真菌bf-f具有促进盐生植物海马齿生长的作用。
27.（3）bf-f菌株接种至室外：在温室穴盘内移栽长势一致的海马齿苗，分为对照组ck、处理组bf-f，处理组中接种bf-f菌株，培养1个月后，可以观察到接种bf-f的海马齿苗长势明显优于未接种苗（图5），约有未接种苗的两倍大，株高、根长和根数都显著高于未接种苗。
28.实施例3菌株bf-f对双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻的接种效果a.野生型拟南芥植物材料的准备：在超净工作台内，75%(v/v)乙醇消毒野生型拟南芥种子表面1min，上下反复摇晃，然后用无菌水清洗上下摇晃10s；再用0.05%(v/v)曲拉消毒并上下摇晃10s吸出消毒水，重复2次；用无菌水冲洗种子，上下摇晃1min后吸出废液，重复3次；表面消毒好的野生型拟南芥种子播种于含有ms（添加1wt%的蔗糖和0.8wt%的琼脂）培养基的培养皿中，封口膜封好后放置在在黑暗中冷处理3天后，在22℃条件下充分孵育6h光照(100μmol/m-2
/s-1
)萌发待用。
29.野生型水稻tp309植物材料的准备：用75%（v/v）乙醇消毒野生型拟南芥表面1min，上下反复摇晃，然后用无菌水清洗上下摇晃10s；再用有效氯浓度为3%（v/v）naclo消毒，上下摇晃10s吸出消毒水；加入3%（v/v）naclo消毒，上下反复摇晃6min吸出消毒
水，重复6次；用无菌水冲洗水稻种子，上下摇晃1 min后吸出废液，重复3次；表面消毒好的野生型水稻tp309种子播种于含有ms培养基的培养皿中，封口膜封好后放置在温度25 ℃，湿度70 %，光周期16 h光照 / 8 h黑暗的人工培养室中培养1周，将子叶完全展开的野生型水稻tp309实生苗移栽至ms培养瓶中，每瓶2棵苗，在人工气候箱中培养待用。
30.同实施例2将活化好的真菌bf-f的菌块接种至长势一致的野生型拟南芥和野生型水稻tp309 无菌播种苗的根系周围，其中双子叶模式植物拟南芥与真菌接于培养皿中，水稻tp309 与真菌接于组培瓶内，接种后将植物培养于温度25℃、光照强度180 μmol/(m2
·
s2)、光照时间为16 h/d的培养箱中，共培养15-28天；其中野生型拟南芥培养15天，野生型水稻tp309培养28天后接种苗（bf-f组）与未接种苗（ck组）拟南芥和水稻长势见图6，生长情况见表3。
31.表3接种菌株bf-f 对双子叶模式植物拟南芥和单子叶植物水稻生长的影响由表3可知，相比于对照组(ck)，双子叶模式植物拟南芥在接种菌株bf-f 15天后，野生型拟南芥苗叶数、叶长、根数均有显著生长，其中叶片数翻倍，根数增加了近9倍。野生型水稻tp309 接种4周同样显现出一定的生长优势，相比于对照ck，接种bf-f菌株后，野生型水稻tp309 叶片数翻倍，根数增加近4倍，分蘖数增加近5倍，野生型水稻tp309植株整体生物量均显著性提高。说明菌株bf-f对野生型拟南芥和野生型水稻tp309均具有促进生长的作用。由图6可知，接种菌株bf-f后的野生型拟南芥和野生型水稻tp309相比于未接种组的野生型拟南芥和野生型水稻tp309长势好，说明菌株bf-f对单子叶模式植物拟南芥和双子叶模式植物水稻均具有促生效果。
32.接种菌株bf-f 4周后测定野生型水稻tp309 的总鲜重、地上鲜重及地下鲜重。结果见表4。
33.表4 接种菌株bf-f 对双子叶模式植物拟南芥和单子叶植物水稻生物量的影响由上表4可知，相比于对照组(ck)，野生型水稻tp309 组培苗接种菌株bf-f 4周后，总鲜重、地上鲜重及地下鲜重均显著增加，其中加菌株bf-f处理比对照ck总鲜重增加了5.4倍，地上鲜重增加5.3倍，地下鲜重增加5.2倍。说明本发明的海马齿促生真菌具有促进野生型水稻tp309 生长的作用。
34.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。